p38 MAPK通路調(diào)控自噬-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)草酸鈣腎結(jié)石形成的機(jī)制研究

（文昌市人民醫(yī)院泌尿外科，海南文昌 571000）

Mechanism of calcium oxalate kidney stone formation mediated by autophagy and endoplasmic reticulum stress pathway regulated by p38 MAPK pathway

XIE Yabin，WANG Fei，WANG Kangyang，LIN Shishuai

（Department of Urology，Wenchang People’s Hospital，Wenchang 571000，China）

ABSTRACT：Objective To explore the effects and mechanism of p38 mitogen activated protein kinase （MAPK） pathway on the formation of calcium oxalate （CaOx） kidney stones in rats，so as to provide new ideas for the treatment of kidney stones.

Methods A total of 40 rats were divided into control，SB203580，CaOx and SB203580+CaOx groups，with 10 rats in each group.Intragastric administration of a mixture of 1% ethylene glycol and 1% ammonium chloride was given to the CaOx and SB203580+CaOx groups to construct CaOx models，while intragastric administration of drinking water was given to the control and SB203580 groups.After molding，SB203580 and SB203580+CaOx groups were injected with 5 mg/kg SB203580 peritoneally once a day for 14 days，while the control and CaOx groups were injected with equal volume of normal saline.The renal mass of rats was measured and the renal coefficient was calculated；the serum levels of blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （SCr） were measured with an automated biochemical analyzer；the urinary levels of neutrophil gelatinase-associated lipid carrier protein （NGAL） and kidney injury molecule-1 （KIM-1） were determined with enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）；the crystal deposition and tissue damage in renal tissues were observed with Von Kossa staining；the apoptosis of renal tubule cells was observed with TUNEL；the expressions of autophagy markers in kidney tissues were detected with immunohistochemical staining；the molecular expressions of autophagy-endoplasmic reticulum stress related pathways in renal tissues were determined with RT-qPCR and Western blot.Results Compared with the CaOx group，the SB203580+CaOx group had increased body mass after molding （Plt;0.05）；decreased kidney mass，kidney coefficient，BUN，SCr，NGAL and KIM-1 levels （Plt;0.05）；alleviated pathological damage of kidney tissues；significantly reduced black crystal；down-regulated proportion of positive TUNEL cells，positive expression area of LC3B and Beclin-1，mRNA expressions of LC3B，Beclin-1，CHOP and GRP78，protein ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，and protein expressions of Beclin-1，CHOP and GRP78 （Plt;0.05）；but up-regulated mRNA and protein expressions of p62 （Plt;0.05）.Conclusion The p38 MAPK pathway is involved in the formation of CaOx kidney stones in rats.Inhibition of this pathway can reduce the formation of kidney stones，which may be related to the regulation of autophagy and endoplasmic reticulum stress.

KEY WORDS：kidney stone；calcium oxalate；p38 mitogen activated protein kinase；autophagy；endoplasmic reticulum stress；

kidney stone formation；animal models of kidney stone

收稿日期：2023-03-14 """修回日期：2023-09-25

基金項(xiàng)目：海南省衛(wèi)生健康行業(yè)科研項(xiàng)目（No.22A200166）

通信作者：王飛，主任醫(yī)師。E-mail：hnsywangfei@163.com

作者簡介：謝亞彬，碩士研究生，副主任醫(yī)師。研究方向：泌尿系結(jié)石。E-mail：avene00@163.com

摘要：目的 探究p38 MAPK通路對(duì)大鼠草酸鈣（CaOx）腎結(jié)石形成的影響及其作用機(jī)制，為腎結(jié)石的治療選擇提供新的思路。方法 將40只大鼠分為對(duì)照組、SB203580組、CaOx組、SB203580+CaOx組，每組10只，CaOx組和SB203580+CaOx組以1%乙二醇與1%氯化銨配制的混合液灌胃建立CaOx腎結(jié)石模型，對(duì)照組和SB203580組以飲用水灌胃；造模后，SB203580組和SB203580+CaOx組腹腔注入劑量為5 mg/kg的SB203580，1次/d，連續(xù)注射14 d，對(duì)照組和CaOx組腹腔注入等體積生理鹽水。稱量大鼠腎臟質(zhì)量并計(jì)算腎臟系數(shù)，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中血清尿素氮（BUN）和血肌酐（SCr）水平，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定尿液中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）和腎損傷分子-1（KIM-1）水平，鈣鹽染色（Von Kossa）觀察黑色晶體沉積及組織損傷情況，原位末端標(biāo)記法（TUNEL）觀察腎小管細(xì)胞凋亡情況，免疫組化染色檢測(cè)自噬標(biāo)記物表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）與蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）測(cè)定自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑相關(guān)分子表達(dá)。結(jié)果 與CaOx組比較，SB203580+CaOx組大鼠造模后體質(zhì)量較高（Plt;0.05），腎臟質(zhì)量、腎臟系數(shù)、BUN、SCr、NGAL、KIM-1水平均較低（Plt;0.05），腎臟組織病理損傷減輕且黑色結(jié)晶明顯減少，TUNEL陽性細(xì)胞比例、LC3B與Beclin-1陽性表達(dá)面積占比、LC3B、Beclin-1、CHOP、GRP78 mRNA表達(dá)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值、Beclin-1、CHOP、GRP78蛋白表達(dá)均下調(diào)（Plt;0.05），p62 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)（Plt;0.05）。結(jié)論 p38 MAPK通路參與大鼠CaOx腎結(jié)石形成，抑制該通路能夠減少腎結(jié)石形成，該作用可能與其調(diào)控自噬-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腎結(jié)石；草酸鈣；p38絲裂原激活蛋白激酶；自噬；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；結(jié)石形成；腎結(jié)石動(dòng)物模型中圖分類號(hào)：R692.4 ""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.01.015""腎結(jié)石為泌尿系常見疾病，多發(fā)生于腎盞、腎盂及腎盂與輸尿管連接部［1］。據(jù)報(bào)道，腎結(jié)石的患病率和發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，我國成年人腎結(jié)石的患病率達(dá)到5.8%［2］。多種環(huán)境因素如生活方式、飲食習(xí)慣、地域差異等，均影響腎結(jié)石的形成［3］，而其發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。草酸鈣（calcium oxalate，CaOx）結(jié)石是常見的腎結(jié)石類型，大約占所有腎結(jié)石病例的80%，主要由于攝入含草酸較高的食物導(dǎo)致體內(nèi)草酸大量積累形成。

有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，可響應(yīng)不同刺激將信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核，常見的3種同工酶包括c-Jun氨基末端激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶及p38絲裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38 MAPK）。p38 MAPK通路在腎結(jié)石形成過程中發(fā)揮著重要作用，但其具體作用模式及機(jī)制有待進(jìn)一步明確［4-7］?；诖?，本研究通過建立CaOx腎結(jié)石大鼠模型，使用p38 MAPK通路抑制劑SB203580對(duì)該通路活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，來研究p38 MAPK通路是否在CaOx腎結(jié)石形成過程中調(diào)節(jié)自噬-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反應(yīng)，以期闡明p38 MAPK通路參與腎結(jié)石形成的作用機(jī)制，為腎結(jié)石治療提供更多的選擇思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，由海南藥物研究所有限責(zé)任公司提供。將大鼠飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，明暗周期各12 h，每5只大鼠同籠飼養(yǎng)，期間自由進(jìn)食、飲水。本研究經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施［2022論審（03-5）號(hào)］。

1.2 主要試劑 p38 MAPK抑制劑SB203580（上海吉至生化科技有限公司），乙二醇和氯化銨（北京普非生物科技有限公司），血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCr）檢測(cè)試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），尿液中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipid carrier protein，NGAL）、腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），鈣鹽染色（Von Kossa） 試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司），原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料、山羊血清、DAB顯色試劑盒及ECL試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司），第一鏈cDNA合成試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增試劑盒（南京諾唯贊生物公司），RIPA裂解液（武漢博士德生物工程有限公司），BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（北京天根生化科技有限公司），兔抗LC3B多克隆抗體、兔抗Beclin-1多克隆抗體、兔抗p62多克隆抗體、兔抗CHOP多克隆抗體、兔抗GRP78多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（英國Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與造模、給藥

按照隨機(jī)分組原則將40只大鼠分為對(duì)照組、SB203580組、CaOx組、SB203580+CaOx組，每組10只。分籠飼養(yǎng)1周后，對(duì)照組和SB203580組的大鼠采用飲用水喂養(yǎng)，CaOx組和SB203580+CaOx組的大鼠每日以體積分?jǐn)?shù)為1%乙二醇與1%氯化銨配制的混合液灌胃，2 mL/d，連續(xù)4周，以復(fù)制建立CaOx腎結(jié)石大鼠模型［8］。造模后，SB203580組和SB203580+CaOx組通過腹腔注入劑量為5 mg/kg的SB203580，1次/d，連續(xù)注射14 d，與此同時(shí)，對(duì)照組和CaOx組注入等體積生理鹽水。

1.3.2 大鼠體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量及腎臟系數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前，將各組大鼠置于校準(zhǔn)后的電子天平上稱重、記錄。實(shí)驗(yàn)后，再次稱量并記錄。解剖大鼠取腎臟組織，將腎包膜剝離干凈后，電子天平上稱量雙側(cè)腎質(zhì)量并記錄，計(jì)算腎臟系數(shù)，計(jì)算公式：臟器系數(shù)＝臟器質(zhì)量（g）/大鼠體質(zhì)量（100 g）。

1.3.3 大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 采用無菌采血針頭經(jīng)下腔靜脈分別抽取各組大鼠3 mL血液置于離心管內(nèi)，通過離心機(jī)以3 000 轉(zhuǎn)/min的速度離心15 min后，微量移液器取上清液即血清移入潔凈離心管中保存。從代謝籠里收集大鼠24 h尿液，移入離心管后再通過離心機(jī)以1 200 轉(zhuǎn)/min的速度離心15 min，收集上清液備用。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中BUN和SCr水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定尿液中腎小管損傷標(biāo)志物NGAL和KIM-1水平。

1.3.4 Von Kossa染色

將腎臟組織用生理鹽水清洗干凈，浸入4%多聚甲醛溶液固定過夜。修剪組織塊，石蠟包埋，并制作組織切片。切片經(jīng)脫蠟水化后，將配制好的Von Kossa染色工作液滴加到切片上，至標(biāo)本被染液完全覆蓋，在濕盒內(nèi)孵育45 min。隨后蒸餾水清洗切片，滴加蘇木素染色5 min，清水沖洗，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗返藍(lán)，再滴加伊紅染色2 min，流水沖洗多余染液，中性樹膠封固，使用光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。

1.3.5 TUNEL染色

將腎臟組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟水化，蒸餾水清洗，將配置好的蛋白酶K工作液滴加在切片上，放于濕盒內(nèi)并置于37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育20 min。結(jié)束后，采用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗切片，在切片上滴加TUNEL檢測(cè)液將樣本組織完全覆蓋，繼續(xù)放于濕盒內(nèi)避光孵育1 h。PBS洗掉多余染液，接著將DAPI染液均勻滴加到切片上，室溫下避光染核10 min。PBS再次清洗，抗熒光淬滅劑密封，通過熒光顯微鏡觀察并采集圖像。每張切片隨機(jī)選3個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)視野下TUNEL標(biāo)記的陽性數(shù)目（即死亡細(xì)胞）與總細(xì)胞數(shù)目，以兩者之比記為TUNEL陽性細(xì)胞率。

1.3.6 免疫組化染色 將腎臟組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟水化，PBS清洗，放入pH值為6.0的枸櫞酸鉀溶液中，微波爐加熱修復(fù)抗原后，取出冷卻至室溫，PBS清洗后，用體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2孵育15 min，再用體積分?jǐn)?shù)為10%山羊血清室溫封閉30 min。分別將稀釋的兔抗LC3B多克隆抗體（1∶200）、兔抗Beclin-1多克隆抗體（1∶200）滴加至切片上，置4 ℃孵育過夜。次日將切片取出復(fù)溫，棄多余溶液，PBS清洗后，滴加對(duì)應(yīng)稀釋后的二抗（1∶1 000），置37 ℃恒溫箱孵育30 min。PBS充分清洗后，將配置好的DAB顯色液滴于切片上，室溫孵育5 min，蘇木精復(fù)染，體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，常規(guī)脫水與透明，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。鏡下有黃棕色至棕色染色即為陽性，每張切片隨機(jī)選3個(gè)不重疊視野，通過Image-Pro Plus軟件分析LC3B與Beclin-1的陽性表達(dá)情況。

1.3.7 定量聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法

腎臟組織剪碎放入研缽，倒入液氮迅速研磨至粉末狀，再迅速移入無酶離心管，Trizol法提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度及純度。取RNA樣品，將其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，根據(jù)第一鏈cDNA合成試劑盒操作。依RT-qPCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系，在基因定量測(cè)定儀器上擴(kuò)增，反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃ 10 min，1次循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40次循環(huán)，可根據(jù)情況調(diào)整。擴(kuò)增后，采用比較循環(huán)閾值2-ΔΔCt法統(tǒng)計(jì)各基因的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）實(shí)驗(yàn)

將腎臟組織剪碎后放入研缽內(nèi)，倒入液氮迅速研磨至粉末狀，添加RIPA裂解液置于冰上充分裂解。通過低溫離心機(jī)12 000 轉(zhuǎn)/min離心20 min，收集上清液并根據(jù)BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度。取一定量蛋白與上樣緩沖液混合，100 ℃水浴加熱變性5 min。制備分離膠與濃縮膠，安裝固定好電泳裝置，將變性后的30 μg蛋白等量上樣至凝膠孔內(nèi)，電泳分離后再轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h。將膜與稀釋好的一抗（1∶1 000）共置于4 ℃下孵育過夜。次日，TBST清洗膜，再將其與稀釋好的對(duì)應(yīng)二抗（1∶5 000）置于室溫下共孵育2 h，TBST再次洗膜，在膜面上滴加ECL溶液，使試劑與膜充分接觸，避光孵育5 min。放入蛋白成像系統(tǒng)中采集圖像，以GADPH蛋白作為內(nèi)參，通過Image-Pro Plus軟件分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8.30軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t法，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 四組大鼠造模前后體質(zhì)量變化及腎臟質(zhì)量、腎臟系數(shù)比較

通過對(duì)四組大鼠造模前后體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，造模前四組大鼠體質(zhì)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。而在造模后，與對(duì)照組大鼠體質(zhì)量

比較，CaOx組較低（Plt;0.05），SB203580組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組大鼠體質(zhì)量較高（Plt;0.05，表2）。此外，與對(duì)照組比較，CaOx組大鼠腎臟質(zhì)量和腎臟系數(shù)均較高（Plt;0.05），SB203580組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組大鼠腎臟質(zhì)量和腎臟系數(shù)均顯著下降（Plt;0.05，表2）。

2.2 四組大鼠血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平比較

四組大鼠血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CaOx組血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平均顯著升高（Plt;0.05），SB203580組以上指標(biāo)與對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平均較低（Plt;0.05，表3）。

2.3 四組大鼠腎臟組織內(nèi)草酸鈣結(jié)晶形成情況比較

Von Kossa染色觀察四組大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化，可見對(duì)照組和SB203580組腎臟組織中未見黑色晶體（即結(jié)石），而CaOx組腎小管管腔內(nèi)有大量彌漫性結(jié)晶分布；相較于CaOx組，SB203580+CaOx組腎臟組織內(nèi)黑色結(jié)晶明顯減少（圖1）。

A：對(duì)照組；B：SB203580組；C：CaOx組；D：SB203580+CaOx組。

2.4 四組大鼠腎臟內(nèi)細(xì)胞凋亡情況比較四組大鼠腎臟組織內(nèi)綠色標(biāo)記細(xì)胞為TUNEL陽性染色，即代表細(xì)胞凋亡情況。與對(duì)照組比較，CaOx組腎臟組織內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著增加（Plt;0.05），而SB203580組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組腎臟組織內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著減少（Plt;0.05，圖2）。

TUNEL：原位末端標(biāo)記法；Merge：合并；DAPI：4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。

2.5 四組大鼠腎臟組織LC3B與Beclin-1陽性染色比較

免疫組化染色觀察腎臟組織內(nèi)LC3B與Beclin-1表達(dá)，與對(duì)照組比較，CaOx組腎臟組織內(nèi)LC3B與Beclin-1陽性表達(dá)面積占比顯著升高（Plt;0.05），而SB203580組中兩種蛋白陽性表達(dá)面積占比與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組腎臟組織內(nèi)LC3B與Beclin-1陽性表達(dá)面積占比較?。≒lt;0.05，圖3）。

A：LC3B在腎臟組織中的免疫組化染色結(jié)果（×100）；B：Beclin-1在腎臟組織中的免疫組化染色結(jié)果（×100）；C：四組腎臟組織LC3B陽性表達(dá)面積占比統(tǒng)計(jì)圖；D：四組腎臟組織Beclin-1陽性表達(dá)面積占比統(tǒng)計(jì)圖；與對(duì)照組比較，*Plt;0.05；與CaOx組比較，#Plt;0.05。

2.6 四組大鼠腎臟組織自噬-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子在mRNA水平上的表達(dá)比較

RT-qPCR測(cè)定四組大鼠腎臟組織自噬相關(guān)分子LC3B、Beclin-1、p62 mRNA及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子CHOP、GRP78 mRNA的表達(dá)變化。與對(duì)照組比較，CaOx組腎臟組織中LC3B、Beclin-1、CHOP、GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)（Plt;0.05），p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（Plt;0.05），SB203580組上述各基因表達(dá)量與對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組腎臟組織中LC3B、Beclin-1、CHOP、GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)（Plt;0.05），而p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（Plt;0.05，圖4）。

①對(duì)照組；

②SB203580組；

③CaOx組；

④SB203580+CaOx組；A：四組腎臟組織LC3B mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；B：四組腎臟組織Beclin-1 mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；C：四組腎臟組織p62 mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；D：四組腎臟組織CHOP mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；E：四組腎臟組織GRP78 mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；與對(duì)照組比較，*Plt;0.05；與CaOx組比較，#Plt;0.05。

Western blot測(cè)定結(jié)果同樣顯示，與對(duì)照組比較，CaOx組腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值顯著升高（Plt;0.05），Beclin-1、CHOP、GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（Plt;0.05），p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（Plt;0.05），SB203580組上述各蛋白表達(dá)量與對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；與CaOx組比較，SB203580+CaOx組腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值顯著降低（Plt;0.05），Beclin-1、CHOP、GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（Plt;0.05），而p62蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（Plt;0.05，圖5）。

①對(duì)照組；

②SB203580組；

③CaOx組；

④SB203580+CaOx組；A：Western blot電泳結(jié)果；B：四組腎臟組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值統(tǒng)計(jì)圖；C：四組腎臟組織Beclin-1蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；D：四組腎臟組織p62蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；E：四組腎臟組織CHOP蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；F：四組腎臟組織GRP78蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。與對(duì)照組比較，*Plt;0.05；與CaOx組比較，#Plt;0.05。

3 討 論

CaOx腎結(jié)石可誘發(fā)腎臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞壞死。使用不同濃度梯度CaOx處理人腎小管上皮細(xì)胞后，隨著處理濃度的增加或處理時(shí)間的延長，腎小管上皮細(xì)胞的存活率逐漸降低，細(xì)胞形態(tài)明顯損傷［9］。在晶體形成的初始階段，高水平的草酸鹽暴露可能會(huì)損害腎小管上皮細(xì)胞并引起氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量活性氧，進(jìn)而引起一系列的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，促使晶體沉淀并粘附在細(xì)胞膜上［10］。由此可見，腎小管上皮細(xì)胞的損傷是CaOx腎結(jié)石形成的重要原因。因此，明確CaOx腎結(jié)石形成的病理分子機(jī)制對(duì)于根治腎結(jié)石及預(yù)防結(jié)石的形成至關(guān)重要。

以往研究表明，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與CaOx腎結(jié)石患者腎臟內(nèi)，聚集、粘附在腎小管上皮細(xì)胞上的晶體能夠滲入到腎間質(zhì)中，誘導(dǎo)大量炎性細(xì)胞聚集，同時(shí)這些炎性細(xì)胞還能夠分泌炎性因子，進(jìn)而促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致腎結(jié)石的形成［11-12］。由此可見，腎間質(zhì)內(nèi)炎癥反應(yīng)是CaOx腎結(jié)石的重要發(fā)病機(jī)制，然而，CaOx誘導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)的具體分子機(jī)制卻尚未闡明。p38 MAPK是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，阻斷該信號(hào)通路可以抑制炎癥反應(yīng)。先前研究表明，CaOx腎結(jié)石形成過程中p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平上調(diào)［13］，由此推測(cè)，p38 MAPK信號(hào)通路可能參與CaOx腎結(jié)石形成。QI等［14］研究指出p38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)草酸鈣一水合物晶體誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E內(nèi)晶體粘附變化；GUZEL等［15］研究表明高草酸尿癥大鼠中p38 MAPK信號(hào)通路激活，這促進(jìn)了腎臟中草酸鹽結(jié)石形成的氧化過程；張智源等［16］研究發(fā)現(xiàn)在大鼠CaOx腎結(jié)石形成過程中p38 MAPK信號(hào)通路被激活，而使用金錢草提取物能夠抑制p38 MAPK通路從而抑制腎結(jié)石形成。以上結(jié)果提示，抑制p38 MAPK通路激活可作為抑制CaOx腎結(jié)石形成進(jìn)展的一項(xiàng)干預(yù)措施。因此，本研究選擇p38 MAPK抑制劑來阻斷該通路，探究這一作用是否對(duì)腎結(jié)石產(chǎn)生影響。SB203580是p38 MAPK的選擇性抑制劑，通過與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ATP結(jié)合口袋內(nèi)部或附近的非保守區(qū)域，抑制p38 MAPK活性，目前已在各種動(dòng)物模型研究中廣泛使用［17］。本研究結(jié)果顯示，較CaOx組，經(jīng)過SB203580處理的CaOx腎結(jié)石模型大鼠體質(zhì)量較高，腎臟質(zhì)量和腎臟系數(shù)較低，血清BUN、SCr及尿液NGAL、KIM-1水平均下降，此外，腎臟組織內(nèi)黑色晶體沉積明顯減少，凋亡細(xì)胞數(shù)目也減少，這說明采用SB203580抑制p38 MAPK活性能夠減少大鼠CaOx腎結(jié)石形成，并保護(hù)其腎功能。

自噬是一種高度保守且嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞事件，能夠從細(xì)胞中去除受損或老化的細(xì)胞器以及錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞正常代謝和穩(wěn)態(tài)［18］。自噬相關(guān)蛋白Beclin-1是一組進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)，通過形成自噬體的雙膜結(jié)合結(jié)構(gòu)來介導(dǎo)自噬功能。此外，LC3I通過半胱氨酸蛋白酶Atg3和Atg5參與的泛素樣反應(yīng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)化形式的LC3-Ⅱ，附在膜上以作為自噬體的結(jié)構(gòu)蛋白［19］。研究表明，在高尿酸血癥、缺血、順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷中，自噬增強(qiáng)能夠防止或減緩組織損傷［20-22］。然而，在CaOx腎結(jié)石中通過某些途徑激活自噬會(huì)加劇腎臟損傷，如高鈣尿癥和高草酸尿癥會(huì)增加細(xì)胞自噬并導(dǎo)致腎結(jié)石的形成，而自噬上調(diào)會(huì)加重氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)腎臟損傷［23］。因此，抑制自噬可能是CaOx腎結(jié)石的新治療策略。本研究檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)過SB203580處理的CaOx腎結(jié)石模型大鼠腎臟組織內(nèi)LC3B與Beclin-1陽性表達(dá)面積占比下降，LC3B mRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值降低，Beclin-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，p62 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，這一結(jié)果說明采用SB203580抑制p38 MAPK活性，抑制CaOx腎結(jié)石模型大鼠腎臟組織內(nèi)細(xì)胞自噬水平，這可能是發(fā)揮其保護(hù)CaOx腎結(jié)石模型大鼠的重要機(jī)制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。當(dāng)內(nèi)源性或外源性刺激包括缺乏分子伴侶或細(xì)胞能量、Ca2+缺乏、二硫鍵還原、蛋白質(zhì)突變和氧化還原穩(wěn)態(tài)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊蛋白功能紊亂，大量錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)積聚在腔內(nèi)，并引起一系列后續(xù)反應(yīng)，稱為ERS［24］。研究表明，草酸鹽的長期積累可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的ERS，促使活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多，ROS水平升高可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞變性、凋亡和壞死，使得基底膜暴露，從而引發(fā)CaOx腎結(jié)石中的晶體成核、聚集和生長［25］。GRP78是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中與激活轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、肌醇需要酶1α（inositol requiring enzyme 1α，IRE1α）和胰腺ER激酶（pancreatic ER kinase，PERK）相互作用，使這些跨膜蛋白保持在非活性配置中［26］。未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解和溶酶體介導(dǎo)的自噬消除錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)，從而協(xié)助蛋白質(zhì)合成。然而，當(dāng)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)不能管理錯(cuò)誤折疊和未折疊的蛋白質(zhì)時(shí)，細(xì)胞凋亡途徑被觸發(fā)，ERS常通過CHOP途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［27］。由此可見，ERS及其伴隨的細(xì)胞自噬與CaOx腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)過SB203580處理的CaOx腎結(jié)石模型大鼠腎臟組織內(nèi)CHOP、GRP78 mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯下調(diào)，由此說明采用SB203580抑制p38 MAPK活性降低了CaOx腎結(jié)石模型大鼠腎臟組織內(nèi)ERS反應(yīng)，進(jìn)而抑制CaOx腎結(jié)石模型大鼠病理進(jìn)程。

綜上所述，本研究結(jié)果表明p38 MAPK參與大鼠CaOx腎結(jié)石形成，采用p38 MAPK抑制劑SB203580直接作用CaOx腎結(jié)石大鼠能夠減輕腎臟功能損害，減少腎臟組織內(nèi)黑色晶體沉積與腎小管細(xì)胞凋亡，該保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)自噬-ERS途徑有關(guān)。本研究從經(jīng)典激酶途徑闡明腎結(jié)石形成和發(fā)展的機(jī)制，為CaOx腎結(jié)石的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)，但關(guān)于使用SB203580的生物安全性評(píng)價(jià)還需后續(xù)進(jìn)一步論證。此外，在CaOx腎結(jié)石形成中，進(jìn)一步激活p38 MAPK是否對(duì)CaOx腎結(jié)石形成發(fā)揮促進(jìn)作用，也有待后續(xù)探究。

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（編輯 郭楚君）