蒙藥經(jīng)典方劑肉豆蔻-5 對(duì)心肌梗死的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

張 瑤，付賀青，劉 晶，聶慧娟，董 玉，4，劉天龍△

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)心血管疾病臨床和基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010130；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

心肌梗死（MI）是導(dǎo)致我國人口非正常死亡的主要原因［1］。在缺血條件下，心肌細(xì)胞發(fā)生死亡，心臟功能出現(xiàn)進(jìn)行性降低，最終形成心力衰竭（簡稱心衰）［2］。雖然介入治療能恢復(fù)缺血部位的血供，減少梗死面積和恢復(fù)心臟功能，但由于心肌細(xì)胞的不可再生性，介入治療后的短期和長期不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)顯著增加［3］。心肌成纖維細(xì)胞在缺血條件下向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，發(fā)生表型轉(zhuǎn)換的成纖維細(xì)胞的增殖屬性顯著增加，且表達(dá)大量的細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、膠原等，這些細(xì)胞因子在心肌纖維化的形成過程中發(fā)揮了重要作用［4-5］。在正常生理?xiàng)l件下，心肌細(xì)胞主要通過脂肪酸在線粒體中的氧化磷酸化合成腺苷三磷酸（ATP）以維持心臟的能量消耗；在缺血條件下，心臟的能量代謝模式發(fā)生轉(zhuǎn)變，心肌細(xì)胞線粒體對(duì)脂肪酸的氧化磷酸化能力下降，而胞質(zhì)中利用葡萄糖的糖酵解水平增加［6］。因此，調(diào)整心肌細(xì)胞病理?xiàng)l件下的代謝模式被視為治療心肌疾病的有效方式［7］。蒙藥在治療心血管疾病方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，廣泛用于缺血性心肌病的治療，且療效顯著。肉豆蔻-5 作為蒙醫(yī)治療心赫依?。ㄈ毖孕募〔。┑慕?jīng)典名方，源于《蒙醫(yī)藥方匯編》，蒙語名“匝迪-5”，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（蒙藥分冊(cè)）》。由于中草藥化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)復(fù)雜，肉豆蔻-5保護(hù)心肌缺血的分子機(jī)制尚不清楚。本研究中利用大鼠心肌蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析蒙藥經(jīng)典方劑肉豆蔻-5 保護(hù)MI 的作用機(jī)制，進(jìn)一步開發(fā)該經(jīng)典方劑的應(yīng)用潛力?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：D6 LAB型小動(dòng)物超聲系統(tǒng)（飛依諾科技股份有限公司），配有小動(dòng)物呼吸機(jī)；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國Thermos 公司）；LV100NPOL/Ci-POL 型顯微鏡（日本Nikon公司）。

試藥：肉豆蔻（批號(hào)為18112702），木香（批號(hào)為18090403），土木香（批號(hào)為170801），廣棗（批號(hào)為190112），蓽茇（批號(hào)為180901），均購于內(nèi)蒙古天力藥業(yè)有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（批號(hào)為A020-2），肌酸激酶腦型同工酶（CK-MB）檢測試劑盒（批號(hào)為E006），均購自南京建成生物工程研究所；改良Masson三色染色液（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為R20381）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，298-96-4），三溴乙醇（批號(hào)為T484020），均購自美國Sigma-Aldrich公司。

動(dòng)物：SPF 級(jí)Wistar 雄性大鼠50 只，體質(zhì)量220～250 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)內(nèi)，在溫度22～26 ℃、相對(duì)濕度40%～60%環(huán)境喂養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有操作均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范》。

1.2 方法

樣品制備與給藥劑量設(shè)置：按10∶8∶8∶5∶1（m/m/m/m/m）稱取肉豆蔻、木香、土木香、廣棗、蓽茇，共20 kg，加95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，濃縮，蒸干，得95%有效部位；藥渣再用50%乙醇回流提取2 次，每次2 h，趁熱用棉花粗濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至無醇味，用蒸餾水定容；采用大孔吸附樹脂柱洗脫，先用蒸餾水洗脫，再用50%乙醇洗脫，蒸干洗脫液，得50%有效部位。按有效部位提取率將供試品與0.5%羧甲基纖維素鈉混合，制備混懸液。肉豆蔻-5 的臨床用量為每70 kg體質(zhì)量6 g，根據(jù)人和大鼠的體表面積計(jì)算用量，且大鼠的用量為人的6.3 倍，計(jì)算得大鼠的干預(yù)劑量為0.54 g/kg。故設(shè)置肉豆蔻-5 高、中、低干預(yù)劑量分別為0.27，0.54，1.08 g/kg。

分組與建模［8-9］：將50 只Wistar 雄性大鼠分為空白對(duì)照組（A 組），模型對(duì)照組（B 組），肉豆蔻-5高、中、低劑量干預(yù)組（C1組、C2組、C3組），各10 只。在復(fù)制MI模型前，C1組、C2組、C3組大鼠按預(yù)定劑量灌胃相應(yīng)藥物，預(yù)處理1周，A組和B組大鼠灌胃等量羧甲基纖維素鈉。預(yù)處理結(jié)束后，B組、C1組、C2組、C3組大鼠行冠脈左前降支（LAD）結(jié)扎術(shù)，實(shí)驗(yàn)周期為4周。使用2.5%三溴乙醇麻醉大鼠，每100 g 體質(zhì)量給藥2 mL，麻醉后固定在自制的固定板上，行經(jīng)口氣管插管并連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸機(jī)潮氣量設(shè)置為20 mL，呼吸頻率設(shè)置為100 次/ 分，剃毛消毒后，在距離中位線1 cm 處縱向剪開大鼠左胸部皮膚，開口2 cm，在第二肋間行開胸手術(shù)，手術(shù)開口1.0 cm，使用自制開口器撐開切口，剪開心包膜暴露心臟，使用6-0 號(hào)尼龍線將冠脈LAD 進(jìn)行永久性結(jié)扎，結(jié)扎完成后，逐層關(guān)胸，并滯留連接注射器直徑1 mm 的無菌塑料管，縫合后，通過輸液器將胸腔抽為負(fù)壓，拔出滯留管。A 組大鼠與B 組、C1組、C2組、C3組大鼠行相同手術(shù)，但不結(jié)扎冠脈LAD。待大鼠蘇醒并恢復(fù)自主呼吸后，拔除氣管插管，放回飼養(yǎng)籠。

樣本處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉大鼠，使用含抗凝劑的采血管行腹主動(dòng)脈取血后處死大鼠，開胸，取出心臟，使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈心臟表面和心腔內(nèi)的血液，剪掉心耳及其連帶的主動(dòng)脈。將心肌組織由上到下平均分為3 份，上、下端凍存于-80 ℃冰箱用于蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，中段心肌組織使用4%多聚甲醛固定用于病理學(xué)檢測。收集血液，離心（1 000g）10 min，分離血漿，用于心肌損傷標(biāo)志物檢測。

外周血心肌損傷標(biāo)志物水平檢測：利用LDH 試劑盒和CK-MB試劑盒檢測大鼠外周血中LDH和CK-MB水平，評(píng)價(jià)大鼠心肌損傷水平。

心臟功能檢測：MI 模型建模成功4 周后，通過體外超聲測定左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），評(píng)價(jià)心臟功能。

心肌組織TTC染色：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，并分離心臟。將心臟置-80 ℃冰箱迅速冷凍15 min，取出，用手術(shù)刀將結(jié)扎位置以下部位切成厚度為0.5～1.0 mm的薄片，將薄片置1% TTC 染液中于37 ℃孵育30 min，4%（m/V）多聚甲醛溶液進(jìn)行固定并拍照。采用Image J V2.3.0軟件統(tǒng)計(jì)大鼠心肌梗死面積。

心肌組織Masson 染色：用4%多聚甲醛溶液對(duì)心肌組織進(jìn)行固定，固定48 h 后將組織轉(zhuǎn)移至包埋盒，流水沖洗2 h，依次置入70%乙醇25 min、80%乙醇25 min、90%乙醇30 min、95%乙醇Ⅰ30 min、95%乙醇Ⅱ20 min、100%乙醇Ⅰ10 min、100%乙醇Ⅱ10 min、二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、石蠟Ⅰ10 min、石蠟Ⅱ10 min、石蠟Ⅲ10 min，得可供切片的蠟塊。石蠟切片厚度6μm，于乳頭肌水平橫切，經(jīng)脫蠟、去除內(nèi)源性過氧化物酶后，行Masson染色，評(píng)價(jià)大鼠心肌纖維化程度。

心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)檢測：基于高劑量肉豆蒄-5治療MI 的效果最佳，本研究中選取了A 組、B 組、C1組各5個(gè)樣本進(jìn)行大鼠心肌組織蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。由上海中科新生命生物科技有限公司負(fù)責(zé)完成，對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，由本課題組自行完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 8.0軟件V9.1.2分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)心臟功能與心肌損傷的保護(hù)作用

與A組比較，B組大鼠的LVEF顯著降低（P＜0.001）；與B 組比較，C1組大鼠的LVEF 顯著升高（P＜0.05）。詳見圖1 A'。與A 組比較，B 組大鼠外周血心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH 和CK-MB 水平均顯著升高（P＜0.001）；與B組比較，C1組、C2組大鼠外周血中LDH 和CK-MB 水平均顯著降低（P＜0.05）?？梢?，肉豆蒄-5 對(duì)LDA 結(jié)扎誘導(dǎo)MI 模型大鼠的LDH 和CK-MB 水平升高有抑制作用。詳見圖1 B'和圖1 C'。

圖1 肉豆蔻-5對(duì)MI模型大鼠心臟功能與心肌損傷的保護(hù)作用（n=5）注：與A組比較，###P ＜0.001；與B組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。圖2和圖3同。A'.左室射血分?jǐn)?shù) B'.LDH水平 C'.CK-MB水平Fig.1 Protective effect of Nutmeg-5 on cardiac function and myocardial injury in MI model rats（n=5）Note：Compared with those in group A，###P ＜0.001；Compared with those in group B，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001（for Fig.1-3）.A'.LVEF B'.LDH level C'.CK-MB level

2.2 對(duì)MI 模型的保護(hù)作用

與A 組比較，B 組大鼠心臟梗死面積占比顯著增加（P＜0.001）；與B 組比較，C1組、C2組大鼠心臟梗死面積占比均顯著縮?。≒＜0.05）。詳見圖2。

圖2 肉豆蔻-5對(duì)MI模型的保護(hù)作用（n=5）A'.心肌組織TTC染色結(jié)果 B'.心肌梗死面積占比Fig.2 Protective effect of Nutmeg-5 on the MI model rats（n=5）A'.Results of TTC staining of myocardial tissue B'.Proportion of myocardial infarction area

2.3 對(duì)MI 后纖維化的保護(hù)作用

心肌組織Masson 染色結(jié)果顯示，LAD 結(jié)扎4 周后，MI 模型大鼠MI 區(qū)域出現(xiàn)嚴(yán)重的纖維化，而肉豆蔻-5干預(yù)組大鼠心肌纖維化水平較MI大鼠減輕。詳見圖3 A'。與A 組比較，B 組大鼠的心肌纖維化程度顯著升高（P＜0.001）；與B 組比較，C1組、C2組大鼠的心肌纖維化程度顯著降低（P＜0.05）。詳見圖3 B'。

圖3 肉豆蔻-5對(duì)MI模型大鼠心肌纖維化的保護(hù)作用（n=5）A'.心肌組織Masson染色結(jié)果 B'.心肌纖維化程度Fig.3 Protective effect of Nutmeg-5 on myocardial fibrosis in MI model rats（n=5）A'.Results of Masson staining of myocardial tissue B'.Degree of myocardial fibrosis

2.4 大鼠心肌蛋白質(zhì)組學(xué)檢測肉豆蔻-5 保護(hù)MI 的機(jī)制

為進(jìn)一步研究肉豆蔻-5 保護(hù)MI 的分子機(jī)制，本課題組對(duì)大鼠心肌組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。通過4D-Label-free 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，得到二級(jí)質(zhì)譜986 497 個(gè)，其中230 390 個(gè)在數(shù)據(jù)庫中被匹配。匹配的質(zhì)譜對(duì)應(yīng)總的肽段數(shù)23 589個(gè)，唯一肽段總數(shù)21 964個(gè)。共3 459種蛋白在心肌組織中被辨識(shí)。共鑒定蛋白3 459種，其中3 423種被定量分析。其中，可定量蛋白數(shù)指蛋白在至少1個(gè)組別中，有超過1/2的生物學(xué)重復(fù)定量信息。

以組間差異大于1.5 倍（Foldchange ＞1.5 或Foldchange ＜0.67）及組間比較P＜0.05作為篩選組間差異表達(dá)蛋白的條件。結(jié)果顯示，與A 組比較，B 組大鼠心肌組織中分別有344 個(gè)和362 個(gè)蛋白顯著高表達(dá)和低表達(dá)（P＜0.05）；與B 組比較，C1組大鼠心肌組織中分別有522個(gè)和270個(gè)蛋白顯著高表達(dá)和低表達(dá)（P＜0.05）。詳見圖4。

圖4 MI模型大鼠心肌組織蛋白表達(dá)水平（n=5）A'.蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)火山圖 B'.差異表達(dá)蛋白熱圖Fig.4 Protein expression levels in myocardial tissue of MI model rats（n=5）A'.Volcano plot of proteomic data B'.Heat map of differential-expressed proteins

差異表達(dá)蛋白的維恩圖顯示，與A 組比較，B 組有95個(gè)顯著低表達(dá)的蛋白在C1組大鼠心肌組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05），而74 個(gè)顯著高表達(dá)的蛋白在C1組大鼠心肌組織中顯著低表達(dá)（P＜0.05），表明肉豆蔻-5對(duì)MI 的保護(hù)作用與逆轉(zhuǎn)169 個(gè)和MI 有關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。詳見圖5。

圖5 169個(gè)與肉豆蔻-5活性相關(guān)的蛋白A'.差異蛋白表達(dá)維恩圖 B'.169個(gè)蛋白表達(dá)熱圖Fig.5 A total of 169 proteins related to Numeg-5 activityA'.Venn diagram of differential-expressed proteins B'.Heat map of 169 proteins

對(duì)169 個(gè)差異蛋白進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），5 條細(xì)胞信號(hào)通路被成功富集（P＜0.05），包括代謝通路、氧化磷酸化通路、非酒精性脂肪性肝病通路、阿爾茨海默病通路、帕金森病通路。詳見圖6。

圖6 與肉豆蔻-5功能相關(guān)蛋白的基因集富集分析結(jié)果Fig.6 GSEA results of proteins related to Nutmeg-5 function

GSEA結(jié)果顯示，代謝通路（EnrichmentScore=0.453 8，P=0.003 7）和氧化磷酸化通路（EnrichmentScore=0.492 8，P=0.044）與心臟功能密切相關(guān)，且肉豆蔻-5干預(yù)能激活代謝通路或氧化磷酸化通路，表明肉豆蔻-5保護(hù)MI活性與調(diào)控心肌代謝有關(guān)［10-11］。詳見圖7。

圖7 169個(gè)與肉豆蔻-5活性相關(guān)蛋白基因集富集分析結(jié)果A.代謝通路 B.氧化磷酸化通路Fig.7 GSEA results of 169 proteins related to Nutmeng-5 activityA.Metabolic pathways B.Oxidative phosphorylation pathways

3 討論

基于特殊的生存環(huán)境和生活習(xí)慣，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心病，蒙醫(yī)稱心赫依?。┦敲晒抛宓貐^(qū)的高發(fā)病。肉豆蔻和廣棗是治療心赫依病的經(jīng)典蒙藥，被應(yīng)用于多種經(jīng)典方劑中。肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻的干燥種仁，作為香料和中藥材被東南亞地區(qū)廣泛使用。研究顯示，肉豆蔻中主要化學(xué)成分為木脂素、新木脂素、二苯烷、苯丙烷、萜類、烷烴、脂肪酸、脂肪酸酯及次要成分，如類固醇、皂苷、三萜類和黃酮類，這些化合物通過抗氧化活性、抗膽固醇血癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化活性而發(fā)揮對(duì)心血管疾病的保護(hù)作用［12］。廣棗為漆樹科南酸棗屬植物南酸棗，是特色蒙藥資源。中醫(yī)和其他民族醫(yī)學(xué)常以樹皮入藥，功效為解毒、收斂、止痛、止血，用于燒燙傷、外傷出血、牛皮癬；蒙醫(yī)常以干燥的果仁入藥，為心赫依病治療的核心蒙藥。蒙藥廣棗中富含有機(jī)酸、酚酸和黃酮類化合物，廣棗提取物在體內(nèi)外對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用顯著，表明對(duì)病理性心肌纖維化具有保護(hù)作用［13-14］。除肉豆蔻和廣棗外，肉豆蔻-5 中還包括菊科植物木香和土木香、胡椒科胡椒屬植物蓽茇。研究顯示，木香和土木香的主要化學(xué)成分為土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、揮發(fā)油、木香內(nèi)酯、脫氫木香內(nèi)酯等，上述化合物均對(duì)心血管疾病有保護(hù)作用［15-17］。

在正常生理?xiàng)l件下，心臟所需95%的ATP 來源于脂肪酸、碳水化合物（葡萄糖、乳酸）、酮體（乙酰乙酸、β-羥基丁酸）和氨基酸的氧化磷酸化，5%的ATP 通過糖酵解途徑生成，且心肌能根據(jù)外界刺激靈活地利用底物形成ATP，以維持正常的心臟功能［18］。但在病理?xiàng)l件下，心肌細(xì)胞能量代謝利用底物的靈活性喪失，ATP的生成更多依賴糖酵解，線粒體對(duì)脂肪酸的氧化磷酸化能力顯著降低［19-20］。心肌代謝的改變歸因于病理?xiàng)l件下的心肌細(xì)胞線粒體功能障礙和編碼線粒體脂肪酸氧化磷酸化基因表達(dá)水平的降低［21-22］。研究顯示，改善病理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能有望成為維持心臟功能和治療心力衰竭的手段，且民族醫(yī)學(xué)在此方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢。目前，很多民族醫(yī)學(xué)方劑及提取物、中藥提取物被報(bào)道能通過改善MI 后心肌細(xì)胞線粒體功能障礙和調(diào)節(jié)心肌能量代謝而發(fā)揮保護(hù)MI的作用［23-24］。本研究中的心肌蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，MI模型大鼠的心肌代謝通路被抑制，主要涉及脂肪酸的合成，胰高血糖素信號(hào)通路，三羧酸循環(huán)及2-氧代羧酸代謝等，而經(jīng)肉豆蔻-5 干預(yù)的MI 模型大鼠心肌組織中上述代謝涉及蛋白的表達(dá)水平顯著升高，表明肉豆蔻-5 能通過改善MI 模型大鼠的心肌代謝而發(fā)揮保護(hù)MI的作用。

本研究尚存在一定缺陷，主要表現(xiàn)為肉豆蔻-5 成分復(fù)雜，雖有關(guān)于其提取物化學(xué)成分辨別的研究，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)未知，能干預(yù)的蛋白靶點(diǎn)未知。后續(xù)研究中，本課題組將著力于從蒙藥基源、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、安全性、有效性、作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制方面系統(tǒng)評(píng)價(jià)蒙藥經(jīng)典方劑肉豆蔻-5 對(duì)MI 的保護(hù)作用，為挖掘其應(yīng)用潛力和現(xiàn)代劑型的研發(fā)提供理論依據(jù)。