一測多評法同時(shí)測定蒲元和胃膠囊中7 種成分含量

李懷偉，王 勁，任仲麗，朱偉堃，張 朋

（山東省菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東 菏澤 274000）

蒲元和胃膠囊由延胡索、香附、醋乳香、蒲公英、枯礬、甘草6 味藥材組方，具有行氣止痛、疏肝和胃等功效［1-3］。目前，蒲元和胃膠囊的研究主要集中于臨床療效及延胡索乙素含量測定［4］。2020 年版《中國藥典（一部）》中對蒲元和胃膠囊的質(zhì)量控制指標(biāo)主要為延胡索、香附、醋乳香、蒲公英、甘草藥材的薄層色譜（TLC）法定性鑒別和藥材的活性成分延胡索乙素（延胡索）、甘草酸（甘草）的含量測定，能較全面地控制藥品質(zhì)量，但檢驗(yàn)所用對照藥材和對照品較多，成本較高，且含量測定指標(biāo)較少。一測多評法通過建立內(nèi)參物與其他成分間的相對校正因子，同時(shí)測定多指標(biāo)成分［5-6］，可降低檢驗(yàn)成本，更全面控制制劑質(zhì)量。本研究中建立了同時(shí)測定蒲元和胃膠囊中延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素（內(nèi)參物）、甘草苷、甘草酸銨含量的一測多評法，以期為評價(jià)制劑質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-2030C 3D 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XS105 DualRange 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；PRD-S-Q277 型超聲波清洗器（杭州超聲波有限公司，功率為600 W，頻率為42 kHz）。

1.2 試藥

延胡索乙素對照品（批號為110726-202020，含量為99.3%），鹽酸巴馬汀對照品（批號為110732-201913，含量為85.7%），咖啡酸對照品（批號為110885-201703，含量為99.7%），木犀草素對照品（批號為111520-202107，含量為96.3%），甘草苷對照品（批號為111610-202209，含量為95.2%），甘草酸銨對照品（批號為110731-202122，含量為94.4%），α-香附酮對照品（批號為110748-202117，含量為99.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；蒲元和胃膠囊（市售，規(guī)格為每粒0.25 g，批號分別為20210903，20220201，20220601）；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時(shí)10%A，10～35 min 時(shí)10%A →25%A，35～45 min 時(shí)25%A →40%A，45～75 min 時(shí)40%A →95%A，75～80 min 時(shí)95%A →10%A，80～85 min 時(shí)10%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：237 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

取延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.334 1，0.446 0，0.678 5，0.766 5，1.001 2，1.502 0，4.256 1 mg/mL 的對照品貯備液；取上述對照品貯備液各1 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為26.68，8.92，13.57，15.33，20.02，30.04，85.12 μg/mL 的混合對照品溶液。

取20 粒樣品內(nèi)容物，混勻，取3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為600 W，頻率為42 kHz）40 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，即得供試品溶液。

按樣品處方工藝分別制備缺延胡索、香附、蒲公英和甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，分別按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果各成分的色譜峰分離度均大于1.5，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.咖啡酸 2.甘草苷 3.延胡索乙素 4.鹽酸巴馬汀 5.木犀草素 6.甘草酸銨 7.α-香附酮A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C-F.陰性對照品溶液（分別為缺延胡索、香附、蒲公英、甘草）Fig.1 HPLC chromatograms1.Caffeic acid 2.Liquiritin 3.Tetrahydropalmatine 4.Palmatine hydrochloride 5.Luteolin 6.Ammonium glycyrrhizinate 7.α-CyperoneA.Mixed reference solution B.Test solution C-F.Negative reference solution（lacking Corydalis Rhizoma，Cyperi Rhizoma，Taraxaci Herba，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，respectively）

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2 項(xiàng)下延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨對照品貯備液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 7種成分線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation of seven components（n=6）

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.35%，0.77%，0.92%，1.65%，0.88%，0.52%，1.03%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號20210903）6 份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨含量的RSD分別為0.99%，0.91%，1.83%，0.76%，1.25%，1.37%，1.05%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于0，4，8，12，16，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.27%，0.55%，0.92%，1.36%，0.34%，1.19%，1.30%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨的含量分別為每粒50.47，31.00，15.74，20.50，67.60，112.47，362.83 μg，批號為20210903）的樣品9 份，研細(xì)，每份1.5 g，精密稱定，分別加入新配制的混合對照品溶液（延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為0.153 5，0.106 2，0.051 6，0.063 5，0.210 2，0.353 0，1.028 8 mg/mL）1.0，2.0，3.0 mL，各3 份，按2.2 項(xiàng)下制備供試品溶液法，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定。結(jié)果延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨的平均回收率分別為99.09%，97.34%，97.42%，96.85%，98.60%，99.20%，99.09%，RSD分別為0.72%，1.68%，1.75%，1.29%，0.69%，0.79%，0.97%（n=9），表明結(jié)果準(zhǔn)確度良好。

2.4 相對校正因子建立

相對校正因子：精密吸取線性關(guān)系考察項(xiàng)下系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。以木犀草素為內(nèi)參物，按公式fk/s=（Wk×As）/（Ws×Ak）計(jì)算相對校正因子。式中，As為內(nèi)參物峰面積，Ws為內(nèi)參物濃度，Ak為待測成分峰面積，Wk為待測成分質(zhì)量濃度。計(jì)算延胡索乙素（Y）、鹽酸巴馬?。˙）、α-香附酮（X）、咖啡酸（K）、甘草苷（GG）、甘草酸銨（GA）、木犀草素（M）的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 6種成分的相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of six components

相對校正因子耐用性考察：取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別考察不同型號高效液相色譜儀（Agilent 1260 InfinityⅡ型、Shimadzu LC-2030C 3D 型）、不同型號色譜柱（Diamonsil C18柱、Welch Ultimate XB-C18柱、Zafex JX-C18柱，規(guī)格均為250 mm × 4.6 mm，5 μm）、不同流速（0.9，1.0，1.1 mL/min）和不同柱溫（25，30，35 ℃）對相對校正因子的影響。結(jié)果見表3，表明不同色譜條件下延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、甘草苷、甘草酸銨的相對校正因子無顯著影響。

表3 不同色譜條件下各成分的相對校正因子Tab.3 Relative correction factor of each component under different conditions

2.5 待測成分色譜峰定位

取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，采用相對保留時(shí)間（RRT）法對各成分色譜峰進(jìn)行定位，以木犀草素為內(nèi)參物，分別按公式RRT=RTk/RTs計(jì)算延胡索乙素（Y）、鹽酸巴馬?。˙）、α-香附酮（X）、咖啡酸（K）、甘草苷（GG）、甘草酸銨（GA）的RRT。式中，RTs為內(nèi)參物保留時(shí)間，RTk為待測成分保留時(shí)間。結(jié)果見表4，表明不同條件下各成分RRT無顯著差異。

表4 不同色譜條件下各成分的相對保留時(shí)間Tab.4 Relative retention time of each component under different conditions

2.6 一測多評法與外標(biāo)法測定含量

取3批（批號分別為20210903，20220201，20220601）樣品各適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨的峰面積，按一測多評法和外標(biāo)法分別計(jì)算各成分的含量。結(jié)果相對誤差（RE）的絕對值均小于2.0%，表明2種方法的含量計(jì)算結(jié)果無顯著差異。詳見表5。

表5 3批樣品一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較（μg/粒）Tab.5 Comparison of the results of three batches determined by ESM and QAMS（μg/ capsule）

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分與內(nèi)參物選擇

蒲元和胃膠囊組方中，延胡索活血散瘀、鎮(zhèn)靜止痛，香附調(diào)經(jīng)止痛、疏肝解郁，蒲公英清熱解毒、消腫散結(jié)，甘草補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳［7-14］。分別選取4 味藥材中主要活性成分延胡索乙素、鹽酸巴馬?。ㄑ雍鳎?、α-香附酮（香附）、咖啡酸、木犀草素（蒲公英）、甘草苷、甘草酸銨（甘草）為定量分析的指標(biāo)性成分，以全面反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量。木犀草素對照品性質(zhì)穩(wěn)定、廉價(jià)易得，色譜峰峰形良好，附近干擾成分少，符合內(nèi)參物的選擇要求［5，15-16］，故選擇木犀草素作為內(nèi)參物。

3.2 供試品溶液處理方法選擇

分別考察不同提取溶液（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇溶液）、不同提取方式（超聲提取、回流提?。?、不同提取時(shí)間（20，30，40，50 min）對延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、α-香附酮、咖啡酸、木犀草素、甘草苷、甘草酸銨提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取對各成分的綜合提取效率高，且操作方便，提取40 min 和50 min 時(shí)的效果差異不大。因此，選擇甲醇超聲提取40 min。

3.3 色譜條件選擇

考察以甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰拖尾嚴(yán)重，加入磷酸后可明顯改善峰形，乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫對7 種成分的分離效果最佳?？疾炝?37，254，280，323，350 nm波長處的響應(yīng)值，結(jié)果237 nm波長處可兼顧7種成分，故選擇237 nm為檢測波長。

3.4 方法評價(jià)

本研究中建立的一測多評法操作簡便、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可同時(shí)測定蒲元和胃膠囊中7種成分的含量，且測定結(jié)果與外標(biāo)法測定結(jié)果無顯著差異。