用于分離單糖與寡糖的親水色譜材料制備及應(yīng)用進(jìn)展

張丹丹，矯芮文，米春孝，陳 菊，李 想,2,3，汪秋寬,2,3，任丹丹,2,3，何云海,2,3，武 龍,2,3，周 慧,2,3,*

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.國(guó)家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧 大連 116023；3.遼寧水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

在食品科學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域中，糖類(lèi)化合物起著不可或缺的作用。按組成糖類(lèi)化合物可分為3 類(lèi)：?jiǎn)翁?、寡糖和多糖。單糖是不能進(jìn)一步水解的多羥基醛或多羥基酮，為最小的糖類(lèi)分子，其中L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露糖和D-核糖等單糖已廣泛用作食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品[1]。寡糖是由2～10 個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵組合而成的低聚物[2]，具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒等多種生物活性[3]，是一種新型功能性糖源。目前，自然界中主要存在的單糖是戊糖和己糖，前者大都以形成多糖的成分存在，后者則以游離或結(jié)合的形式存在；自然界中存在的天然寡糖很少，僅有極少數(shù)的植物含有天然的功能性寡糖[4-5]。更多的單糖、寡糖是以多糖為原料通過(guò)化學(xué)降解或酶降解，然后分離制得。因此，無(wú)論是天然存在的單糖和寡糖，還是通過(guò)降解獲得的單糖和寡糖，都需要分離純化。

自20 世紀(jì)70 年代起，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法因其靈敏度高、選擇性好、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于復(fù)雜化合物的分離和分析[6-7]。根據(jù)固定相與分析物之間的相互作用，分離模式可分為離子色譜（ion chromatography，IC）、親水作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）、反相液相色譜（reversed-phase liquid chromatography，RPLC）和正相液相色譜（normal-phase liquid chromatography，NPLC）等。IC主要包括3 種色譜模式，其中應(yīng)用最廣泛的是離子交換色譜（ion-exchange chromatography，IEC），該方法主要用來(lái)分離含有電解質(zhì)的混合物，其固定相通常采用具有離子交換功能的不溶性高分子化合物[8]；RPLC通常用來(lái)分離中低極性和非極性的化合物，該固定相通常是以硅膠為基質(zhì)，表面接枝極性較弱的官能團(tuán)[9]；NPLC的固定相一般采用硅膠、極性基團(tuán)鍵合的硅膠和氧化鋁等，分離對(duì)象為中等極性和較高極性的化合物。

單糖和寡糖分子中的極性基團(tuán)與RPLC固定相之間缺乏偶極矩作用，樣品難以或無(wú)法被保留[10]，單糖和寡糖難溶于典型的NPLC流動(dòng)相，因此RPLC和NPLC不適用于分離糖類(lèi)化合物。糖類(lèi)化合物一般呈弱酸性，在堿性流動(dòng)相中帶負(fù)電荷，可以通過(guò)IC實(shí)現(xiàn)分離。Li Yuqing等[11]采用新型IEC固定相在7 min內(nèi)完全分離了6 種單糖，且分離度超過(guò)1.56，柱效高達(dá)20 400～27 300 N/m。曹莉[12]采用商用CIC-300型IEC色譜柱分離了8 種單糖，回歸率都大于0.996。然而，大部分糖類(lèi)化合物具有相似的結(jié)構(gòu)單元或分子結(jié)構(gòu)，且保留性極弱，只有擁有足夠容量和高選擇性的IC固定相才能實(shí)現(xiàn)糖類(lèi)化合物的分離[13]。Alpert等[14]于1990年提出了HILIC并闡述了其保留機(jī)理，圖1顯示了HILIC與其他3 種色譜的主要特點(diǎn)。近幾十年來(lái)，將HILIC應(yīng)用于糖類(lèi)等強(qiáng)極性化合物的分離一直是色譜領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。相比于RPLC、NPLC，HILIC的流動(dòng)相和固定相均采用強(qiáng)極性物質(zhì)，這樣既可以溶解又可以保留極性分析物[15]，成為分離單糖和寡糖的重要手段。HILIC固定相通常采用裸硅膠或接枝極性官能團(tuán)的硅膠[16]，其中，后者的應(yīng)用更為廣泛。目前已發(fā)展了氨基鍵合固定相、酰胺類(lèi)鍵合固定相、糖類(lèi)鍵合固定相、兩性離子鍵合固定相等數(shù)種HILIC固定相[17]。

圖1 HILIC和其他3 種液相色譜的特征[18]Fig.1 Characteristics of HILIC and three other kinds of liquid chromatography[18]

本文對(duì)用于分離單糖和寡糖的HILIC固定相進(jìn)行綜述，并分析影響HILIC行為的主要指標(biāo)，以期為單糖和寡糖的分離提供參考。

1 HILIC固定相的種類(lèi)及制備方法

1.1 氨基鍵合固定相

氨基鍵合固定相主要通過(guò)氨基基團(tuán)直接鍵合到硅膠表面制得，是最早用于HILIC模式的極性固定相。其中氨丙基固定相為最經(jīng)典的氨基固定相[19]，結(jié)構(gòu)如圖2所示。該固定相的分離機(jī)制主要是吸附與分配，根據(jù)不同糖類(lèi)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同實(shí)現(xiàn)分離。

圖2 氨丙基固定相的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of aminopropyl stationary phase

1975年Linden等[20]利用氨基修飾硅膠固定相成功分離單糖（葡萄糖、果糖）和寡糖（蔗糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗果三糖以及棉子糖）。此類(lèi)固定相制備簡(jiǎn)單、分離范圍較寬，但氨基呈弱堿性，氨基柱與酸性物質(zhì)有較強(qiáng)結(jié)合能力，易與強(qiáng)酸性物質(zhì)產(chǎn)生不可逆吸附；同時(shí)氨基官能團(tuán)反應(yīng)活性高、易與還原糖中的醛基反應(yīng)生成席夫堿，從而改變固定相與分析物的性質(zhì)，導(dǎo)致氨基鍵合固定相穩(wěn)定性差、壽命短、色譜峰保留時(shí)間長(zhǎng)。

為了解決傳統(tǒng)氨基固定相反應(yīng)活性高的問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了改進(jìn)的鍵合氨基固定相。薛昆鵬等[21]將硅烷化試劑（3-氨丙基二異丙基乙氧基硅烷）鍵合到硅膠表面，合成了具有異丙基側(cè)鏈的新型氨基鍵合硅膠固定相，使氨基固定相不僅含有氨丙基官能團(tuán)，還增加了異丙基官能團(tuán)。其中，異丙基官能團(tuán)主要起到保護(hù)氨基的作用，增強(qiáng)氨基在硅膠表面的穩(wěn)定性，從而避免氨基在硅膠表面脫落。因此該新型固定相具有更高的穩(wěn)定性和更好的耐水性，能夠有效地屏蔽氨基對(duì)分析物的吸附作用，減少拖尾現(xiàn)象。為了測(cè)定該固定相對(duì)糖類(lèi)化合物保留的影響，該學(xué)者進(jìn)一步研究了乳糖和蔗糖的色譜保留行為。結(jié)果表明，乳糖和蔗糖在14 min內(nèi)完全實(shí)現(xiàn)了基線分離，分離度高達(dá)3.03，而且峰形正常、無(wú)拖尾現(xiàn)象。

咪唑類(lèi)化合物作為離子液體前體化合物，具有蒸氣壓低、熱穩(wěn)定性高和易溶于水的特點(diǎn)。咪唑含有定域?qū)Φ牡h(huán)原子，可以與氨基形成配體。近年來(lái)咪唑離子液體與氨基聯(lián)用廣泛應(yīng)用于HILIC固定相的制備，可用于分離多種復(fù)雜分析物。劉士佳等[22]已證實(shí)咪唑嵌合的氨基親水固定相不僅可以實(shí)現(xiàn)極性化合物和異構(gòu)體的有效分離，且結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)的氨基固定相。Song Liujun等[23]將咪唑離子液體衍生的碳點(diǎn)（imidazolium ionic liquidsderived carbon dots，ImCDs）包覆在氨基硅膠表面制備了咪唑離子液體碳點(diǎn)改性氨基固定相（圖3）。該固定相同時(shí)提供了咪唑、羥基和羧酸等豐富的官能團(tuán)，提高了對(duì)親水化合物的分離能力。在分離單糖（脫氧核糖、核糖、來(lái)蘇糖、阿拉伯糖、果糖）和二糖（蔗糖、乳糖）時(shí)，所有糖類(lèi)均實(shí)現(xiàn)了基線分離。該色譜柱不僅解決了未經(jīng)咪唑改性的氨基柱分離不完全和峰形過(guò)寬的問(wèn)題，還縮短了分離時(shí)間。同時(shí)，Guo Dandan等[24]利用咪唑類(lèi)化合物易與鹵代烴實(shí)現(xiàn)一步反應(yīng)的特點(diǎn)，直接將咪唑基團(tuán)引入3-氯丙基固定相的表面，隨后通過(guò)離子交換反應(yīng)制備得到3 種接枝不同陰離子的固定相（SilprAprIm Cl、SilprAprIm BF4、SilprAprIm Tf2N）（圖4）。其中，BF4-離子對(duì)比Cl-和Tf2N-離子具有更好的分離效果和更長(zhǎng)的保留時(shí)間。此外，由于咪唑基團(tuán)的引入，該固定相與氨丙基硅膠柱相比，除了具有吸附和分配作用，還增加了靜電相互作用和偶極-偶極相互作用，因此在更短時(shí)間內(nèi)分離出8 種糖類(lèi)混合物，且成功分離出寡果糖中的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。離子液體改性后的氨基鍵合固定克服了傳統(tǒng)氨基固定相容易吸附部分糖（如阿拉伯糖和半乳糖）和存在拖尾的現(xiàn)象等缺點(diǎn)，耐用性也大大增強(qiáng)。

圖3 Sil-ImCDs的制備示意圖[23]Fig.3 Schematic diagram of Sil-ImCD synthesis process[23]

圖4 3 種咪唑嵌合氨基鍵合固定相的結(jié)構(gòu)[24]Fig.4 Structures of three imidazolium-bridging amino-bonded stationary phases[24]

1.2 酰胺類(lèi)鍵合固定相

酰胺鍵合固定相是在硅膠或聚合物微球上接枝氨基甲?；蝓０坊?，基于氫鍵吸附原理和親水分配機(jī)理實(shí)現(xiàn)糖類(lèi)等極性化合物的分離。固定相中的親水基團(tuán)與糖分子之間形成的氫鍵越多，吸附則越強(qiáng)。酰胺鍵合固定相的傳統(tǒng)制備方法（兩步合成法）如圖5所示，首先將硅膠表面氨基化，然后酰鹵與硅膠表面的氨基反應(yīng)即可得到含酰胺官能團(tuán)的色譜固定相[25]。但是該合成路線制備的固定相表面鍵合鏈不均一，而且會(huì)產(chǎn)生酯和氨基等副產(chǎn)物。此外，該固定相表面的氨基容易與酸性溶質(zhì)發(fā)生離子交換反應(yīng)，造成柱效降低和峰形的拖尾。

圖5 酰胺鍵合固定相的傳統(tǒng)制備方法[25]Fig.5 Traditional preparation process of amide bonded stationary phase[25]

N-異丙基丙烯酰胺（N-isopropyl acrylamide，NIPAM）是一種高極性聚合物，具有很好的親水性和熱響應(yīng)特性，易通過(guò)溫控分離技術(shù)制備硅膠固定相[26]。2020年，F(xiàn)an Fangbin等[27]采用水熱法，利用加成反應(yīng)在包覆L-半胱氨酸的二氧化硅球表面接枝NIPAM，制得含有羧酸、羥基和酰胺官能團(tuán)的酰胺固定相（圖6）。在該固定相條件下，以乙腈、水和乙酸銨為流動(dòng)相，10 種極性不同的單糖（核糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖）和寡糖（蔗糖、麥芽糖、乳糖、松三糖、棉子糖）標(biāo)準(zhǔn)品在60 min內(nèi)分離完全，異構(gòu)體（葡萄糖和果糖）的分離結(jié)果證明了此酰胺固定相具有結(jié)構(gòu)選擇性。其中，松三糖的實(shí)際塔板數(shù)可達(dá)到45 700 板/m，顯著高于同條件下的裸硅膠柱。該柱子還具有良好的穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)品的峰形和分辨率在連續(xù)3 d檢測(cè)下仍基本保持不變。此外，聚丙烯酰胺因其優(yōu)良的親水性，在酰胺類(lèi)HILIC固定相中已得到較多應(yīng)用[28]。在堿性溶質(zhì)的保留方面，聚丙烯酰胺固定相表現(xiàn)出了比純硅膠柱更好的分離性能和重現(xiàn)性。Cai Jianfeng等[29]通過(guò)引發(fā)劑偶氮二異丁腈將聚丙烯酰胺固定到硅膠表面，合成了含有氨基、羥基和酰胺官能團(tuán)的聚丙烯酰胺型色譜固定相。與商用X-Amide酰胺柱相比，該固定相對(duì)低聚木糖、低聚果糖和低聚殼寡糖表現(xiàn)出更顯著的分離效果，柱效高達(dá)121 000 N/m。在該固定相條件下，以乙醇-水體系為流動(dòng)相替代有毒的乙腈-水體系，該方法使整個(gè)分離過(guò)程更安全，且有效控制了成本。楊鐸等[30]使用丙烯胺修飾硅膠，以偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，通過(guò)巰基-烯烴點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將親水的聚丙烯酰胺固定在烯基修飾的二氧化硅顆粒上，制備了含有酰胺和氨基親水性官能團(tuán)的聚丙烯酰胺固定相。該相僅在8 min內(nèi)便實(shí)現(xiàn)了不同聚合度（2～7）β-1,4-低聚半乳糖的分離，分離度大于1.5，且無(wú)拖尾現(xiàn)象，展現(xiàn)了該固定相在寡糖等極性化合物分離中的可行性和高效性。

圖6 Cys-Si-NIPAM的合成流程[27]Fig.6 Synthesis process of Cys-Si-NIPAM[27]

酰胺鍵合固定相的親水性官能團(tuán)較多、親水性強(qiáng)，適用于分離強(qiáng)極性化合物；由于酰胺官能團(tuán)排斥帶正電荷的堿性溶質(zhì)，在酸性或中性環(huán)境下會(huì)阻礙溶質(zhì)與硅醇基間的離子交換反應(yīng)，因此酰胺類(lèi)硅膠色譜柱不易產(chǎn)生不可逆吸附、穩(wěn)定性更好、使用壽命更長(zhǎng)[31]；此外，酰胺鍵合固定相的pH值適用范圍較廣，在典型的HILIC流動(dòng)相pH值范圍內(nèi)不會(huì)發(fā)生離子化，使其對(duì)溶質(zhì)的保留效果受離子交換作用的影響很小，而且酰胺官能團(tuán)可與硅膠表面的水合層作用，從而改善堿性溶質(zhì)的選擇性[32]。

1.3 糖類(lèi)鍵合固定相

糖類(lèi)化合物表面暴露的高密度羥基基團(tuán)使其具有良好的親水性。糖類(lèi)鍵合固定相上羥基可與極性分子等形成很強(qiáng)的氫鍵作用，能夠吸附流動(dòng)相中的水分子，在固定相表面形成一層水化膜，從而對(duì)單糖、寡糖等極性化合物產(chǎn)生極強(qiáng)的保留作用。

疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)因靈敏度高、特異性好和穩(wěn)定性強(qiáng)等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已成為點(diǎn)擊反應(yīng)中應(yīng)用最廣泛且經(jīng)典的反應(yīng)[33]。通過(guò)疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)制備糖類(lèi)固定相時(shí)，首先要實(shí)現(xiàn)糖類(lèi)的炔烴化和硅膠的疊氮化，然后在Cu（I）的催化下，糖類(lèi)化合物中的炔烴與硅膠中疊氮基的不飽和鍵發(fā)生1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)，即可將糖類(lèi)化合物引入二氧化硅表面，制得糖類(lèi)固定相[34-35]。早在2009年，F(xiàn)u Qing等[36]采用此方法通過(guò)麥芽糖的炔烴化（圖7a）制備了麥芽糖鍵合的固定相（圖7b）。該色譜柱通過(guò)糖和麥芽糖之間的直接氫鍵作用和表面吸附機(jī)制對(duì)糖進(jìn)行保留，可在15 min內(nèi)完成7 種糖類(lèi)混合物（山梨糖、葡萄糖、松二糖、纖維二糖、海藻糖、松三糖、棉子糖）的基線分離，對(duì)糖類(lèi)有著優(yōu)異的選擇能力。近年來(lái)，親和開(kāi)環(huán)反應(yīng)在合成色譜材料中也得到較多應(yīng)用，Rathnasekara等[37]以γ-環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷為硅烷偶聯(lián)劑，將裸硅膠轉(zhuǎn)化為環(huán)氧活化硅膠，在三氟化硼乙醚絡(luò)合物的催化下，通過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng)分別將麥芽糖和山梨醇接枝到環(huán)氧樹(shù)脂改性的硅膠表面，即通過(guò)兩步法得到了均含有羥基官能團(tuán)的兩種糖類(lèi)固定相；這兩種固定相對(duì)極性溶質(zhì)（如衍生的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖）表現(xiàn)出很好的分離效果。其中麥芽糖固定相由于具有更多的羥基官能團(tuán)，因而極性分析物在麥芽糖柱固定相上具有更高的分離效率和保留值。

圖7 炔烴化麥芽糖的合成路線（a）和炔烴化麥芽糖在二氧化硅表面的固定化（b）[36]Fig.7 Synthesis route of alkynylated maltose (a) and immobilization of alkynylated maltose on the silica surface (b)[36]

環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）是具有空腔結(jié)構(gòu)的環(huán)狀低聚糖（圖8）[38]，特殊的分子結(jié)構(gòu)使其能夠選擇性地與溶質(zhì)形成包合物；此外，β-CD外側(cè)結(jié)構(gòu)中的伯羥基基團(tuán)賦予了其親水特性，提高了水溶性差的有機(jī)化合物的溶解度[39]，使其可制備得到具有HILIC特性的固定相，用于分離極性及親水性物質(zhì)。李強(qiáng)等[40]首先通過(guò)酰胺鍵將氧化石墨烯鍵合到氨基硅膠上，隨后通過(guò)氫鍵作用將β-CD化學(xué)鍵合到氧化石墨烯上，制備了基于氧化石墨烯的環(huán)糊精型固定相；該固定相存在大量羥基和醛基等含氧的極性官能團(tuán)，具有典型的親水色譜特征。將該固定相用于胸腺嘧啶、胞嘧啶、肌苷和鳥(niǎo)苷的分析發(fā)現(xiàn)，這些分析物在40 min內(nèi)全部得到了分離。除此之外，該固定相還可用于分離手性化合物，具有手性色譜和HILIC兩種分離模式，有效擴(kuò)大了分析樣品的范圍。

圖8 β-環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)[38]Fig.8 Structure of β-cyclodextrin[38]

糖類(lèi)固定相含有豐富的羥基，能夠在空間上形成多位點(diǎn)的氫鍵作用[41]，因而對(duì)糖類(lèi)有著較強(qiáng)的識(shí)別和保留能力。然而，該固定相制備流程較為復(fù)雜，部分糖分子需要通過(guò)特定基團(tuán)修飾后，方能與二氧化硅表面的官能團(tuán)反應(yīng)[42]；此外，該固定相適用范圍窄，更適合分離單糖等結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子質(zhì)量小的糖類(lèi)，對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜和分子質(zhì)量大的糖類(lèi)分離效果較差。

1.4 兩性離子鍵合固定相

兩性離子鍵合固定相表面或內(nèi)部含有數(shù)目相同的正負(fù)電荷，整體呈現(xiàn)電中性[43]；理想情況下，兩性離子固定相含有等量的強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性基團(tuán)。該固定相上極性較強(qiáng)的活性基團(tuán)能通過(guò)氫鍵作用形成牢固的吸附水層，使親水性大大增加。因此，該固定相主要通過(guò)離子交換和親水混合作用分離糖類(lèi)等極性化合物。

兩性離子固定相的鍵合方法主要有直接合成法和間接合成法。直接法主要是將化合物（大多采用1,3-丙磺酸內(nèi)酯）和含叔胺基團(tuán)的單體反應(yīng)得到兩性離子單體，然后通過(guò)自由基聚合反應(yīng)將兩性離子單體接枝到基質(zhì)上制備得出（圖9a）[44]；間接合成法是先在基質(zhì)上聚合一個(gè)連接臂，再將含兩性離子基團(tuán)的化合物接枝到基質(zhì)的連接臂上（圖9b）[45]，該方法比直接合成法過(guò)程簡(jiǎn)易可控，但兩性離子的利用率較低。

圖9 直接合成法（a）和間接合成法（b）制備兩性離子固定相[44-45]Fig.9 Preparation of zwitterionic stationary phase by direct (a) and indirect (b) synthesis[44-45]

根據(jù)功能基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)，兩性離子固定相的種類(lèi)主要分為甜菜堿型、離子液體型、氨基酸型和磷酰膽堿型[46]，這4 種類(lèi)型固定相的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如表1所示。

表1 兩性離子固定相的種類(lèi)Table 1 Types of zwitterionic stationary phases

其中，甜菜堿型和磷酰膽堿型是最具代表性的兩性離子固定相，此類(lèi)兩性離子固定相的制備方法是基于可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合法[50]和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法（atom transfer radical polymerization，ATRP）[51]。甜菜堿還可分為羧基甜菜堿[52]、磺基甜菜堿[1]和磷酸脂甜菜堿[53]。磺基甜菜堿固定相是最早應(yīng)用于親水色譜的甜菜堿型兩性離子固定相。2021年，Liu Xuefang等[44]以1,3-丙磺酸內(nèi)酯和N-[3-(二甲氨基)丙基]丙烯酰胺為原料，通過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng)合成了丙烯酰胺型磺基甜菜堿單體，再通過(guò)該單體和聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-二乙烯基苯)的側(cè)雙鍵共聚反應(yīng)，制備了一種基于聚合物的磺基甜菜堿兩性離子固定相。該固定相具有磺基甜菜堿型兩性離子官能團(tuán)，對(duì)單糖、二糖和三糖等8 種寡糖全部實(shí)現(xiàn)了分離，顯示出其對(duì)強(qiáng)極性分析物良好的分離能力。此外，該固定相還能夠精確分離核糖、木糖、葡萄糖的α-和β-異構(gòu)體，彌補(bǔ)了HILIC在分離同分異構(gòu)體糖中的不足。

咪唑離子液體由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性和物理化學(xué)性質(zhì)，在兩性離子鍵合固定相領(lǐng)域也得到了應(yīng)用。楊晨曦等[48]利用3-二甲胺基丙胺和乙二醛的反應(yīng)生成咪唑單體，將其接枝到3-氯丙基硅膠制備了咪唑型離子液體硅膠，再與N,N-二甲基甲酰胺和1,3-丙烷磺內(nèi)酯反應(yīng)，得到了含有叔胺基和磺基甜菜堿型兩性離子官能團(tuán)的離子液體型兩性離子色譜固定相，其中咪唑基團(tuán)發(fā)揮親水分離作用，兩性離子官能團(tuán)發(fā)揮離子交換分離作用。通過(guò)對(duì)多種糖類(lèi)化合物進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)該色譜材料對(duì)單糖、二糖和三糖具有良好的分離效果。

兩性離子固定相因帶有相同物質(zhì)的量的相反電荷基團(tuán)，不易產(chǎn)生自發(fā)聚合，而且固定相表面形成的吸附水層可以避免硅羥基的死吸附[54]。此外，該色譜固定相制備簡(jiǎn)單、易改性，具有生物相容性高、抗污染、親水性強(qiáng)、pH值耐受范圍較寬、分離效率高、能夠改善同分異構(gòu)體的分離選擇性以及與質(zhì)譜有良好的兼容性等優(yōu)點(diǎn)[55-58]。不過(guò)目前該色譜材料種類(lèi)較少，但由于其顯著的優(yōu)點(diǎn)，兩性離子固定相已成為了HILIC前沿的研究熱點(diǎn)，大量研究者專(zhuān)注于研制新型兩性離子色譜分離材料，極大拓展了該固定相在HILIC領(lǐng)域的應(yīng)用。

1.5 混合模式固定相

混合模式色譜（mixed-mode chromatography，MMC）是一種固定相同時(shí)通過(guò)多種作用力（通常為2～3 種）實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)保留和分離的色譜方法[59]。1986年，Halfpenny等[60]首次提出混合模式色譜的概念，并使用反相和離子交換模式分離了核苷、堿基等極性化合物。適用于單糖/寡糖分離的MMC模式主要有離子交換/親水型混合色譜（IEC/HILIC）、親水/疏水型混合色譜（HILIC/RPLC）和離子交換/親水/疏水型混合色譜（IEC/HILIC/RPLC）。

IEC/HILIC型混合色譜是將親水基團(tuán)和具有離子交換作用的基團(tuán)通過(guò)ATRP和點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)鍵合到色譜材料表面，利用溶質(zhì)和固定相之間的親水作用和電荷作用達(dá)到分離糖類(lèi)化合物的目的。在該模式下，分離樣品先根據(jù)離子作用力的強(qiáng)弱進(jìn)行洗脫，對(duì)于含有相同電荷的樣品再通過(guò)親水作用力的大小進(jìn)行二次洗脫。因此，相比于單一的IEC和HILIC，該混合模式有效提高了分離選擇性和靈活性。婁旭華等[61]利用親核取代反應(yīng)將聚乙烯馬來(lái)酸酐鍵合到氨基硅膠表面，再將殘余馬來(lái)酸酐水解，制備了IEC/HILIC型色譜固定相，其中氨基親水官能團(tuán)提供HILIC模式，水解得到的羧基官能團(tuán)則提供IEC模式；將該固定相用于分離單糖混合物、核苷和核酸堿基等極性化合物時(shí)，8 種單糖在氫鍵、離子交換和親水等多種作用力下，僅在12 min內(nèi)就實(shí)現(xiàn)了完全分離。IEC/HILIC型混合色譜將離子交換作用和親水色譜的吸附、分配作用結(jié)合，擴(kuò)大了分析物的范圍，彌補(bǔ)了單一色譜模式在分離中的不足。目前該混合模式色譜固定相多用于分離多肽和蛋白質(zhì)，在糖類(lèi)分離中仍有較大的發(fā)展空間。

HILIC/RPLC型混合模式色譜是將親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)同時(shí)連接到色譜固定相表面，同時(shí)具有親水與疏水兩種保留機(jī)制，根據(jù)糖類(lèi)物質(zhì)不同的親疏水性達(dá)到分離的目的[62]。金屬有機(jī)框架（metal-organic frameworks，MOFs）作為一種晶體多孔結(jié)構(gòu)材料，在吸附和分離方面具有十分廣闊的前景。然而，MOFs未改性材料存在形狀和粒徑分布不均勻的缺點(diǎn)，在分離中容易出現(xiàn)柱效低、柱壓高的問(wèn)題，所以制備尺寸均勻的MOFs復(fù)合材料是一種提高色譜分離性能行之有效的方法。因此Si Tiantian等[63]將聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）包覆在鎳金屬有機(jī)骨架上有效控制顆粒的形狀和尺寸，隨后將改性后的MOFs材料直接鍵合到SiO2表面，得到可分離親水和疏水化合物的混合色譜固定相。其中，PVP為該固定相提供了大量的C—N、C—O疏水基團(tuán)，同時(shí)固定相中的酰胺和羧酸基團(tuán)又為其提供了親水效果。研究發(fā)現(xiàn)，該固定相可實(shí)現(xiàn)多種單糖（鼠李糖、核糖、果糖）、二糖（蔗糖、乳糖）和三糖（松三糖、棉子糖）等糖類(lèi)的分離，單糖首先被洗脫出，其次是二糖、三糖。這種混合色譜柱分離效率高、流動(dòng)相兼容性好，但在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性還需進(jìn)一步提高。近年來(lái)，HILIC/RPLC型混合色譜固定相多用于分離核苷和核酸堿基[64-66]、多芳香烴[67-68]、酚類(lèi)物質(zhì)[69]等，在糖類(lèi)分離分析中應(yīng)用較少。

混合模式固定相結(jié)合了兩種及以上的色譜模式，在分配過(guò)程中表現(xiàn)出多種作用力和分配機(jī)理。因此，相比于單一的色譜模式，該固定相色譜性能更強(qiáng)、適用范圍更廣，不僅對(duì)復(fù)雜樣品具有很好的分離效果，在分離常見(jiàn)樣品時(shí)也具有更好的分離選擇性[70]。然而，混合色譜固定相還存在分離材料合成步驟復(fù)雜、耐久性低、產(chǎn)率低和重復(fù)性較差等缺陷[71]，而且在糖類(lèi)分離中的應(yīng)用仍十分有限。

綜上所述，表2總結(jié)了親水色譜固定相的種類(lèi)以及適用單糖和寡糖特點(diǎn)、分離優(yōu)缺點(diǎn)及柱效。

表2 各類(lèi)型色譜固定相適用單糖和寡糖的特點(diǎn)、優(yōu)缺點(diǎn)及柱效Table 2 Characteristics,advantages and disadvantages and column efficiency of various types of chromatographic stationary phases for the separation of monosaccharides and oligosaccharides

2 HILIC行為影響指標(biāo)

在HILIC分離過(guò)程中，除了固定相的化學(xué)和物理性質(zhì)，有機(jī)溶劑種類(lèi)及比例、流動(dòng)相的鹽濃度、pH值和柱溫等色譜分離條件對(duì)單糖和寡糖的選擇及保留有很大影響[72]。

2.1 流動(dòng)相中乙腈含量

HILIC模式中常用的有機(jī)溶劑有乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等。甲醇是一種質(zhì)子型溶劑，當(dāng)其作為流動(dòng)相時(shí)，分析物的容量因子較小，進(jìn)而導(dǎo)致分離效果降低或出現(xiàn)峰形不對(duì)稱(chēng)、峰展寬的情況[73]。乙醇分子中的羥基可形成氫鍵，因此會(huì)產(chǎn)生不易與待測(cè)組分分離和黏度較大的問(wèn)題，進(jìn)而引起色譜柱壓力過(guò)高。丙酮溶解度高、黏度和毒性較低，理論上是一種理想的流動(dòng)相，但其截止吸收波長(zhǎng)較高，僅適用于吸收高于330 nm波長(zhǎng)的樣品，該特點(diǎn)限制了其適用范圍。乙腈因易與水混溶、無(wú)法提供或接受質(zhì)子、不會(huì)與固定相發(fā)生氫鍵作用、截止吸收波長(zhǎng)低等優(yōu)點(diǎn)，得到了最為廣泛的應(yīng)用。

當(dāng)改變流動(dòng)相中乙腈比例時(shí)，色譜的分離選擇性會(huì)隨之發(fā)生改變[74]。通常乙腈的體積分?jǐn)?shù)在70%～97%之間[27,75]。在此范圍內(nèi)，隨著乙腈含量的提高，分析物與固定相之間的氫鍵相互作用不斷加強(qiáng)，大多分析物的保留也隨之增強(qiáng)。例如，利用SilprZIC親水色譜柱分離12 種糖類(lèi)化合物（5 種單糖、5 種二糖和2 種三糖）時(shí)，在70%～90%乙腈體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，所有糖類(lèi)的保留因子均隨著流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增加，如在乙腈體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，海藻糖的保留因子僅為3，在體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)可達(dá)22[48]。Guo Dandan等[24]驗(yàn)證了在典型的HILIC硅膠色譜柱條件下，提高流動(dòng)相中乙腈含量會(huì)增強(qiáng)糖類(lèi)化合物的保留和分離。以8 個(gè)糖類(lèi)樣品為分析物，研究了乙腈含量在氨基鍵合相上對(duì)極性分析物的分離影響。結(jié)果顯示，使用75%乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，分析物不能被分離，而使用95%乙腈時(shí)，分析物被完全分離。顯然，流動(dòng)相中乙腈含量的增加不僅增加了保留因子，而且改善了分離效果。

2.2 流動(dòng)相緩沖鹽濃度

帶電荷溶質(zhì)與HILIC固定相之間會(huì)產(chǎn)生靜電相互作用，從而影響溶質(zhì)在色譜柱上的保留[76]。為了改善溶質(zhì)的保留特性，可以在流動(dòng)相中加入適宜濃度的緩沖鹽調(diào)節(jié)溶質(zhì)與固定相之間的作用力，從而調(diào)整分析物的保留時(shí)間和色譜峰形。在HILIC分析中，最常用的緩沖鹽是乙酸銨和甲酸銨，濃度范圍通常為5～100 mmol/L[16,77]。

升高緩沖鹽濃度會(huì)使帶電糖類(lèi)與固定相的靜電相互作用（包括吸引與排斥）降低，所以當(dāng)分析物與固定相之間的作用力為靜電排斥時(shí)，保留時(shí)間延長(zhǎng)；當(dāng)作用力為靜電吸引時(shí)，保留時(shí)間縮短。此外，提高緩沖鹽濃度還會(huì)導(dǎo)致吸附水層的增厚，從而影響分析物在流動(dòng)相和吸附水層間的分配，延長(zhǎng)分析物的保留時(shí)間，但該影響較小[78]。當(dāng)緩沖鹽濃度過(guò)高時(shí)，流動(dòng)相容易在高壓條件下產(chǎn)生結(jié)晶，引起色譜柱和管路的堵塞和損壞[79]，而且還會(huì)引起分析物峰形過(guò)寬，導(dǎo)致選擇性較差[80]；當(dāng)緩沖鹽濃度過(guò)低時(shí)，對(duì)分析物保留的影響較??；因此選擇適合濃度的緩沖鹽至關(guān)重要。當(dāng)糖類(lèi)化合物與固定相之間只有親水分配作用時(shí)，其保留時(shí)間隨著鹽濃度的增加而延長(zhǎng)。?esla等[81]考察了兩種濃度的乙酸銨溶液對(duì)5 種麥芽寡糖（麥芽糖二糖、三糖、四糖、五糖、六糖）在TSKgel Amide-80酰胺柱上保留行為的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)緩沖鹽濃度由10 mmol/L提高至30 mmol/L，5 種麥芽寡糖的保留時(shí)間均延長(zhǎng)，這是因?yàn)辂}濃度會(huì)影響寡糖與固定相之間的靜電排斥作用，鹽濃度越高，靜電相互作用越小。姜舸等[82]研究了木糖、甘露糖、半乳糖、唾液酸、蔗糖、麥芽糖、乳糖、松三糖和棉籽糖在不同濃度甲酸銨溶液中的保留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)不添加甲酸銨時(shí)，帶負(fù)電的唾液酸和帶正電的固定相（Click TE-Cys）之間存在靜電相互作用；當(dāng)甲酸銨溶液濃度增加到10 mmol/L，唾液酸的保留因靜電相互作用的減弱而縮短。對(duì)于除唾液酸以外的中性糖類(lèi)化合物在色譜柱上的保留反而因鹽濃度的增大而增強(qiáng)，這是因?yàn)檫@些物質(zhì)與固定相間沒(méi)有靜電相互作用，僅存在親水分配作用使固定相表面吸附水層的厚度和極性與緩沖鹽濃度呈正相關(guān)，此時(shí)增加鹽濃度會(huì)增大樣品在水相中的分配系數(shù)，從而引起溶質(zhì)的保留時(shí)間延長(zhǎng)。

2.3 流動(dòng)相pH值

在HILIC模式下，流動(dòng)相pH值會(huì)改變固定相和溶質(zhì)的電荷狀態(tài)，從而影響帶電固定相與帶電溶質(zhì)之間的靜電相互作用（吸引或排斥），進(jìn)而影響分析物的保留性[74]。當(dāng)固定相與極性分析物所帶電荷相同時(shí)，由于靜電排斥作用，分析物的保留性會(huì)減弱；反之保留性增強(qiáng)。Yan Jun等[83]在BEH Amide色譜柱上考察了流動(dòng)相pH值為9.8和10.8時(shí)單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液混合物（葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、木糖、巖藻糖和果糖）的保留行為。單糖pKa值一般為12～13，當(dāng)pH值為10.8時(shí)，與pKa相差1.2～2.2 個(gè)pH值單位，可實(shí)現(xiàn)pKa與流動(dòng)相pH值相差不足2 個(gè)pH值單位的單糖部分去質(zhì)子化，從而使酰胺柱上的硅烷醇基團(tuán)發(fā)生靜電排斥作用，縮短單糖的保留時(shí)間。但是，由于幾種單糖酸性太弱，在pH值為9.8的流動(dòng)相中，幾種酸性太弱（即pKa與流動(dòng)相pH值相差2 個(gè)以上單位）的單糖無(wú)法解離即去質(zhì)子化，對(duì)單糖的分離無(wú)影響。因此在該實(shí)驗(yàn)中，隨著流動(dòng)相pH值的降低，靜電排斥作用減弱，單糖的保留時(shí)間加長(zhǎng)、洗脫減慢。為了研究靜電相互作用對(duì)HILIC固定相分離離子型糖類(lèi)化合物的影響，F(xiàn)u Qing等[84]選用酸性葡萄糖醛酸（pKa＝1.10）和堿性氨基葡萄糖（pKa＝7.78）[85]為分析物，探討了4 種固定相（相互Clickβ-CD、Click Maltose、XAmide和Click TE-Cys）（圖10）在不同流動(dòng)相pH 6.8和3.0條件下對(duì)樣品保留行為的影響。當(dāng)pH值從6.8變化到3.0時(shí)，4 種固定相的表面電荷性質(zhì)均由負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾桑瑝A性糖被質(zhì)子化帶正電荷，酸性糖的電離被抑制。堿性糖與固定相之間的作用力會(huì)從靜電吸引作用變?yōu)殪o電排斥作用，為避免峰形拖尾，pH值為3.0時(shí)更適合分離堿性糖，為了減少酸性糖與固定相間的離子交換作用，pH值為6.8時(shí)更適合分離酸性糖。

圖10 4 種HILIC柱的結(jié)構(gòu)信息[84]Fig.10 Structural information of four HILIC columns[84]

2.4 柱溫

色譜柱溫度會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)、流動(dòng)相的黏度以及溶質(zhì)與固定相之間的相互作用。通常情況下，柱溫升高會(huì)增大溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)，縮短保留時(shí)間[86]。例如，楊晨曦等[48]使用自制的SilprZIC兩性離子親水固定相分離鼠李糖、木糖、果糖、甘露糖和葡萄糖時(shí)，柱溫在25 ℃升至45 ℃的過(guò)程中，所有單糖的保留時(shí)間都不斷下降。但是當(dāng)溶質(zhì)與固定相之間的保留機(jī)制以靜電吸引為主時(shí)，溶質(zhì)的保留會(huì)隨著溫度的升高而增強(qiáng)，分離蔗糖、麥芽糖和海藻糖的保留時(shí)間呈現(xiàn)先延長(zhǎng)再縮短的趨勢(shì)，可能是因?yàn)槎呛凸潭ㄏ嚅g的作用力開(kāi)始時(shí)主要是靜電吸引。此外，柱溫還會(huì)影響糖的峰形[85-86]。如圖11所示，采用新型的Daicel DCpak PTZ酰胺柱分離果糖時(shí)，隨著溫度的升高，果糖的峰形逐漸尖銳且洗脫時(shí)間逐漸縮短，不過(guò)此時(shí)溫度對(duì)洗脫時(shí)間的影響較小[87]。柱溫對(duì)于分析物在HILIC柱上保留的影響復(fù)雜且難以預(yù)判，且溫度變化對(duì)保留率的影響顯著小于流動(dòng)相的組成，因此通常不將溫度用作調(diào)節(jié)色譜選擇性的首要參數(shù)。一般情況下，色譜柱的適宜溫度為30 ℃[24,84,88]。

圖11 果糖在Daicel DCpak PTZ酰胺柱上的溫度依賴(lài)性色譜圖[87]Fig.11 Temperature-dependent chromatograms of fructose on Daicel DCpak PTZ column[87]

3 結(jié)語(yǔ)

單糖和寡糖的色譜分離對(duì)于深入進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和研究生物活性具有重要意義。傳統(tǒng)的RPLC和NPLC在極性化合物的分離上受到限制，HILIC是一種更為理想的色譜分離方法。目前已報(bào)道的HILIC固定相如氨基鍵合固定相、酰胺類(lèi)鍵合固定相、糖類(lèi)鍵合固定相、兩性離子鍵合固定相等已經(jīng)廣泛應(yīng)用于糖類(lèi)化合物的分離分析。其中，氨基鍵合固定相和酰胺類(lèi)鍵合固定相已發(fā)展為成熟且商業(yè)化的色譜固定相，現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)室研究的熱點(diǎn)是兩性離子鍵合固定相。在糖類(lèi)化合物的分離過(guò)程中，不同類(lèi)型的色譜固定相具有不同的適用糖類(lèi)及優(yōu)缺點(diǎn)。

盡管單糖/寡糖分離HILIC材料目前已取得重要的研究進(jìn)展，但仍面臨著諸多問(wèn)題和挑戰(zhàn)。第一，能夠同時(shí)分離酸性、中性和堿性單糖/寡糖的色譜柱較為缺乏，如何制備分離更全面、操作更簡(jiǎn)單的色譜固定相是一個(gè)重要挑戰(zhàn)；第二，乙腈是HILIC中最常用的流動(dòng)相有機(jī)組分，但是其毒性高且易揮發(fā)，對(duì)人體危害較大，因此亟需尋找低毒或無(wú)毒的流動(dòng)相替代乙腈；第三，相對(duì)于單一模式的色譜材料，MMC（IEC/HILIC、HILIC/RPLC、IEC/HILIC/RPLC）具有更多優(yōu)點(diǎn)，尤其是IEC/HILIC/RPLC型混合色譜固定相。該固定相將離子交換、親水和疏水3 種作用力相結(jié)合，大大提高了單根色譜柱的分離能力。然而，MMC固定相制備繁瑣，色譜分離條件要求嚴(yán)苛，在糖類(lèi)化合物分離領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用較少。為解決上述問(wèn)題，首先應(yīng)對(duì)不同酸堿性的單糖和寡糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，探索合適的官能團(tuán)對(duì)固定相進(jìn)行修飾，尋找最適宜的色譜行為指標(biāo)，發(fā)展分離范圍更寬的色譜材料；其次，選擇極性與乙腈相似，同時(shí)無(wú)毒或低毒且不會(huì)在紫外區(qū)有吸收的非質(zhì)子化有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，以減少乙腈對(duì)人體的危害。此外，MMC對(duì)糖類(lèi)的分離不僅需要實(shí)驗(yàn)的摸索，更需要色譜分離理論的指導(dǎo)，以實(shí)現(xiàn)單糖和寡糖的高效分離。

總地來(lái)說(shuō)，制備適合單糖/寡糖分離的HILIC材料有望推進(jìn)糖類(lèi)化合物的深入研究和發(fā)展，為食品科學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。在此，期待更多簡(jiǎn)單高效且適宜糖類(lèi)分離的色譜材料早日問(wèn)世，隨著色譜分離技術(shù)的不斷完善與成熟，單糖和寡糖會(huì)在各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。