反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定五味香連丸中10 種成分含量

吳璐葉，楊正英，于上林

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 350000）

五味香連丸由黃連、木香、延胡索、吳茱萸、白芍5味藥材組方，主要用于治療腸胃濕熱引起的腹痛腹瀉、紅白痢疾、膿血相雜、里急后重等癥，療效確切［1］。方中，黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒功效，用于腸道炎癥及泌尿道感染的活性成分為鹽酸小檗堿、巴馬汀、黃連堿等生物堿類(lèi)化合物［2-3］；木香具有芳香健胃、行氣止痛功效，用于脾胃氣滯證、瀉痢等腸胃疾病，主要活性成分為倍半萜類(lèi)內(nèi)酯化合物木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯［4-5］；延胡索具有利氣、止痛、活血功效，主要活性成分為延胡索乙素［6-7］；白芍柔肝止痛，主要活性成分為芍藥苷［8］；吳茱萸具有散寒止痛、降逆止瀉功效，主要用于寒疝腹痛，主要成分為吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素［9-10］?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅用薄層色譜法對(duì)黃連和木香進(jìn)行鑒別，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。目前，針對(duì)五味香連丸的質(zhì)量研究?jī)H采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量［11］，以及黃連中鹽酸小檗堿的含量［12］，難以全面評(píng)價(jià)制劑的質(zhì)量。為此，本研究中采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時(shí)測(cè)定五味香連丸中鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、延胡索乙素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素和芍藥苷10 種成分的含量，為五味香連丸的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司），配有G1314B 型可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（VWD）；XSE-505型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；Milli-Q 型超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；KQ-500E 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為50 kHz）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713-202015，純度為85.9%），黃連堿對(duì)照品（批號(hào)為112026-201802，純度為94.2%），巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)為110732-201913，純度為85.8%），延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)為110726-202020，純度為99.3%），木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為111782-201807，純度為99.6%），去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為111894-202104，純度為95.1%），吳茱萸堿對(duì)照品（批號(hào)為110802-202111，純度為99.8%），吳茱萸次堿對(duì)照品（批號(hào)為110801-202109，純度為99.3%），檸檬苦素對(duì)照品（批號(hào)為110800-201707，純度為97.9%），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736-202246，純度為96.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；磷酸二氫鉀、三乙胺（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水；五味香連丸（北京同鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為20221126，20230109，20230302，每100粒重3 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［13-15］與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters SunFire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-含0.02%三乙胺的0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（B，用磷酸調(diào)pH 至3.5），梯度洗脫（0～19 min 時(shí)15%A →25%A，19～32 min 時(shí)25%A →65%A，32～60 min時(shí)65%A →78%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)不低于3 000。取混合對(duì)照品溶液適量，按此色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、延胡索乙素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素、芍藥苷目標(biāo)峰分離效果良好，分離度均大于1.5。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、延胡索乙素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素和芍藥苷對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加甲醇定容，分別制成每1 mL 分別含0.685 2，0.295 6，0.291 8，0.464 3，0.487 1，0.400 7，0.451 9，0.448 2，0.272 4，0.280 9 mg 的溶液，作為對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述對(duì)照品貯備液1.0 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品，研細(xì)，取2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇溶液50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率為500 W，頻率為45 kHz）40 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按樣品處方工藝，分別制備缺黃連、木香、延胡索、吳茱萸、白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液色譜中，鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、延胡索乙素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素和芍藥苷色譜峰保留時(shí)間與混合對(duì)照品溶液一致，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 反相高效液相色譜圖1.芍藥苷 2.延胡索乙素 3.黃連堿 4.巴馬汀 5.鹽酸小檗堿 6.檸檬苦素 7.吳茱萸堿 8.吳茱萸次堿 9.木香烴內(nèi)酯10.去氫木香內(nèi)酯A.混合對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C-G.陰性對(duì)照品溶液（分別缺黃連、木香、延胡索、吳茱萸、白芍）Fig.1 RP-HPLC chromatograms1.Paeoniflorin 2.Tetrahydropalmatine 3.Coptisine 4.Palmatine 5.Berberine hydrochloride 6.Limonin 7.Evodiamine 8.Rutaecarpine 9.Costunolide 10.DehydrocostuslactoneA.Mixed reference solution B.Test solution C-G.Negative reference solution（lacking Coptidis Rhizoma，Aucklandiae Radix，Corydalis Rhizoma，Euodiae Fructus，Paeoniae Radix Alba，respectively）

線(xiàn)性關(guān)系考察與定量限確定：精密吸取2.2項(xiàng)下各單一對(duì)照品貯備液0.2，0.5，0.8，1.0，1.2，1.5 mL，分別置20 mL 容量瓶中，加甲醇定容，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以各成分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、相應(yīng)質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸；并逐級(jí)稀釋混合對(duì)照品溶液，以信噪比（S/N）為10∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系考察與定量限確定結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test and determination of LOQ（n=6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、延胡索乙素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.19%，0.24%，0.32%，0.45%，0.28%，0.51%，0.37%，0.26%，0.31%，0.17%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20230109）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備0，5，10，20，24，48 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、延胡索乙素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.67%，0.74%，1.02%，0.79%，0.62%，0.81%，0.84%，0.77%，0.93%，0.59%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20230109）樣品適量，精密稱(chēng)定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、延胡索乙素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素和芍藥苷的平均含量分別為1.186 0，0.527 6，0.501 1，0.688 9，0.700 2，0.613 4，0.583 7，0.442 2，0.416 5，0.401 3 mg/ g，RSD分別為0.95%，1.24%，1.46%，1.33%，1.17%，1.09%，1.28%，1.52%，1.61%，1.11%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品6份，研細(xì)，取粉末1.0 g，精密稱(chēng)定，按1∶1（m/m）的比例精密加入2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批（批號(hào)分別為20221126，20230109，20230302）樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行2 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、延胡索乙素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素和芍藥苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of the content determination of 10 components in samples（mg/ g，n=2）

3 討論

3.1 提取方法選擇

考察了不同提取方法（浸漬過(guò)夜、超聲提取、回流提?。⑻崛r(shí)間（30，40，50 min），最終確定2.2 項(xiàng)下提取方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

對(duì)鹽酸小檗堿、黃連堿、巴馬汀、延胡索乙素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素和芍藥苷均在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果各成分均在225 nm 波長(zhǎng)附近有最大吸收，基線(xiàn)平穩(wěn)，且理論板數(shù)較高，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇225 nm。

3.3 色譜條件選擇

考察了甲醇、乙腈有機(jī)相和不同比例的磷酸二氫鉀溶液組成的流動(dòng)相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)甲醇體系樣品中各成分分離時(shí)間較長(zhǎng)；乙腈體系中10 種待測(cè)成分峰形有拖尾現(xiàn)象；添加三乙胺后色譜峰峰形均有改善，當(dāng)三乙胺體積分?jǐn)?shù)為0.02%時(shí)，樣品中待測(cè)成分色譜峰峰形良好，且各成分均達(dá)到完全分離，再增加三乙胺的體積分?jǐn)?shù)，各色譜峰峰形均無(wú)明顯改善。同時(shí)，考察不同色譜柱（Waters SunFire C18柱、Phenomenex Kinetex XB C18柱）、柱溫（30，35，40 ℃）對(duì)分離效果的影響。最終確定2.1項(xiàng)下色譜條件。

3.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果分析

預(yù)試驗(yàn)中，測(cè)定了樣品中黃連活性成分表小檗堿的含量，發(fā)現(xiàn)其含量較低，故未作為本研究中含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。由表3 可知，同一廠家不同批次產(chǎn)品中10 種成分的含量差異較小，含量從大到小依次為鹽酸小檗堿＞木香烴內(nèi)酯＞延胡索乙素＞去氫木香內(nèi)酯＞吳茱萸堿＞黃連堿＞巴馬汀＞吳茱萸次堿＞檸檬苦素＞芍藥苷。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了同時(shí)測(cè)定五味香連丸中10 種成分含量的RP-HPLC 法，并對(duì)3 批樣品進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果顯示，10 種成分的平均含量在本檢測(cè)條件下的范圍波動(dòng)較小，質(zhì)量穩(wěn)定。該方法簡(jiǎn)便可行、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性好，可用于同時(shí)測(cè)定五味香連丸中10種成分的含量。