超細(xì)粉碎聯(lián)合半仿生技術(shù)處理的沒(méi)食子殘留物物理性質(zhì)和生物活性分析*

艾 林，李 愷，劉 捷，張若冰

（1.中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)空軍第九八六醫(yī)院，陜西 西安 710054；2.陜西省藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安 710065）

中草藥的藥物活性成分主要存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核間［1-2］。目前，超細(xì)研磨技術(shù)可通過(guò)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)獲得活性成分，快速、有效地發(fā)揮藥物作用，廣泛應(yīng)用于中藥加工［3-4］。振動(dòng)式超聲波研磨機(jī)可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)草藥材料與研磨介質(zhì)進(jìn)行混合、強(qiáng)力粉碎、擠壓和剪切，打破植物或動(dòng)物藥材的細(xì)胞壁，提高生物利用度，改變材料的物理和化學(xué)性質(zhì)（包括水分含量、水溶性等）［5-6］。中草藥半仿生提取方法模擬了藥物通過(guò)胃腸道運(yùn)輸和吸收的環(huán)境，用不同pH值的溶劑和/或酶提取中草藥中的活性成分，最大限度地發(fā)揮中藥成分的功效，具有良好的應(yīng)用前景［7］。中藥沒(méi)食子是一種在殼斗科Fagaceae植物沒(méi)食子樹(shù)Quercus infectioriaOlivier 上產(chǎn)生的幼蟲蟲癭Cynips gallae tinctoriaeOlivier［8-9］。沒(méi)食子的有效成分沒(méi)食子酸及其衍生物具有多種藥用和工業(yè)用途，具有抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗動(dòng)脈硬化、抗血管生成、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、防輻射等作用［10］。研究表明，通過(guò)優(yōu)化提取方法獲得的沒(méi)食子殘留物（RTG）中含有沒(méi)食子酸和鞣花酸，可利用沒(méi)食子廢渣制成生物炭吸附苯酚污染物，實(shí)現(xiàn)廢渣的資源化利用［11-12］。目前，半仿生技術(shù)和振動(dòng)型超聲波研磨聯(lián)合應(yīng)用對(duì)RTG 的影響還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究中采用半仿生技術(shù)對(duì)振動(dòng)型超聲波研磨的RTG 進(jìn)行處理，探討經(jīng)半仿生技術(shù)提取的RTG的物理性質(zhì)和活性成分的變化，以及RTG的抗氧化能力，為后續(xù)將RTG 進(jìn)行二次開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，同時(shí)為提高沒(méi)食子的藥用產(chǎn)品質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：LMJ400型超細(xì)振動(dòng)研磨機(jī)（無(wú)錫富島科技股份有限公司）；S3500 型粒度分析儀（美國(guó)Microtrac 股份有限公司）；D180 型CO2培養(yǎng)箱（深圳市瑞沃徳生命科技有限公司）；IX71型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司）；S3500 型粒度分析儀（美國(guó)Microtrac 股份有限公司）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技＜中國(guó)＞有限公司）。

試藥：沒(méi)食子（中國(guó)新疆奇康哈博維藥有限責(zé)任公司，批號(hào)為20161112）；2，4，6-三（2-吡啶）-1，3，5-三嗪（TPTZ，批號(hào)為T1253），1，1-二苯基-2-苦味酸肼自由基（DPPH，批號(hào)為300267），水楊酸標(biāo)準(zhǔn)液（批號(hào)為W398500），F(xiàn)olin-Ciocalteu 酚試劑（批號(hào)為F9252），DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)為D0822），胎牛血清（FBS，批號(hào)為TMS-016），2，3-雙（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四氮唑-5-甲酰苯胺（XTT，批號(hào)為X4251），均購(gòu)于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；青霉素鈉（愛(ài)必信＜上海＞生物科技有限公司，批號(hào)為abs47048009）；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

細(xì)胞：菌株牙齦單胞卟啉菌（ATCC 33277，P.gingivalis）和變形鏈球菌（ATCC 25175，S.mutans）由中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第九八六醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。

1.2 樣品處理與分組

樣品處理：利用粉碎機(jī)粉碎沒(méi)食子，按料液比1∶10（g/ mL）加水，于80 ℃溫度下浸提3 次，每次1 h，水提后，得殘留物，干燥，得RTG。利用圓盤研磨機(jī)粗磨，在25 ℃溫度下超細(xì)研磨機(jī)研磨成粉末。

分組：使用不同直徑的篩子進(jìn)行篩分RTG 粉末，利用粒度分析儀按顆粒粒徑分為A 組（＜100 μm RTG）、B 組（100～300 μm RTG）和C 組（＞300 μm RTG），每個(gè)粉末樣品至少記錄3 次測(cè)量結(jié)果。取濃鹽酸234 mL，用水稀釋至1 000 mL，置1 000 mL 容量瓶中，加16.4 mL 稀鹽酸和800 mL 水，充分混合，振蕩，加水稀釋至1 000 mL，得鹽酸緩沖液（pH=2）。取不同粒徑RTG 樣品各1 g，精密稱定，分別加50 mL 鹽酸緩沖液和純凈水，置37 ℃恒溫防光水浴中保持30 min，濾過(guò)，得鹽酸緩沖液組和水處理組溶液。以不含RTG 的水或鹽酸緩沖液為基線組。

1.3 物理性質(zhì)

RTG 水分：清洗稱量皿，烘干至恒定質(zhì)量，稱取樣品，放入100～105 ℃的烘箱中靜置1.5 h，冷卻后稱定質(zhì)量，再次烘干0.5 h，至恒定質(zhì)量，計(jì)算水分。水分（%）=（G2-G1）/W。式中，G1為烘干至恒定質(zhì)量后稱量皿的質(zhì)量（g），G2為烘干至恒定質(zhì)量后稱量皿和樣品的質(zhì)量（g），W為樣品質(zhì)量（g）。

總灰分：取不同粒徑RTG 樣品（1 ± 0.1）g，均勻攤平在預(yù)先灼燒至質(zhì)量恒定的灰皿中，放入預(yù)熱不超過(guò)100 ℃的馬弗爐中緩慢升溫至約500 ℃，保持30 min后繼續(xù)升至（815±10）℃，灼燒1 h后冷卻5 min，置干燥器中冷卻至室溫，至恒定質(zhì)量。以最后1次灼燒后的質(zhì)量為計(jì)算依據(jù)。

水溶性試驗(yàn)：將RTG 樣品分散在蒸餾水中（1∶50，m/V），并于40，60，80，100 ℃溫度的水浴中混合45 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min）20 min［13］，取上清液，干燥，稱定質(zhì)量，計(jì)算水溶性指數(shù)（WSI）。WSI（%）=A/B×100%。式中，A 為干燥后上清液的質(zhì)量（g），B為粉末的質(zhì)量（g）。

其他物理性質(zhì)：采用智能粉末積分儀檢測(cè)RTG 樣品的休止角、滑動(dòng)角、碰撞角、體積密度、振實(shí)密度等物理特性。每次至少重復(fù)測(cè)試3次。

RTG 樣品總多酚含量（TPC）測(cè)定：取RTG 樣品1 g，加50 mL 鹽酸緩沖液和純凈水，于37 ℃的恒溫防光水浴中保持30 min，濾過(guò)，獲得提取物，稀釋，測(cè)定TPC。揮發(fā)提取物，用無(wú)菌水溶解，0.22μm 微孔無(wú)菌濾膜濾過(guò)，用于抑菌試驗(yàn)。

細(xì)胞增殖試驗(yàn)：選取患者7例，其中男3例，女4例；年齡（15.4±3.6）歲。收集7 例患者拔除的正畸前磨牙和/或第三磨牙，搔刮牙根獲得正常牙周組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后剪為1～2 mm3的組織塊。本研究方案已獲中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第九八六醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)為202108006）。置DMEM（含50 mg/ mL 慶大霉素、50 mg/ mL 兩性霉素B 和10%FBS）培養(yǎng)基中，于CO2培養(yǎng)箱（5%CO2、37 ℃、飽和濕度）中培養(yǎng)至貼壁生長(zhǎng)。采用胰蛋白酶消化法（2%胰蛋白酶，0.2%EDTA）消化收集人齒根膜韌帶成纖維細(xì)胞（HPDLF），傳代培養(yǎng)，取第2～3 代的HPDLF 試驗(yàn)。將HPDLF 以105個(gè)/ mL 接種于96 孔板，加入100 μL DMEM 和10% FBS，CO2培養(yǎng)箱（5% CO2、37 ℃、飽和濕度）孵育24 h。去培養(yǎng)基，加入試驗(yàn)樣品，靜置2 h，吸棄溶液。將XTT 試劑加入孔中，37 ℃溫度下孵育4 h，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD510），每組重復(fù)測(cè)量3 次，計(jì)算平均值。

抗氧化能力：1）自由基清除試驗(yàn)。將0.1 mmol/ L DPPH 溶解于100%乙醇中，取100 μL，置100%乙醇（0.12～1.65 mg/mL）中，并與100 μL 新制備的DPPH充分混合，避光孵育30 min，記錄OD510。計(jì)算清除DPPH 自由基的能力。DPPH（%）=Ai-（A-Aj）/Ai。式中，Ai為沒(méi)有樣品的DPPH 溶液的吸光度，A為與DPPH溶液混合的測(cè)試樣品的吸光度，Aj為沒(méi)有DPPH 溶液樣品的吸光度。本研究中采用半數(shù)抑制濃度（IC50）對(duì)RTG的抗氧化活性進(jìn)行分析，IC50值越低，抗氧化活性越強(qiáng)。2）羥基自由基清除試驗(yàn)。取10 mmol/ L FeSO41 mL、10 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL、0.31～2.83 g/mL的RTG提取物溶液1 mL、30%H2O2200μL置試管中混合，振蕩，于37 ℃水浴中孵育45 min，冷卻后測(cè)量OD510，計(jì)算羥基自由基清除活性（HRSA）。HRSA（%）=（A0-A1）/A0× 100%。式中，A0為對(duì)照的吸光度，A1為測(cè)試樣品的吸光度。采用IC50對(duì)RTG 的抗氧化活性進(jìn)行分析，IC50值越低，抗氧化活性越強(qiáng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以X±s表示，組間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般物理性質(zhì)

隨著RTG 粒徑的增加（P＜0.05），水分含量降低，總灰分增加（P＜0.05），體積密度升高（P＜0.05），休止角度、滑動(dòng)角度和崩潰角度減?。≒＜0.05），振實(shí)密度升高（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 不同粒徑RTG的一般物理性質(zhì)Tab.1 General physical characteristics of RTG with different particle sizes

2.2 水溶性

于40，60，80，100 ℃下，不同粒徑RTG在1 h內(nèi)的水溶性曲線見(jiàn)圖1。顆粒粒徑相同時(shí)，水溶性隨溫度的升高而升高（P＜0.05）；溫度相同時(shí)，水溶性隨粒徑的增加而降低（P＜0.05）。

圖1 不同粒徑對(duì)RTG水溶性的影響注：不同粒徑兩兩比較，aP ＜ 0.05；不同溫度兩兩比較，bP ＜0.05。Fig.1 Effects of RTG with different particle sizes on WSINote：Two-by-two comparisons for different particle sizes，aP ＜ 0.05；two-by-two comparisons for different temperature groups，bP ＜0.05.

2.3 總多酚含量

鹽酸緩沖液組總多酚含量顯著高于水處理組（P＜0.05），B 組和C 組總多酚含量均顯著高于A 組（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理?xiàng)l件下RTG中總多酚含量注：與水處理組比較，cP ＜0.05。圖3、圖5、圖6同。Fig.2 Total polyphenol content in RTG under different treatment conditionsNote：Compared with those in the water treatment group，cP ＜0.05（for Fig.2-3，and Fig.5-6）.

2.4 細(xì)胞增殖

與基線組比較，經(jīng)水處理后的A 組和B 組的OD510顯著升高（P＜0.05），鹽酸緩沖液組的OD510值顯著升高（P＜0.05），且粒徑越小，增殖作用越明顯（P＜0.05）；與水處理組比較，鹽酸緩沖液組的OD510值顯著升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞增殖情況（×40）Fig.3 Cell proliferation under different treatment conditions（× 40）

圖4 不同處理?xiàng)l件下RTG細(xì)胞增殖情況注：與C組比較，dP ＜0.05；與基線組比較，eP ＜0.05。Fig.4 Effects of RTG on cell proliferation under different treatment conditionsNote：Compared with those in group C，dP ＜ 0.05；Compared with those in the baseline group，eP ＜0.05.

2.5 抗氧化活性

DPPH 自由基清除活性：隨著粒徑的增加，清除活性減?。≒＜0.05）；鹽酸緩沖液組清除活性顯著優(yōu)于水處理組（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖5。

圖5 不同處理?xiàng)l件下RTG的DPPH自由基清除活性Fig.5 DPPH radical scavenging activity of RTG under different treatment conditions

羥基自由基清除活性：隨著粒徑的減小，清除活性增加（P＜0.05）；鹽酸緩沖液處理組清除活性顯著優(yōu)于水處理組（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖6。

圖6 不同處理?xiàng)l件下RTG的羥基自由基清除活性Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of RTG under different treatment conditions

3 討論

3.1 對(duì)RTG 物理性質(zhì)的影響

近年來(lái)，超細(xì)研磨技術(shù)在中藥加工中得到了廣泛應(yīng)用［14］，在農(nóng)業(yè)、電子材料、節(jié)能技術(shù)和其他行業(yè)中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用［15-16］。振動(dòng)式超聲波研磨機(jī)可改變材料的物理和化學(xué)性質(zhì)，包括水分含量、水溶性等［17］。超細(xì)研磨會(huì)導(dǎo)致藥物的物理和生物特性發(fā)生重要變化，提高機(jī)體的吸收率和生物利用度，增強(qiáng)療效，減少毒副作用［18-19］。

不同粒徑RTG 的水分含量隨粒徑的減少而增加（P＜0.05）。推測(cè)是由于較大的比表面積促進(jìn)與空氣中水分的吸收。高溫燃燒后，有機(jī)成分揮發(fā)后剩余的無(wú)機(jī)成分為純灰燼，小顆粒尺寸允許完全燃燒，顆粒直徑小的總灰分含量較少。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)平均粒徑減小時(shí)，RTG 的體積密度和振實(shí)密度均顯著降低（P＜0.05），這可能是由于粒徑的減小導(dǎo)致了顆粒間空隙的縮小。粒徑小于100μm的粉末的休止角、滑動(dòng)角和崩潰角均顯著大于較大粒徑的粉末（P＜0.05），表明經(jīng)過(guò)超細(xì)研磨RTG 的流動(dòng)性隨顆粒尺寸的減小而減弱，推測(cè)可能是由于RTG在保濕后易凝結(jié)，聚合物傾向于以“金字塔”的角度排列。本研究結(jié)果顯示，中草藥粉末的質(zhì)量可通過(guò)顆粒大小、體積密度、振實(shí)密度、流動(dòng)性來(lái)控制。顆粒粒徑相同時(shí)，水溶性隨溫度的升高而升高；溫度相同時(shí)，水溶性隨粒徑的增加而減小。推測(cè)是由超細(xì)研磨后表面積和表面能的增加而導(dǎo)致。

3.2 對(duì)TRG 生物活性的影響

本研究中通過(guò)振動(dòng)式超細(xì)研磨機(jī)制備了不同粒徑的粉末，研究了不同粒徑對(duì)RTG 成分、物理性能和抗氧化性能的影響。結(jié)果顯示，超細(xì)研磨能有效降低RTG 的粒徑、物理性質(zhì)，包括含水量、水溶性、總灰分、體積密度、振實(shí)密度、休止角、滑動(dòng)角和崩潰角，有助于產(chǎn)生DPPH、羥基自由基的清除活性。同時(shí)，本研究中采用半仿生技術(shù)提取RTG，采用XTT 法評(píng)估細(xì)胞增殖能力，通過(guò)測(cè)量線粒體脫氫酶活性，可顯示細(xì)胞的生理狀況信息。結(jié)果顯示，RTG含有活性成分，且粒徑越小增殖作用越明顯，經(jīng)鹽酸緩沖液處理優(yōu)于水處理。未來(lái)研究中將繼續(xù)確定RTG是否可在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)提高細(xì)胞活力。