芪龍活絡(luò)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

魏 玲，丁小凡，張賀廷，陳 浩，劉 暢，席永寬

（1.安徽省阜陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 阜陽(yáng) 236025；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031）

芪龍活絡(luò)顆粒（注冊(cè)批號(hào)Z20210053000）為安徽省阜陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院開發(fā)的院內(nèi)制劑，由丹參、紅花、黃芪、膽南星、川牛膝、雞血藤、石菖蒲、地龍組方，具有益氣、活血、通絡(luò)功效。臨床用于治療中風(fēng)病、眩暈等氣虛血瘀證。方中，黃芪、丹參為君藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿脫毒等功效［1］；丹參活血祛瘀，紅花活血通經(jīng)，共為臣藥；川牛膝逐瘀通經(jīng)、引藥下行，雞血藤活血補(bǔ)血，膽南星息風(fēng)定驚，共為佐使藥［2-3］。諸藥合用，共奏補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之效。臨床研究發(fā)現(xiàn)，黃芪治療腦卒中的療效較好［1］。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參有保護(hù)心血管、降血壓的作用，紅花中的羥基紅花素A 被廣泛用于治療腦血管疾?。?］，黃芪-丹參是中藥治療缺血性腦卒中的主要藥對(duì)，臨床療效較好［5］。為更好地控制制劑質(zhì)量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)黃芪、川牛膝、雞血藤進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定丹參中丹酚酸B的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260Ⅱ型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司），配有二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；梅特勒ME55 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；JK-DY300 型超聲波清洗器（合肥金克尼機(jī)械制造有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

丹酚酸B 對(duì)照品（批號(hào)為111562-201916，純度為96.6%），雞血藤對(duì)照藥材（批號(hào)為121173-201805），川牛膝對(duì)照藥材（批號(hào)為121065-201707），黃芪對(duì)照藥材（批號(hào)為21462-201705），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；芪龍活絡(luò)顆粒（醫(yī)院制劑，批號(hào)分別為220501，220502，220701，220702，220801）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司，批號(hào)為20220406）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

川牛膝［6-7］：取樣品3 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用乙酸乙酯振蕩提取2 次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取川牛膝對(duì)照藥材1 g，加甲醇15 mL，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。按處方工藝取不含川牛膝的處方藥材，制備陰性對(duì)照藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各4μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-二氯甲烷-丙酮-甲酸（8∶4∶1∶0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖1.陰性對(duì)照品溶液 2.對(duì)照藥材溶液 3-5.供試品溶液A.川牛膝 B.黃芪 C.雞血藤Fig.1 TLC chromatograms1.Negative reference solution 2.Reference medicinal materials 3-5.Test solutionA.Cyathulae Radix B.Astragali Radix C.Spatholobi Caulis

黃芪［8-10］：取樣品10 g，研細(xì)，加甲醇50 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇振蕩提取2 次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次20 mL，棄去氨液，用正丁醇液回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪對(duì)照藥材1 g，加甲醇15 mL，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。按處方工藝取不含黃芪的處方藥材，制備陰性對(duì)照藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（10∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏蒸后置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 B。

雞血藤［11-12］：取樣品5 g，研細(xì)，加水30 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min）5 min，取上清液，用乙酸乙酯振蕩提取2 次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，用乙酸乙酯液回收溶劑至干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取雞血藤對(duì)照藥材0.5 g，加水30 mL，煎煮30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振蕩提取2 次，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。按處方工藝取不含雞血藤的處方藥材，制備陰性對(duì)照藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-甲酸乙酯-冰醋酸-甲酸-異丙醇（5∶5∶0.5∶0.5∶1，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 HPLC 法測(cè)定丹酚酸B 含量

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)不低于4 000［13-14］。

2.2.2 溶液制備

取丹酚酸B 對(duì)照品12.92 mg，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加75%甲醇定容，制成質(zhì)量濃度為62.4μg/mL的對(duì)照品溶液。取樣品（批號(hào)為220801）2 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按處方工藝取不含丹參的處方藥材，制備不含丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)［15］：分別吸取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在丹酚酸B對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，且陰性對(duì)照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.丹酚酸BA.對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對(duì)照品溶液Fig.2 HPLC chromatograms1.Salvianolic acid BA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solution

線性關(guān)系考察：設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣程序，分別吸取2.2.2項(xiàng)下丹酚酸B對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為62.4μg/mL）1，2，5，10，20 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=815.52X+0.27（r=1.000，n=5）。結(jié)果表明，丹酚酸B 進(jìn)樣量在0.062 4～1.248 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為220801）樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.85%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為220801）樣品適量，精密稱定，平行6 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果丹酚酸B 的平均含量為1.26 mg/ g，RSD為1.92%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為220801）2.0 g，精密稱定，平行6 份，加丹酚酸B 對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為62.4 μg/ mL）25 mL，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取5批（批號(hào)分別為220501，220502，220701，220702，220801）樣品各適量，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中丹酚酸B 的含量分別為1.09，1.24，1.27，1.19，1.32 mg/ g。綜合考慮，擬訂芪龍活絡(luò)顆粒中丹酚酸B的含量應(yīng)不低于1.0 mg/g。

3 討論

3.1 TLC 鑒別

考察藥材選擇：在前期小試試驗(yàn)中均能鑒別出紅花、石菖蒲藥材，且陰性對(duì)照無干擾，但中試試驗(yàn)后的檢驗(yàn)中均未檢出。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，紅花中主要活性物質(zhì)羥基紅花黃色素A 為水溶性物質(zhì)［16］，長(zhǎng)時(shí)間在高溫環(huán)境中會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而有所降解［17-18］。石菖蒲主要活性物質(zhì)有苯丙素類、酚類及揮發(fā)油類［19］。我院制劑室的提取設(shè)備相對(duì)陳舊，導(dǎo)致提取時(shí)間變長(zhǎng)，提取溫度過高，無法進(jìn)行TLC 鑒別。膽南星進(jìn)行TLC 鑒別時(shí)陰性對(duì)照干擾較大。故紅花、石菖蒲、膽南星均暫不列入本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

TLC 鑒別條件選擇：前期研究中，對(duì)芪龍活絡(luò)顆粒中川牛膝、黃芪、丹參、紅花、膽南星、地龍、膽南星、石菖蒲進(jìn)行TLC 鑒別，發(fā)現(xiàn)川牛膝、黃芪、雞血藤TLC 斑點(diǎn)顯色清晰，且陰性對(duì)照無干擾，能較好地鑒別制劑中的川牛膝、黃芪、雞血藤藥材?！吨袊?guó)藥典》中的TLC鑒別方法能較好地鑒別川牛膝和黃芪，但需要過柱［20］，方法煩瑣，故選擇本研究中2.1 項(xiàng)下方法進(jìn)行鑒別。通過考察不同類型的硅膠板發(fā)現(xiàn)，高效硅膠G 板與普通硅膠G 板均能較好分離川牛膝、黃芪、雞血藤，且陰性對(duì)照無干擾。2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中川牛膝、黃芪、雞血藤點(diǎn)樣量分別為5 μL、5～10 μL、5～10μL［20］。通過考察點(diǎn)樣量發(fā)現(xiàn)，芪龍活絡(luò)顆粒中川牛膝、雞血藤點(diǎn)樣量在3～4μL 時(shí)具有較好的斑點(diǎn)，超過5 μL 后原點(diǎn)處易出現(xiàn)溶劑擴(kuò)散現(xiàn)象。故點(diǎn)樣量選擇2～5μL。

3.2 色譜條件考察

前期研究中，通過對(duì)比2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中丹參的色譜條件，并參考文獻(xiàn)［12-13］，最終選擇2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中丹參的色譜條件，并調(diào)整流動(dòng)相比例，最終確定2.2.1項(xiàng)下色譜條件。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析

芪龍活絡(luò)顆粒由8味中藥材組方，藥味中所含活性物質(zhì)較多。中藥復(fù)方煎煮后往往發(fā)生較多的化學(xué)反應(yīng)與生物活性轉(zhuǎn)化，故僅測(cè)定單一物質(zhì)成分含量無法全面評(píng)價(jià)藥品的質(zhì)量。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，制備過程中對(duì)顆粒的烘干溫度、時(shí)間、輔料加入量進(jìn)行考察，優(yōu)化了提取工藝與顆粒劑制備工藝。由5批樣品含量測(cè)定結(jié)果可知，樣品中丹酚酸B 含量為1.09～1.32 mg/ g，兩者相差0.23 mg/g，通過查看批生產(chǎn)記錄，發(fā)現(xiàn)樣品出膏率也存在一定差異，其含量差異變化有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法專屬性好、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于芪龍活絡(luò)顆粒的質(zhì)量控制。