馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種real-time PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

呂厚姣，李欣媛，白小佳，賈龍剛，耿偉濤，王艷萍

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

馬乳酒樣乳桿菌在伯杰氏細(xì)菌分類鑒定中屬于乳桿菌科、乳桿菌屬，馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種（Lactobacilluskefiranofacienssubsp.kefiranofaciens）是其中一個(gè)亞種[1]。馬乳酒樣乳桿菌具有抗菌[2-3]、抗腫瘤[4-5]、免疫調(diào)節(jié)[6-7]、抗過敏[8]、腸道微生物群[9-10]等益生作用。2021年中國(guó)衛(wèi)健委發(fā)布通知，將馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種列為新食品原料。因此，未來該菌株有望在食品藥品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。由于采用目前常規(guī)檢驗(yàn)方法不能有效地檢出該菌種，因此，需要建立特異性、靈敏度和重復(fù)性高的快速檢測(cè)方法。

目前根據(jù)GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》，乳酸菌檢測(cè)方法為平板計(jì)數(shù)法[11]，其中乳桿菌采用平板傾注法[12]。但是該方法對(duì)有些混合體系中多種乳桿菌或亞種不能進(jìn)行區(qū)分，而且操作時(shí)間長(zhǎng)，并且顯著低估細(xì)菌豐度[13-16]。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于乳酸菌的定性和定量檢測(cè)[17-19]，比如流式細(xì)胞術(shù)[20]、熒光原位雜交技術(shù)[21]及實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）[22]等。相比于傳統(tǒng)的技術(shù)方法，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法方便、快捷、精確度及靈敏度高[23-25]。其中real-time PCR方法將PCR方法和熒光報(bào)告化學(xué)相結(jié)合，監(jiān)測(cè)模板擴(kuò)增，根據(jù)由具有已知濃度或拷貝數(shù)的連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品（通常是10 倍稀釋液）構(gòu)建的校準(zhǔn)曲線確定樣品中靶DNA的絕對(duì)量[26]。

本研究以馬乳酒樣乳桿菌的模式菌株馬乳酒樣乳桿菌亞種ZW3菌株為研究對(duì)象，通過對(duì)馬乳酒樣乳桿菌ZW3的16S rDNA序列和全基因組序列進(jìn)行分析，以期獲得馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的特異性引物序列信息，確定特異性引物，建立PCR和real-time PCR的檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用菌株見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株Table 1 Strains used in this study

細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、溶菌酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；2×SYBR Green Fast qPCR Mix 北京百邁客生物科技有限公司；DNA Marker III、Trans2K Plus II DNA Marker 北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、核酸染料 美國(guó)Genview公司；M17培養(yǎng)基 青島海博生物科技有限公司；異丙醇、無水乙醇 天津江天化工技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀、5415D型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；DYY-III-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCZ-24D型電泳槽北京六一儀器廠；超微量分光光度計(jì) 英國(guó)BioDrop公司；全自動(dòng)凝膠成像儀、C1000TMreal-time PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

取過夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，加入離心管中，室溫8 000 r/min離心1 min，棄上清液，收集菌體。按照DNA提取試劑盒說明提取細(xì)菌基因組DNA。

將提取好的細(xì)菌基因組DNA用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。

1.3.2 馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的特異性引物設(shè)計(jì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種和在發(fā)酵食品中經(jīng)常食用的常見益生菌，如發(fā)酵黏液乳桿菌（Limosilactobacillusfermentum）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（L.delbrueckiisubsp.bulgaricus）、唾液鏈球菌嗜熱亞種（S.salivariussubsp.thermophilus）、植物乳植桿菌（L.plantarum）、羅伊氏黏液乳桿菌（L.reuteri）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）等的16S rDNA序列和其他基因DNA序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列對(duì)比，找尋序列差異性較大的片段，用Primer 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到初步引物，將得到的引物序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST查詢驗(yàn)證，比對(duì)結(jié)果與馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的DNA序列匹配，將此引物作為候選應(yīng)用到下一步實(shí)驗(yàn)中。

1.3.3 引物初篩實(shí)驗(yàn)

以提取的馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種、德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種的全基因組DNA為模板，用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增后，經(jīng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。

1.3.4 引物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將提取的植物乳植桿菌MA2、植物乳植桿菌BC 299、馬乳酒樣乳桿菌1207等的全基因組DNA利用篩選的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，對(duì)特異性引物進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 PCR條件與檢驗(yàn)

PCR體系共20 μL，其中10 μL 2×RapidTaqMaster mix，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至體積20 μL。

PCR條件：95 ℃預(yù)變性8 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

凝膠電泳：PCR結(jié)束后取1 μL的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用凝膠成像儀分析結(jié)果并照相收集數(shù)據(jù)。

1.3.6 real-time PCR

real-time PCR體系共20 μL，其中SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至體積20 μL。real-time PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)末收集熒光信號(hào)。

1.3.7 方法特異性、靈敏度和重復(fù)性檢測(cè)

特異性驗(yàn)證：以馬乳酒樣乳桿菌、植物乳植桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種的基因組DNA為模板，采用篩選出的馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的特異性引物對(duì)，以滅菌ddH2O作為陰性對(duì)照（NTC），進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，測(cè)試方法的特異性。

靈敏度驗(yàn)證：將馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的DNA原液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，以稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 μg/mL的DNA為模板，利用馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的特異性引物，以滅菌ddH2O作為陰性對(duì)照（NTC），每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3 個(gè)平行，進(jìn)行real-time PCR，找出檢測(cè)為陽性時(shí)的最低濃度。

重復(fù)性驗(yàn)證：采用馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的5 個(gè)不同的質(zhì)量濃度，每個(gè)樣本重復(fù)3 次，計(jì)算循環(huán)閾值（Cq）的標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

從馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種菌株菌液10 倍稀釋液中提取DNA進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)菌株已知量的不同菌株對(duì)數(shù)值（lg（CFU/mL））為橫坐標(biāo)，采用馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種特異性基因引物擴(kuò)增，以反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的Cq為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.3.9 real-time PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

依照1.3.1節(jié)的方法對(duì)需要檢測(cè)的不同菌株及混合體系的DNA進(jìn)行提取，應(yīng)用特異性引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，然后進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證，判斷本方法的檢測(cè)特異性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用軟件LightCycler?96 SW對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；real-time PCR圖為軟件自動(dòng)生成。利用Excel 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及表格繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌基因組DNA的濃度和純度檢測(cè)結(jié)果

通過DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA后，經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)所有細(xì)菌基因組DNA質(zhì)量濃度均在200～2 000 μg/mL之間，A260nm/A280nm的值均在1.8～2.0之間（表2），說明DNA提取濃度較高，其他雜質(zhì)污染較少、純度較高，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

表2 細(xì)菌基因組DNA提取結(jié)果Table 2 Results of bacterial genomic DNA extraction

2.2 馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種特異性引物設(shè)計(jì)結(jié)果

通過馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種與德氏乳桿菌保加利亞亞種、唾液鏈球菌嗜熱亞種、嗜酸乳桿菌、植物乳植桿菌、發(fā)酵黏液乳桿菌、羅伊氏黏液乳桿菌和干酪乳桿菌的16S rDNA序列及其他基因序列對(duì)比，找出序列相差較大的片段，通過Primer 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后得到4 組引物（表3）。

表3 ZW3的引物序列Table 3 Primer sequences from ZW3

2.3 特異性引物的初篩結(jié)果

將提取的德氏乳桿菌保加利亞亞種、唾液鏈球菌嗜熱亞種和馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的DNA用所設(shè)計(jì)的4 對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，結(jié)果見圖1。根據(jù)16S rDNA設(shè)計(jì)的引物ZW3-引物-1和根據(jù)基因WANG_1283設(shè)計(jì)的引物ZW3-引物-2對(duì)各個(gè)細(xì)菌及負(fù)對(duì)照均有擴(kuò)增條帶，可能原因是引物特異性差；根據(jù)基因WANG_1287設(shè)計(jì)的引物ZW3-引物-3對(duì)馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種、德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，而引物ZW3-引物-4除了對(duì)馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種有明顯擴(kuò)增條帶，對(duì)其他細(xì)菌的擴(kuò)增條帶均不太明顯，因此可以得出引物ZW3-引物-4的特異性強(qiáng)，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同特異性引物擴(kuò)增目的片段的PCR結(jié)果Fig.1 Agarose gel electropherogram of PCR amplified fragments with different specific primers

2.4 特異性引物驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)上述PCR結(jié)果，選擇引物ZW3-引物-4進(jìn)一步驗(yàn)證其特異性。將植物乳植桿菌MA2、植物乳植桿菌BC 299、馬乳酒樣乳桿菌XL 10、馬乳酒樣乳桿菌1207和馬乳酒樣乳桿菌ZW3提取的基因組DNA使用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，除了馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種外，其余菌株均在224 bp處無明顯條帶，可知該引物的特異性較好，可進(jìn)行real-time PCR。

圖2 ZW3-引物-4特異性驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electropherogram showing the specificity of primer 4 from ZW3

特異性引物ZW3-引物-4來自基因WANG_1287，該基因被注釋為糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase，GT）2。GTs介導(dǎo)來自各種糖供體的糖的區(qū)域特異性和立體特異性轉(zhuǎn)移到各種重要的生物分子，包括聚糖、脂質(zhì)、肽和小分子[19-20]。GT2酶類與蔗糖等二糖、脂多糖、殼聚糖的合成相關(guān)，在發(fā)酵乳中，這些物質(zhì)尤其是多糖類化合物可能會(huì)影響發(fā)酵乳最終的黏度、持水性等特性。而ZW3的特點(diǎn)是高產(chǎn)胞外多糖，且根據(jù)王鑫磊等[21]的研究可知，添加ZW3可以增加發(fā)酵酸奶的黏度，因此該基因是一個(gè)關(guān)鍵特異性基因。

2.5 real-time PCR的建立

2.5.1 特異性檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)普通PCR結(jié)果可得ZW3-引物-4具有較強(qiáng)的特異性，因此使用該引物進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證。將植物乳植桿菌MA2、植物乳植桿菌BC 299、馬乳酒樣乳桿菌XL 10、馬乳酒樣乳桿菌1207和馬乳酒樣乳桿菌ZW3提取的基因組DNA使用該引物在同一條件下同時(shí)進(jìn)行real-time PCR，結(jié)果如圖3所示，除馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的“S”形曲線，且Cq約為17，說明擴(kuò)增效率高，其余菌株均未出現(xiàn)擴(kuò)增，說明該引物特異性好，只對(duì)馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種有特異性擴(kuò)增。

圖3 特異性引物驗(yàn)證曲線Fig.3 Specific primer validation curves

2.5.2 靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

將ZW3的DNA質(zhì)量濃度稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 μg/mL共7 個(gè)梯度進(jìn)行real-time PCR，檢測(cè)反應(yīng)體系的靈敏度，擴(kuò)增曲線如圖4所示，0.000 5 μg/mL和0.000 1 μg/mL的擴(kuò)增曲線與NTC組相重合，并根據(jù)表4可知，NTC組的Cq平均值為31.74，為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度，選擇Cq≤30時(shí)為陽性檢出。在質(zhì)量濃度為0.001 μg/mL時(shí)，Cq為29.87，因此本實(shí)驗(yàn)方法最低可以檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.001 μg/mL。

圖4 特異性引物靈敏度的擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curves of specific primers sensitivity

表4 靈敏度測(cè)試結(jié)果Table 4 Sensitivity test results

2.5.3 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

以20、2、0.2、0.02、0.002 μg/mL 5 個(gè)馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的DNA質(zhì)量濃度進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5，對(duì)所得的Cq進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的5 個(gè)質(zhì)量濃度樣品Cq的SD在0.05～0.23之間，RSD在0.26%～0.95%之間，小于1%，在可接受范圍內(nèi)，因此，建立的real-time PCR檢測(cè)體系具有較好的重復(fù)性。

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Repeatability test results

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL的10 倍連續(xù)稀釋液作為反應(yīng)模板，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中不同梯度稀釋液的擴(kuò)增曲線見圖5，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示?；貧w方程為y＝-2.671x+30.719，決定系數(shù)R2為0.965，該曲線具有良好的線性關(guān)系。

圖5 不同濃度基因模板擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增曲線Fig.5 Amplification curves of target genes amplified with gene templates at different concentrations

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.6 Establishment of standard curve

2.6 real-time PCR方法的應(yīng)用

2.6.1 在馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種其他菌株純培養(yǎng)物檢測(cè)中的應(yīng)用

real-time PCR方法建立后，為了檢測(cè)方法的實(shí)用性，使用本實(shí)驗(yàn)室保藏的已知亞種的菌株進(jìn)行驗(yàn)證。馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW18、LK180和W182是本實(shí)驗(yàn)室在中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定的已知亞種的3 種菌株。首先通過DNA提取試劑盒提取這3 株菌的DNA進(jìn)行質(zhì)量濃度和純度的檢測(cè)，3 株菌的DNA質(zhì)量濃度均大于200 μg/mL，表明DNA濃度較好，且1.8＜A260nm/A280nm＜2.0，可用于后續(xù)特異性PCR和real-time PCR的檢測(cè)。

使用特異性引物對(duì)3 株菌進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示，3 株菌均有明顯的“S”型擴(kuò)增曲線，且Cq均在20左右，表明該特異性引物具有馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種特異性，且建立的real-time PCR方法可以特異性地檢測(cè)該亞種。

圖7 特異性引物對(duì)馬乳酒樣乳桿菌不同菌株的目標(biāo)基因擴(kuò)增曲線Fig.7 Amplification curves of target genes in different strains of L.kefiranofaciens with specific primers

2.6.2 在含有馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種及其他乳酸菌混合體系檢測(cè)中的應(yīng)用

在實(shí)際應(yīng)用中，益生菌通常都不是單獨(dú)使用，而是和其他益生菌共同使用[27]，因此從純培養(yǎng)物水平和純基因組DNA水平分別檢驗(yàn)所建立的real-time PCR方法的抗干擾能力。純培養(yǎng)物水平檢驗(yàn)結(jié)果如表6所示，添加德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種不影響該方法對(duì)馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的檢測(cè)。基因組DNA水平檢驗(yàn)結(jié)果如表7所示，混合DNA體系中含有德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種的DNA不影響馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的檢測(cè)，且至少能檢出0.02 μg/mL的DNA。

表6 培養(yǎng)物水平混合體系的檢測(cè)結(jié)果Table 6 Resistance of real-time PCR to interferences from other lactic acid bacteria

表7 純基因組DNA水平混合體系的檢測(cè)結(jié)果Table 7 Resistance of real-time PCR to interferences from pure genomic DNA from other lactic acid bacteria

2.6.3 在含有馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種復(fù)合益生菌菌粉樣品檢測(cè)中的應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)使用含有德氏乳桿菌保加利亞亞種菌粉、唾液鏈球菌嗜熱亞種菌粉和馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3菌粉（3 株菌的添加比例為1∶1∶1）的復(fù)合益生菌菌粉混合體系進(jìn)行驗(yàn)證，以純馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3菌粉為對(duì)照，兩個(gè)體系的real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖8所示，兩個(gè)體系均有明顯的擴(kuò)增曲線，且兩個(gè)體系的擴(kuò)增曲線距離較近，Cq差距也較小，表明添加其他菌粉不影響目標(biāo)菌株的檢出，所建立的real-time PCR方法可以特異性地檢測(cè)該亞種。

圖8 混合菌粉的驗(yàn)證Fig.8 Verification of real-time PCR using pure ZW3 and its mixture with other probiotics

3 討論與結(jié)論

馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種作為一種新資源食品原料，具有廣闊的應(yīng)用前景，因此建立能夠簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)這種益生菌的方法至關(guān)重要。Kim等[28]通過將馬乳酒樣乳桿菌與其相似菌株的16S rDNA序列進(jìn)行對(duì)比設(shè)計(jì)引物和探針，第一次應(yīng)用real-time PCR法檢測(cè)對(duì)比了開菲爾粒和開菲爾牛奶中馬乳酒樣乳桿菌。但是目前檢測(cè)馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的方法鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過real-time PCR方法特異性定性、定量馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究根據(jù)馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3的16S rDNA序列和全基因組序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，證明特異性引物ZW3-引物-4的特異性較強(qiáng)。通過該特異性引物建立了馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的real-time PCR方法，特異性強(qiáng)、靈敏度高，檢出限為0.001 μg/mL，重復(fù)性好，建立realtime PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其決定系數(shù)R2為0.965，具有良好的線性關(guān)系，且在純培養(yǎng)物和混合體系中均能特異性檢出馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種。綜上，本研究為馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種檢測(cè)提供了一種特異、快速、靈敏的檢測(cè)方法。