瓜石湯聯(lián)合當(dāng)歸芍藥散對(duì)多囊卵巢綜合征合并胰島素抵抗小鼠的影響

鄭鳳雀 林佳靜 劉 欣 楊煒煒 陳賽瓊 蘇汝旺 何 萍 李晶晶

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院婦科,柳州,545007; 2 柳州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,柳州,545026; 3 柳州市婦幼保健院婦科,柳州,545001)

多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是常見(jiàn)的一種婦科內(nèi)分泌疾病,在育齡期女性中發(fā)病率為6%～10%[1],常表現(xiàn)為月經(jīng)周期不規(guī)律、排卵障礙、高雄激素血癥、胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)等癥狀[2]。PCOS發(fā)病機(jī)制尚未明確,研究表明44%～70%的PCOS患者合并IR,以IR為中心的代謝紊亂是PCOS患者重要的病理生理改變[3]。POCS與輕度慢性炎癥密切相關(guān),并且這種慢性炎癥狀態(tài)因合并IR而加重[4]。瓜石湯出自劉奉五先生的經(jīng)典藥方,在治療月經(jīng)病中有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),在PCOS中也有較多報(bào)道。瓜石湯可調(diào)節(jié)卵巢激素水平,提高PCOS不孕患者的妊娠率[5]。當(dāng)歸芍藥散在婦科炎癥治療中得到廣泛應(yīng)用,其通過(guò)下調(diào)炎癥蛋白表達(dá)水平來(lái)改善內(nèi)膜炎癥[6]。目前暫無(wú)瓜石湯合當(dāng)歸芍藥散治療PCOS-IR的報(bào)道。本研究利用來(lái)曲唑聯(lián)合高脂飲食構(gòu)建PCOS-IR小鼠模型,并探討瓜石湯合當(dāng)歸芍藥散對(duì)小鼠性激素及內(nèi)膜炎癥介質(zhì)的影響,旨在為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)C57BL/6L雌性小鼠50只,體質(zhì)量20～25 g,8周齡,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(SCXK(湘)2019-0004),飼養(yǎng)于22 ℃恒溫條件下,06：00-20：00為光照周期持續(xù)約14 h,黑暗10 h,給予充足潔凈飼料和飲水。該研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：202207001)。

1.1.2 藥物 瓜石湯合當(dāng)歸芍藥散由瓜蔞15 g(批號(hào)：P220873)、石斛12 g(批號(hào)：P221108)、玄參10 g(批號(hào)：P220884)、麥冬10 g(批號(hào)：P220043)、生地黃12 g(批號(hào)：P220193)、瞿麥12 g(批號(hào)：P220313)、車(chē)前子10 g(批號(hào)：P220702)、益母草12 g(P221050)、黃連3 g(批號(hào)：P220373)、牛膝12 g(批號(hào)：P220701)、當(dāng)歸10 g(批號(hào)：P224001)、川芎6 g批號(hào)：P221583)、赤芍12 g(批號(hào)：220801)、茯苓20 g(批號(hào)：P220602)、澤瀉12 g(批號(hào)：P220106)、蒼術(shù)6 g(批號(hào)：P221466)、白術(shù)12 g(批號(hào)：P221943)組成,均購(gòu)自廣西仙茱中藥有限公司;來(lái)曲唑片(規(guī)格：2.5 mg/片,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào)：H19991001)。

1.1.3 試劑與儀器 小鼠卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)、黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)、睪酮(Testosterone,T)、胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號(hào)：E-EL-M0511c、E-EL-M3053c、E-OSEL-M0003、E-EL-M1382c)、小鼠白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α;TNF-α)ELISA試劑盒(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號(hào)：KE10003、KE10007、KE10002);TRIzol(Invitrogen,美國(guó),批號(hào)：15596026)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ThermoFisher,美國(guó),批號(hào)K1682)、SYBRGreen Mix(ThermoFisher,美國(guó),批號(hào)A25742);酶標(biāo)儀(ThermoFisher,美國(guó),型號(hào)：FC)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR,RT-qPCR)儀(ABI,美國(guó),型號(hào)：7500)、倒置顯微鏡(Nikon,日本,型號(hào)：TS-10F)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照簡(jiǎn)單隨機(jī)化原則,通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表將小鼠隨機(jī)抽取編號(hào),按1∶3的比例隨機(jī)分為對(duì)照組(13只)和造模小鼠(37只),對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng),不予以任何藥物干預(yù)。

1.2.2 給藥方法 模型組小鼠每天給予來(lái)曲唑1 mg/kg溶于1 mL1%的羧甲基纖維素鈉灌胃,同時(shí)給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料59.50%,豬油10%,蛋黃粉10%,蔗糖20%,膽酸鈉0.50%)喂養(yǎng)。每天給藥1次,連續(xù)給藥21 d。造模第15天開(kāi)始通過(guò)陰道涂片(瑞氏染色)觀察小鼠動(dòng)情周期連續(xù)10 d,動(dòng)情周期紊亂為PCOS模型成功。造模21 d后分別取5只對(duì)照組及模型組小鼠,眼眶取血后處死,采用血糖儀測(cè)小鼠空腹血糖,2 500 r/min離心時(shí)間15 min,離心半徑10 cm,收集血清,采用ELISA法,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定血清空腹胰島素的水平。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance,HOMA-IR),HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/L)/22.5。HOMA-IR>2.69提示IR模型成功。隨機(jī)挑選8只造模組小鼠作為模型組,8只作為中藥組。中藥組每天給予瓜石湯合當(dāng)歸芍藥散10 mL/kg,對(duì)照組和模型組小鼠給予等體積的純凈水,連續(xù)給藥21 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 性激素測(cè)定 給藥21 d后,在動(dòng)情間期,異氟烷麻醉小鼠,眼眶取血后處死,2 500 r/min,離心半徑10 cm,離心時(shí)間15 min,收集血清,-80 ℃保存;采用ELISA法,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定FSH、LH、T的水平。

1.2.3.2 內(nèi)膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的測(cè)定 采取ELISA法測(cè)定組織上清液的炎癥介質(zhì)。取下小鼠子宮,用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)沖洗組織以去除殘留的血液,剝離子宮內(nèi)膜組織,稱(chēng)取50 mg的組織,其余組織放入液氮保存,按組織重量(mg)：體積(μL)=1∶9的比例加入9倍體積的PBS,用組織勻漿器勻漿組織,3 000 r/min,離心半徑10 cm,離心時(shí)間10 min,收集組織上清,采用ELISA法,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.2.3.3 內(nèi)膜組織TNF-α、IL-1β、IL6 mRNA的測(cè)定 取上述液氮保存的小鼠子宮約20 mg,采用Trizol裂解法提取組織總RNA,用分光光度計(jì)評(píng)估RNA的質(zhì)量和總量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)分別去除DNA及逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Green法進(jìn)行RT-qPCR。GAPDH作為內(nèi)參。引物見(jiàn)表1。

表1 小鼠炎癥介質(zhì)和內(nèi)參的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCOS-IR模型成功的判斷

2.1.1 動(dòng)情周期 造模第15天開(kāi)始通過(guò)陰道涂片觀察小鼠動(dòng)情周期,對(duì)照組動(dòng)情周期存在,動(dòng)情前期以大量有核細(xì)胞為主,可見(jiàn)少量角化細(xì)胞,動(dòng)情期以大量角化上皮細(xì)胞為主,少量有核細(xì)胞,動(dòng)情后期可見(jiàn)角化上皮細(xì)胞、少量白細(xì)胞和有核細(xì)胞,動(dòng)情間期以大量白細(xì)胞為主;模型組動(dòng)情周期消失,大部分處于動(dòng)情間期,提示PCOS模型成功。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組和模型小鼠動(dòng)情周期(瑞氏染色,×200)

2.1.2 空腹血糖、空腹胰島素水平 造模21 d后對(duì)照組小鼠空腹血糖為(4.52±0.45)mmol/L,空腹胰島素為(7.12±2.11) mIU/L,模型組空腹血糖為(7.24±1.68)mmol/L,空腹胰島素為(39.65±6.27) mIU/L,對(duì)照組HOMA-IR均<2.69,而模型組均高于2.69,提示IR模型成功。

2.2 各組小鼠干預(yù)后性激素水平的變化 干預(yù)21 d后,3組小鼠FSH水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.666)。模型組LH、T、LH/FSH水平高于對(duì)照組,而中藥組LH、T、LH/FSH水平低于模型組(P=0.000)。見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠血清性激素水平

2.3 各組小鼠干預(yù)后TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá) 干預(yù)21 d后,RT-qPCR結(jié)果顯示模型組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平高于對(duì)照組,而中藥組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平低于模型組;模型組TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平高于對(duì)照組,而中藥組TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平低于模型組。見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠內(nèi)膜組織TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平

3 討論

PCOS是一種以促性腺激素分泌異常為特征的疾病,包括FSH、LH以及卵巢類(lèi)固醇激素分泌增加,并且與胰島素抵抗有關(guān)。胰島素刺激雄激素合成,增加LH作用[7]。IR和高雄激素血癥的治療改善了激素、代謝和生殖功能。PCOS的發(fā)病機(jī)制尚未明確,明確其發(fā)病機(jī)制,尋找個(gè)體化治療方案對(duì)該疾病診治有重要意義。本研究成功構(gòu)建PCOS-IR小鼠模型并給予瓜石湯合當(dāng)歸芍藥散治療,得到了較好的效果。

PCOS與慢性炎癥密切相關(guān)。PCOS的常見(jiàn)癥狀如高雄激素血癥、胰島素抵抗、肥胖是引起炎癥反應(yīng)的因素。肥胖是一個(gè)慢性炎癥,其特征是具有較高的炎癥介質(zhì)、趨化因子和氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平[8]。雄激素可以刺激前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化,促進(jìn)肥胖的發(fā)展。TNF-α是一種炎癥介質(zhì),由顆粒-黃體細(xì)胞、卵巢巨噬細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌。研究發(fā)現(xiàn),TNF-α可能與PCOS的IR和雄激素過(guò)量有關(guān),其在肥胖和IR模型中過(guò)度表達(dá),干擾胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)IR[9]。有研究已將PCOS患者血清TNF-α水平變化作為治療效果觀察指標(biāo)[10],因此探索TNF-α與PCOS之間的聯(lián)系對(duì)于PCOS的診治具有重要意義。IL-6是由各種細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)分泌細(xì)胞因子,如單核細(xì)胞和脂肪組織細(xì)胞。有研究顯示IL-6在PCOS女性中較高,并且與體脂百分比增加有直接關(guān)系[11-13]。PCOS女性血漿TNF-α和IL-6水平升高反映了一種慢性炎癥,可能是通過(guò)降低脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的表達(dá),參與了IR的發(fā)展[14]。IL-1β是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì),參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡。CAI等[15]分析了PCOS女性和健康婦女血清,結(jié)果顯示,PCOS女性血清IL-1β水平均高于健康對(duì)照組。本研究中構(gòu)建的小鼠PCOS-IR模型的內(nèi)膜組織TNF-α、IL-6、IL-1β高于對(duì)照組小鼠,支持PCOS-IR與炎癥相關(guān)這一觀點(diǎn)。

PCOS的治療方式包括如改變生活方式、促排卵、高睪酮治療、胰島素增敏劑、補(bǔ)充肌醇、葉酸和維生素D、輔助生殖技術(shù)治療和手術(shù)治療[16]。由于藥物的不良反應(yīng),對(duì)PCOS患者更傾向于使用天然抗氧化劑、抗炎藥調(diào)節(jié)代謝、高胰島素血癥和高血脂[17]。WANG等[18]的一項(xiàng)Meta分析表明目前沒(méi)有足夠的證據(jù)證明中西醫(yī)結(jié)合治療PCOS的療效優(yōu)于單純西藥治療。中醫(yī)、多靶向治療、抗炎、抗氧化藥物以及生活方式的改變可以通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)使PCOS女性受益[19]。中藥通過(guò)促甾體激素反應(yīng)來(lái)表達(dá)雌激素受體蛋白,從而減少雄激素和增加葡萄糖攝取,改善PCOS患者的癥狀。瓜石湯作為一個(gè)經(jīng)典藥方,有滋補(bǔ)腎陰及清熱活血功效。其能夠調(diào)節(jié)月經(jīng)、穩(wěn)定體內(nèi)性激素水平、改善子宮和卵巢的血液循環(huán),從而調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌。除此之外,還具有抗炎、抑菌功效。研究發(fā)現(xiàn)瓜石湯可改善非肥胖型PCOS患者LH、T、LH/FSH比值等指標(biāo)[20]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)瓜石湯可降低血清LH、T、LH/FSH比值及胰島素水平,并且體質(zhì)量及體質(zhì)量指數(shù)有下降趨勢(shì)[21]。當(dāng)歸芍藥散有補(bǔ)血活血、清熱解毒、消腫排膿、健脾祛濕功效,在改善婦科炎癥方面也得到廣泛應(yīng)用。研究證實(shí)當(dāng)歸芍藥散通過(guò)影響大鼠慢性子宮內(nèi)膜炎模型的炎癥蛋白表達(dá)及炎癥通路來(lái)改善大鼠子宮內(nèi)膜炎癥[6,22]。本研究利用瓜石湯聯(lián)合當(dāng)歸芍藥散治療PCOS-IR小鼠,認(rèn)為瓜石湯聯(lián)合當(dāng)歸芍藥散可降低血清LH、T,通過(guò)降低子宮內(nèi)膜TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)來(lái)改善子宮內(nèi)膜炎癥。

綜上所述,本研究認(rèn)為PCOS-IR與TNF-α、IL-1β、IL-6的升高有關(guān),是一種慢性炎癥性疾病。瓜石湯聯(lián)合當(dāng)歸芍藥散可調(diào)節(jié)性激素,改善高雄激素血癥,同時(shí)可降低子宮內(nèi)膜TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá),改善內(nèi)膜炎癥狀態(tài)。但本研究存在一定的局限性,未進(jìn)行藥物治療后小鼠生育能力的評(píng)估。

利益沖突聲明：本文所有作者聲明沒(méi)有利益沖突。