鹽酸布比卡因注射液中基因毒性雜質(zhì)含量測(cè)定與來源分析*

周冰捷，王非夢(mèng)，2，李 超，羅立駿，徐 登，馮 琴，梁 靜△

（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局麻醉精神藥品質(zhì)量監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401121；2.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716）

鹽酸布比卡因注射液是一種長(zhǎng)效酰胺類局部麻醉藥，用于局部浸潤(rùn)麻醉、外周神經(jīng)阻滯和椎管內(nèi)阻滯，麻醉和鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)烈，藥效持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，能有效改善患者的預(yù)后，可避免阿片類藥物造成的過度鎮(zhèn)靜及呼吸抑制等不良反應(yīng)［1-3］，臨床應(yīng)用范圍較廣［4］。但制備過程中部分雜質(zhì)的引入會(huì)影響制劑的安全性，其中2，6-二甲基苯胺（雜質(zhì)F）是制備布比卡因等酰苯胺類局部麻醉藥的關(guān)鍵起始物料［5-6］。雜質(zhì)F 是一種基因毒性雜質(zhì)，可直接或間接損傷細(xì)胞DNA，具有基因毒性和致癌作用，已被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2B 類致癌物，必須嚴(yán)格控制含量［7-13］。鹽酸布比卡因注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均未對(duì)雜質(zhì)F 進(jìn)行有效控制［14］。藥品標(biāo)準(zhǔn)能否準(zhǔn)確控制有關(guān)物質(zhì)直接關(guān)系到藥品的質(zhì)量可控性與安全性［15-16］，其中基因毒性雜質(zhì)的研究至關(guān)重要［7］。本研究中建立了測(cè)定鹽酸布比卡因注射液中基因毒性雜質(zhì)F含量的高效液相色譜法，并從原料藥合成工藝、輔料、制劑生產(chǎn)工藝、制劑所用原料藥4 個(gè)方面對(duì)5 家生產(chǎn)企業(yè)提供的樣品進(jìn)行雜質(zhì)F 的檢測(cè)和分析，以更好地控制和評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量，并為后續(xù)藥品標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；XSE204 型電子天平（精度為0.1 mg），Quintix 224-1CN型電子天平（精度為0.01 mg），均購自瑞士Mettler Toledo公司；SB25-12DT型新芝超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為600 W，頻率為50 kHz）。

1.2 試藥

鹽酸布比卡因原料藥（生產(chǎn)企業(yè)A-C，共9批）；鹽酸布比卡因注射液（生產(chǎn)企業(yè)B，D-G，共94 批）；鹽酸布比卡因?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為101034-202103，含量為94.6%）；雜質(zhì)F 對(duì)照品（美國(guó)Sinco Pharmachem，批號(hào)為18-10-1501，含量為99.48%）；乙腈為色譜純，水為二次純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Xbridge Shield RP18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：A 為0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀6.8 g 與氫氧化鈉1.87 g，加水至1 000 mL，調(diào)pH 至8.0）-乙腈（65∶35，V/V），B 為乙腈，梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，出峰順序依次為雜質(zhì)F 和布比卡因，且兩峰間的分離度符合要求；對(duì)照品溶液色譜圖中，理論板數(shù)按布比卡因峰計(jì)大于3 000，且雜質(zhì)F 峰高的信噪比（S/N）大于10。色譜圖見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.雜質(zhì)F 2.布比卡因A.系統(tǒng)適用性溶液 B.對(duì)照品溶液 C.供試品溶液Fig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test1.Impurity F 2.BupivacaineA.System suitability solution B.Reference solution C.Test solution

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品，即得。

對(duì)照品溶液：取雜質(zhì)F對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相A稀釋成每1 mL約含雜質(zhì)F 1.5μg的溶液，搖勻，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：取鹽酸布比卡因和雜質(zhì)F對(duì)照品各適量，精密稱定，用流動(dòng)相A 稀釋成每1 mL 約含鹽酸布比卡因5 mg和雜質(zhì)F 1.5μg的混合溶液，搖勻，即得。

空白輔料溶液：取除主藥的輔料2.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加70%容量瓶體積的流動(dòng)相A，振搖至完全崩散，超聲并不時(shí)強(qiáng)烈振搖，冷卻至室溫，用流動(dòng)相A稀釋并定容，搖勻，離心，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下空白輔料溶劑，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明空白輔料溶液無干擾。

線性關(guān)系考察：取雜質(zhì)F對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相A 定量稀釋成每1 mL 分別含雜質(zhì)F 0.15，0.75，1.5，2.25，3.00μg 的溶液，搖勻，精密量取上述溶液各10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以雜質(zhì)F 的質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=25 224C-343.45（r=1.000 0，n=5）。結(jié)果表明，雜質(zhì)F 的質(zhì)量濃度在0.15～3μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品6 瓶，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果的RSD為9.27%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取雜質(zhì)F對(duì)照品適量，精密稱定，共9 份，用供試品溶液稀釋成每1 mL 含雜質(zhì)F 0.75，1.5，2.25 μg 的溶液，各3 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.41%，RSD為2.06%（n=9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 雜質(zhì)F 含量測(cè)定

取生產(chǎn)企業(yè)B，D，E，F(xiàn)，G 的94 批樣品，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果生產(chǎn)企業(yè)B，D，F(xiàn)，G 的85 批樣品中均未檢出雜質(zhì)F；企業(yè)E的9批樣品中均檢出雜質(zhì)F，含量分別為0.000 4%，0.000 4%，0.000 4%，0.000 6%，0.000 5%，0.000 5%，0.000 4%，0.000 4%，0.000 3%。

3 討論

3.1 雜質(zhì)F 來源

3.1.1 原料藥合成工藝

鹽酸布比卡因原料藥的國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)有3家，分別為生產(chǎn)企業(yè)A、生產(chǎn)企業(yè)B和生產(chǎn)企業(yè)C。本次國(guó)家藥品抽驗(yàn)樣品所用原料藥上述3家生產(chǎn)企業(yè)均有涉及，調(diào)研發(fā)現(xiàn)，原料藥的合成路線基本一致，起始物均由N-（2'，6'-二甲苯基）-2-哌啶甲酰胺（雜質(zhì)B）和溴代正丁烷通過縮合反應(yīng)生成布比卡因堿基，再經(jīng)脫堿基生成鹽酸布比卡因。

通過分析原料藥的合成工藝認(rèn)為，在原料藥合成過程中有2個(gè)風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)可能會(huì)引入雜質(zhì)F。風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)1，雜質(zhì)F為起始反應(yīng)物料鹽酸布比卡因雜質(zhì)B的副產(chǎn)物，有可能由雜質(zhì)B 引入；風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)2，根據(jù)強(qiáng)降解試驗(yàn)結(jié)果，在強(qiáng)酸條件下，布比卡因會(huì)降解產(chǎn)生雜質(zhì)F，在合成路線中，布比卡因堿基酸化得到布比卡因，鹽酸與布比卡因會(huì)結(jié)合成鹽酸鹽的形式，從而引入雜質(zhì)F。本研究中按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定原料藥生產(chǎn)企業(yè)A，B，C的9批樣品，結(jié)果均未檢出雜質(zhì)F，表明各原料藥生產(chǎn)企業(yè)對(duì)該基因毒性雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)控制良好。

3.1.2 輔料

鹽酸布比卡因注射液的輔料單一，抽檢的5家生產(chǎn)企業(yè)均僅以0.9%氯化鈉溶液作為等滲調(diào)節(jié)劑。按2.1項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)檢查方法，對(duì)生產(chǎn)企業(yè)B，D，E，G 提供的樣品進(jìn)行雜質(zhì)F 檢查（企業(yè)F 未能提供原輔料），結(jié)果均未檢出雜質(zhì)F。

3.1.3 制劑生產(chǎn)工藝

制劑生產(chǎn)工藝：根據(jù)影響因素試驗(yàn)和強(qiáng)降解試驗(yàn)結(jié)果，在強(qiáng)酸條件下，布比卡因會(huì)降解產(chǎn)生雜質(zhì)F，而在強(qiáng)堿、光照、高溫和氧化的強(qiáng)破壞條件下均未產(chǎn)生雜質(zhì)F。對(duì)比各制劑生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)工藝發(fā)現(xiàn)，其生產(chǎn)工藝步驟基本一致，且整個(gè)生產(chǎn)過程不會(huì)用到強(qiáng)酸和濃酸，均以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH?？梢?，制劑的生產(chǎn)及儲(chǔ)存過程中均不會(huì)降解產(chǎn)生雜質(zhì)F。

模擬活性炭生產(chǎn)工藝：在鹽酸布比卡因注射液的生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)企業(yè)B，E，F(xiàn) 均以活性炭作吸附劑進(jìn)行熱源吸附、除雜、脫色。其中，生產(chǎn)企業(yè)B 和E 在濃配步驟中加入0.1%活性炭，煮沸，保溫?cái)嚢?0 min。通過模擬生產(chǎn)企業(yè)B 和E 的實(shí)際工藝條件，按各處方的用量，分別配制原料藥溶液、原料藥+氯化鈉溶液、原料藥+氯化鈉+活性炭溶液，煮沸，保溫?cái)嚢?0 min，考察活性炭的引入對(duì)雜質(zhì)譜的影響。結(jié)果生產(chǎn)企業(yè)B 和E的樣品中均未檢出雜質(zhì)F，表明活性炭的使用并不會(huì)引入雜質(zhì)F。但生產(chǎn)企業(yè)B 和E 的產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中引入活性炭后，雜質(zhì)譜的數(shù)量和含量均出現(xiàn)增長(zhǎng)。對(duì)比不同企業(yè)的雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果可知，未使用活性炭的生產(chǎn)企業(yè)D和G的樣品雜質(zhì)譜的數(shù)量和含量均較低，而使用了活性炭的生產(chǎn)企業(yè)B，E，F(xiàn) 的樣品雜質(zhì)譜的數(shù)量和含量均較高，表明活性炭的使用存在引入其他未知雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。

模擬高壓滅菌試驗(yàn)：生產(chǎn)企業(yè)E 的滅菌溫度為100 ℃，滅菌時(shí)間為30 min。通過模擬滅菌工藝條件，考察滅菌工藝對(duì)生產(chǎn)企業(yè)E 和F 的樣品中雜質(zhì)F 含量的影響。結(jié)果表明，滅菌工藝并未引起生產(chǎn)企業(yè)E 和F 的樣品中雜質(zhì)F的含量變化，表明滅菌工藝不會(huì)使鹽酸布比卡因降解產(chǎn)生雜質(zhì)F。

3.1.4 制劑所用原料藥

經(jīng)調(diào)研和追溯發(fā)現(xiàn)，在抽檢的生產(chǎn)企業(yè)E 的產(chǎn)品中，有部分批次產(chǎn)品的原料藥供貨商及批號(hào)與生產(chǎn)企業(yè)F的部分批次產(chǎn)品所用原料藥一致。生產(chǎn)企業(yè)A 提供了2批（批號(hào)分別為C053-210402，C053-211002）原料藥的留樣，2批原料藥中均未檢出雜質(zhì)F；采用相同批次原料藥的生產(chǎn)企業(yè)F的注射劑產(chǎn)品中也均未檢出雜質(zhì)F。

3.2 結(jié)語

所建立的方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、精密度高，可為雜質(zhì)F 的定量檢測(cè)和制劑的質(zhì)量控制提供參考。此外，從原料藥及合成工藝、輔料、制劑生產(chǎn)工藝、制劑所用原料藥4 個(gè)方面探討了雜質(zhì)F 的來源，認(rèn)為雜質(zhì)F 不會(huì)在鹽酸布比卡因注射液的生產(chǎn)過程中降解產(chǎn)生，但通過原料藥引入的可能性較大。因此，建議制劑生產(chǎn)企業(yè)重視對(duì)基因毒性雜質(zhì)F的控制，加強(qiáng)原料藥的入庫質(zhì)控，從源頭控制引入風(fēng)險(xiǎn)。