羅伊氏粘液乳桿菌 K07 的生物學(xué)特性及其基因分析

黃志鈺，黎旭，李幸，金庭飛，陶純長(zhǎng)，劉宗爭(zhēng)

（廣東益可維生物技術(shù)有限公司，廣東廣州 510630）

世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）在2002 年將益生菌定義為以活的形式足量攝取，對(duì)宿主健康有益的微生物。這些微生物必須無(wú)毒性、致病性，能夠耐受胃酸及膽鹽，并且在腸道中定殖[1]。根據(jù)最新的分類(lèi)學(xué)，羅伊氏粘液乳桿菌屬于粘液乳桿菌屬，是存在于人體及動(dòng)物胃腸道中的常見(jiàn)菌株[2]，具有優(yōu)越的益生功能，可以抑制腸道中病原菌的生長(zhǎng)[3]，緩解由菌群失調(diào)而引起的慢性便秘等癥狀[4]，此外還能有效緩解疝氣的發(fā)生[5-7]。有研究表明，羅伊氏粘液乳桿菌可以分解甘油產(chǎn)生羅伊氏菌素。羅伊氏菌素由不同形態(tài)的3-羥基丙醛（3-HPA）混合物組成，是一類(lèi)非蛋白，具有水溶性的細(xì)菌素，能夠抑制多種致病菌，抑菌活性不受蛋白酶的影響[8,9]。當(dāng)前在蔬菜保鮮、乳制品發(fā)酵、肉制品保藏及青貯飼料發(fā)酵等方面都有羅伊氏菌素的良好應(yīng)用[10-13]。羅伊氏粘液乳桿菌在體外能夠有效清除自由基，具有較好的抗氧化能力[14]，在蛋雛雞飼糧中添加羅伊氏粘液乳桿菌可以提高機(jī)體抗氧化能力[15]。當(dāng)前已有公司基于羅伊氏粘液乳桿菌研發(fā)出能夠改善人與動(dòng)物機(jī)體健康的生物制劑。

新疆作為我國(guó)最大面積的省級(jí)行政單位，區(qū)域內(nèi)少數(shù)民族眾多，同時(shí)具有多樣的地形地貌，特別是區(qū)別于平坦的草原牧場(chǎng)，新疆的高山牧場(chǎng)位置偏遠(yuǎn)且牧民仍保留著傳統(tǒng)的游牧方式與制作多種發(fā)酵乳制品的傳統(tǒng)，為其區(qū)域內(nèi)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的微生物建立了一道物理屏障，蘊(yùn)含著寶貴且豐富的微生物資源。本文以新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵乳酪中分離出的2 株羅伊氏粘液乳桿菌K07、K08 為研究對(duì)象，對(duì)其生長(zhǎng)特性、耐酸耐膽鹽性能、抑菌、抗氧化及產(chǎn)羅伊氏菌素能力進(jìn)行研究，并對(duì)性能良好的K07 菌株進(jìn)行全基因測(cè)序與分析，為K07 菌株的應(yīng)用產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供研究支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

菌株：2 株羅伊氏粘液乳桿菌K07、K08 分離自新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣傳統(tǒng)乳酪，現(xiàn)分別保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心和廣東益可維生物技術(shù)有限公司研發(fā)中心菌種庫(kù)。其中K07保藏號(hào)為CGMCC No.15703，K08 保藏號(hào)為YKWLr08。

指示菌：白色念珠菌ATCC 10231、無(wú)乳鏈球菌ATCC 12386 購(gòu)買(mǎi)自廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、鹽酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸、鐵氰化鉀、甲苯、過(guò)氧化氫，上海麥克林生化科技有限公司；鄰-菲羅琳、丙烯醛、牛膽鹽、DPPH、三氯乙酸、L-色氨酸、PBS 緩沖液，上海索萊寶生物科技有限公司；MRS 培養(yǎng)基，青島海博生物。

1.2 儀器與設(shè)備

Delta 320s 型pH 計(jì)，美國(guó)Mettler-Toledo 公司；JB-FY-900 型超凈臺(tái)，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；5417R 型高速冷凍離心機(jī)，金壇市醫(yī)療儀器廠；LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 儀器有限公司；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱，蘇州江東精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

按說(shuō)明書(shū)稱(chēng)取MRS 培養(yǎng)基，定容后調(diào)節(jié)pH值至6.20。固體培養(yǎng)基中加入20 g/L 的瓊脂粉，121 ℃滅菌15 min。

LB 培養(yǎng)基：按NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L 配制，定容后調(diào)pH 值至7.40。固體培養(yǎng)基加20 g/L 瓊脂粉，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 菌株的準(zhǔn)備

取保藏于-80 ℃的羅伊氏粘液乳桿菌K07、K08 甘油管，用接種環(huán)取一環(huán)進(jìn)行平板劃線，培養(yǎng)48 h 后挑取單菌落于5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，活化2 次后，培養(yǎng)菌液至OD600nm=1（約109CFU/mL）作為試驗(yàn)種子液備用。

1.3.3 生長(zhǎng)及產(chǎn)酸特性

按體積分?jǐn)?shù)2%接種羅伊氏粘液乳桿菌種子液于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，每隔2 h 測(cè)定菌液OD600nm值和pH 值，連續(xù)測(cè)48 h。每隔2 h 測(cè)定兩株菌液中的活菌數(shù)，24 h 后每隔6 h 測(cè)定一次活菌數(shù)，測(cè)定至48 h 結(jié)束。

1.3.4 耐酸能力評(píng)價(jià)

參考王騰斌等[16]方法加以改進(jìn)，配制含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.20%硫代乙醇酸鈉的MRS 液體培養(yǎng)基，用0.1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 值至2.50、3.50、4.00和6.50。接種體積分?jǐn)?shù)2%羅伊氏粘液乳桿菌種子液至調(diào)酸的培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)0、1、2、3和4 h 后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

式中：

A——處理后菌株的存活率，%；

B——處理后的活菌數(shù)，log CFU/mL；

C——處理前的活菌數(shù)，log CFU/mL。

1.3.5 膽鹽耐受性評(píng)價(jià)

參考高云云等[17]方法加以改進(jìn)，取種子液以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、0.15%、0.30%及0.40%牛膽鹽的MRS 液體培養(yǎng)基（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.20%硫代乙醇酸鈉）中。記錄菌液OD600nm上升0.3個(gè)單位的時(shí)間，觀察各實(shí)驗(yàn)組菌液生長(zhǎng)情況與滯后時(shí)間。

1.3.6 胃腸道模擬耐受評(píng)價(jià)

參考Guo 等[18]的方法，配制人工胃液與腸液。根據(jù)史曉萌等方法，綜合評(píng)估食物在胃腸道內(nèi)停留的時(shí)間，選擇在pH 值3.00 的人工胃液中處理3 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，取胃液處理后的菌液接種于pH值8.00 的人工腸液中再處理6 h 進(jìn)行計(jì)數(shù)，存活率計(jì)算同1.3.4。

1.3.7 抑菌能力評(píng)價(jià)

1.3.7.1 指示菌菌懸液的制備

同方法1.3.2 制備指示菌種子液，按2%體積分?jǐn)?shù)接種至LB 液體培養(yǎng)基中，使得初始菌液濃度為107CFU/mL，備用。

1.3.7.2 益生菌發(fā)酵上清液的制備

將羅伊氏粘液乳桿菌種子液以體積分?jǐn)?shù)2%接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 后，5 000 r/min 離心10 min，收集上清液并用0.22 μm的濾膜過(guò)濾收集濾出液，備用。

1.3.7.3 牛津杯實(shí)驗(yàn)

取100 μL 指示菌液，均勻涂布在LB 平板上，用無(wú)菌鑷子在培養(yǎng)基表面均勻放置牛津杯。吸取100 μL 上清液至牛津杯中，每個(gè)樣品重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)完畢后將平板放入4 ℃冰箱內(nèi)3 h，再移入37 ℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.8 抗氧化能力評(píng)價(jià)

1.3.8.1 完整細(xì)胞與無(wú)細(xì)胞提取物的制備

取1.2.2 中培養(yǎng)的菌液，4 ℃，5 000 r/min，10 min 離去上清液，用pH 值7.20 的0.02 mol/L PBS 緩沖液洗滌3 次，重懸菌體使OD600nm為1.00。重懸菌液一組作為完整細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，一組超聲破碎處理（總功率750 W，破碎效率75%，工作6 s 間歇3 s，4 ℃處理5 min），結(jié)束后4 ℃，10 000 r/min離心15 min，鏡檢上清液至無(wú)完整細(xì)胞，可進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)。

1.3.8.2 DPPH 自由基清除能力

參考黃玉軍等[19]方法，在517 nm 處測(cè)定樣品的DPPH 自由基清除率。計(jì)算公式如下：

式中：

W1——測(cè)定樣品的DPPH 自由基清除率，%；

A0——1 mL 的DPPH 溶液+1 mL 無(wú)水乙醇的吸光度；

A1——1 mL 的DPPH 溶液+1 mL 樣品的吸光度；

A2——1 mL 的無(wú)水乙醇+1 mL 樣品的吸光度。

1.3.8.3 羥自由基清除能力

參考Zhang 等[20]的方法進(jìn)行羥自由基清除率實(shí)驗(yàn)與計(jì)算。計(jì)算公式如下：

式中：

W2——測(cè)定樣品的羥自由基清除能力，%；

Ab——用1 mL 蒸餾水替代1 mL H2O2作為空白組在OD536nm的吸光度；

As——用1 mL 待測(cè)樣品替代1 mL 蒸餾水在OD536nm的吸光度；

Ap——用1 mL 20 mmol/L H2O2代替待測(cè)樣品在OD536nm的吸光度。

1.3.8.4 羅伊氏粘液乳桿菌的還原力

取0.5 mL 待測(cè)樣品，參照楊靜秋[21]方法進(jìn)行菌株還原力的測(cè)定。計(jì)算公式如下：

式中：

W3——測(cè)定樣品的還原力，%；

Ae——處理后測(cè)定樣品在OD700nm的吸光度；

Ad——PBS 代替待測(cè)樣品在OD700nm的吸光度。

1.3.9 羅伊氏菌素的測(cè)定

1.3.9.1 細(xì)胞的制備

接種體積分?jǐn)?shù)6%的羅伊氏粘液乳桿菌種子液至10 mL MRS 液體培養(yǎng)基的試管中，用礦物油2 mL 封液，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的菌液5 000 r/min 離心10 min，pH 值7.00 磷酸緩沖液沖洗1 次，收集濕細(xì)胞（20～140 g 濕重/L）。

1.3.9.2 羅伊氏菌素的制備

將收集的羅伊氏粘液乳桿菌濕細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有7 mL 無(wú)菌甘油溶液的離心管中，37 ℃培養(yǎng)2 h，進(jìn)行羅伊氏菌素轉(zhuǎn)化合成。轉(zhuǎn)化后的菌液4 ℃，5 000 r/min 離心10 min，取上清液在4 ℃以下保存。

1.3.9.3 羅伊氏菌素的測(cè)定

參考Circle 等[22]的方法使用丙烯醛-色氨酸比色法測(cè)定羅伊氏菌素的濃度，用丙烯醛標(biāo)準(zhǔn)品配置成0～1 mmol/L 溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，37 ℃下避光保溫20 min 后檢測(cè)OD560nm值。得到線性回歸方程為y=0.259 9x-0.022 4，R2=0.992 4。

1.3.9.4 基因組測(cè)序及分析

委托生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)K07 菌株在MGI DNBSEQ-T7 平臺(tái)上進(jìn)行全基因組二代Illumina 測(cè)序，并進(jìn)行基因注釋和分析。使用FastQC v0.11.2 對(duì)測(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，通過(guò)Trimmomatic v0.36 對(duì)Illumina 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切，得到相對(duì)準(zhǔn)確的有效數(shù)據(jù)。使用SPAdes v3.5.0 拼接二代測(cè)序數(shù)據(jù)。采用GapFiller v1.11 填補(bǔ)空白。利用PrInSeS-G v1.0.0 進(jìn)行序列矯正?；虻鞍仔蛄信c基因預(yù)測(cè)和注釋是使用Prokka v1.10 和NCBI（National Center for Biotechnology Information）的NR 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ncbi.nlm.nih.gov/）生成的。

1.3.9.5 耐藥基因分析

使用BLAST v 2.2.28 把基因蛋白序列與抗生素耐藥性綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（CARD）（https://card.mcmaster.ca/）進(jìn)行比對(duì)，把基因和其相對(duì)應(yīng)的耐藥功能注釋信息結(jié)合起來(lái)，得到注釋結(jié)果，預(yù)測(cè)抗生素耐藥性基因。

1.3.9.6 碳水化合物活性酶分析

碳水化合物活性酶的分析使用HMMER3 v3.1b1軟件將基因集蛋白序列與CAZy（Carbohydrate-Active enZYmesDatabas）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.cazy.org）進(jìn)行比對(duì)，得到其對(duì)應(yīng)的碳水化合物活性酶注釋信息。篩選條件為E-value ＜1e-5。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 軟件制圖。各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（mean±SD）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05視為顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長(zhǎng)曲線

乳酸菌發(fā)揮益生作用，需要在指定的環(huán)境中快速生長(zhǎng)繁殖，成為優(yōu)勢(shì)菌群。因此生長(zhǎng)速度是乳酸菌益生特性的篩選條件之一。羅伊氏粘液乳桿菌K07、K08 的生長(zhǎng)曲線如圖1 所示。兩株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)相近，0～2 h 為生長(zhǎng)延滯期，菌體濃度變化緩慢，OD600nm值與菌液中的活菌數(shù)變化不大。3～12 h 時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)速率和新陳代謝加快，呈快速上升趨勢(shì)，菌液中活菌數(shù)上升約2 個(gè)數(shù)量級(jí)；12 h時(shí)進(jìn)入菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定期，菌體濃度相對(duì)穩(wěn)定，菌液中活菌數(shù)維持在9.80 lg CFU/mL。有研究表明，豬源羅伊氏粘液乳桿菌GL001 在生長(zhǎng)8 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，16 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期[23]，說(shuō)明不同來(lái)源的菌株生長(zhǎng)速率不同，菌株K07 相對(duì)來(lái)說(shuō)能夠更快達(dá)到高活菌數(shù)。

圖1 羅伊氏粘液乳桿菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Limosilactobacillus reuteri

2.2 產(chǎn)酸性能

乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，可以降低胃腸道的pH，同時(shí)抑制致病菌的生長(zhǎng)。通常來(lái)說(shuō)，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌具有更好的應(yīng)用空間。羅伊氏粘液乳桿菌K07、K08 在生長(zhǎng)過(guò)程中的產(chǎn)酸性能與生長(zhǎng)趨勢(shì)相同。如圖2 所示，在菌體生長(zhǎng)延滯期，菌液pH 值變化不明顯。2～12 h 期間，菌液pH 值快速下降，pH 值從6.30 降至4.45 左右，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，迅速消耗碳源并產(chǎn)生大量有機(jī)酸；12～48 h 期間菌液pH 值無(wú)明顯變化，此時(shí)菌體生長(zhǎng)代謝速率變緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。菌液pH 值變化情況與菌體密度變化趨勢(shì)一致。產(chǎn)酸性能與李婷的研究結(jié)果相似，均在對(duì)數(shù)期菌液pH 值快速下降，且最終菌液pH 值在4.50 左右[23]。

圖2 羅伊氏粘液乳桿菌pH值變化Fig.2 Change in pH of Limosilactobacillus reuteri

2.3 耐酸能力

隨著食品微生物應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，乳酸菌的耐酸能力成為篩選理想益生菌株的條件之一。由圖3可以看出，羅伊氏粘液乳桿菌K07 較K08 具有更優(yōu)的耐酸能力。在pH 值2.50 條件下處理4 h，菌株K07 存活率為73.27%，K08 存活率為63.31%，K07菌株存活率顯著高于K08（P＜0.05）。有研究者從健康嬰兒糞便中分離到幾株羅伊氏粘液乳桿菌，pH值2.00 處理4 h 后，菌株GH211-4 和GH319-13 表現(xiàn)出良好的存活率[3]，說(shuō)明部分羅伊氏粘液乳桿菌對(duì)酸有較好的耐受能力，可以適應(yīng)酸性食品發(fā)酵條件或在人體胃腸道中發(fā)揮益生作用。

圖3 羅伊氏粘液乳桿菌耐酸性能Fig.3 Acid resistance of Limosilactobacillus reuteri

2.4 膽鹽耐受性

若想在人體中發(fā)揮益生功效，益生菌除了要有較強(qiáng)的耐酸性能外，還需要耐受小腸膽鹽形成的高滲環(huán)境。因此對(duì)兩株羅伊氏粘液乳桿菌的膽鹽耐受性進(jìn)行評(píng)估。由圖4 可知，菌株K07 對(duì)膽鹽的耐受能力良好。在0.15%牛膽鹽環(huán)境中，與對(duì)照組相比，K07 菌液OD600nm上升0.3 個(gè)單位，生長(zhǎng)滯后約1 h。而菌株K08 在0.15%牛膽鹽環(huán)境中，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，與對(duì)照組相比，生長(zhǎng)至7.5 h 時(shí)，菌液OD600nm僅上升約0.15 個(gè)單位，菌株K08 對(duì)膽鹽的耐受性較差。Popovi? 等[24]研究發(fā)現(xiàn)羅伊氏粘液乳桿菌B2 在0.3%牛膽鹽環(huán)境中的存活率為37%，張如春等[25]測(cè)定了狐源羅伊氏粘液乳桿菌ZJF036 在0.2%和0.4%膽鹽MRS 培養(yǎng)基中OD600值的變化情況，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)6 h 的0.2%膽鹽MRS 培養(yǎng)液OD600值顯著下降約0.4 個(gè)單位，與本研究結(jié)果相近，說(shuō)明膽鹽會(huì)影響羅伊氏粘液乳桿菌的生長(zhǎng)，但部分菌株對(duì)膽鹽的耐受性良好。

圖4 羅伊氏粘液乳桿菌膽鹽耐受性結(jié)果Fig.4 Bile salt tolerance evaluation of Limosilactobacillus reuteri

2.5 模擬人工胃腸道耐受性

由耐酸及耐膽鹽結(jié)果可知，兩株菌的耐受性差異較大。通過(guò)測(cè)試兩株菌在人工胃腸道模擬環(huán)境中的耐受情況，進(jìn)一步評(píng)估兩株菌的綜合耐受能力。

如圖5 所示，菌株K07 經(jīng)人工胃液處理3 h后存活率為86.13%，顯著高于K08 存活率81.45%（P＜0.05）。經(jīng)胃液處理3 h，腸液處理6 h 后，K07 存活率為74.13%，顯著高于K08 存活率60.85%（P＜0.05）。史曉萌等[26]通過(guò)對(duì)植物乳桿菌CICC 6238、嗜酸乳桿菌NCFM 和鼠李糖乳桿菌HN001 進(jìn)行胃腸道模擬試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們的最終存活率分別約為61.50%、79.40%、77.40%。對(duì)比可知，本研究的K07 菌株具有相對(duì)良好的胃腸道耐受能力。

圖5 羅伊氏粘液乳桿菌胃腸道模擬耐受性Fig.5 Simulated gastrointestinal tolerance of Limosilactobacillus reuteri

圖6 羅伊氏粘液乳桿菌抗氧化能力評(píng)價(jià)Fig.6 Ealuation of antioxidant capacity for Limosilactobacillus reuteri

圖7 羅伊氏菌素含量Fig.7 The content of reuterin

2.6 抑菌能力

能夠在健康人體中引發(fā)婦科疾病的致病菌主要為白色念珠菌跟無(wú)乳鏈球菌。外陰陰道念珠菌病是一種常見(jiàn)的炎癥性婦科疾病，通常是由于口服避孕藥、懷孕、糖尿病或使用廣譜抗生素治療導(dǎo)致。約80%～90%的外陰陰道念珠菌病是由白色念珠菌引起的。由臨床數(shù)據(jù)結(jié)果表明，無(wú)乳鏈球菌是新生兒發(fā)病和死亡的主要感染性致病菌。無(wú)乳鏈球菌能夠引發(fā)多種婦科感染，包括絨毛膜羊膜炎、子宮內(nèi)膜炎及產(chǎn)褥期敗血癥等。因此研究益生菌對(duì)這2 株婦科致病菌的抑菌能力很有必要。

由牛津杯實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，菌株K07 較K08 對(duì)白色念珠菌和無(wú)乳鏈球菌的抑制效果更好，且差異顯著（P＜0.05）。菌株K07 對(duì)白色念珠菌的抑菌圈直徑可達(dá)22.20 mm，對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抑菌直徑可達(dá)18.26 mm。蘇艷君等[27]發(fā)現(xiàn)海洋源長(zhǎng)枝木霉菌ST-27 的發(fā)酵產(chǎn)物二氯甲烷萃取物對(duì)無(wú)乳鏈球菌ATCC12386 的抑菌圈直徑接近30 mm。姜林娟等[28]采用瓊脂抑菌試驗(yàn)測(cè)試了植物乳植桿菌、鼠李糖乳酪桿菌和羅伊氏粘液乳桿菌對(duì)白色念珠菌的抑制情況，結(jié)果表明3 株益生菌對(duì)白色念珠菌的抑制效果良好，均能達(dá)到90%以上。以上結(jié)果跟本研究結(jié)果相似，說(shuō)明益生菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌和無(wú)乳鏈球菌有良好的抑制效果。

表1 羅伊氏粘液乳桿菌對(duì)致病菌的抑菌效力Table 1 Bacteriostatic effect of Limosilactobacillus reuteri pathogenic bacteria

2.7 抗氧化能力

乳酸菌的抗氧化能力當(dāng)前已得到明確驗(yàn)證，但具體作用機(jī)制尚不明確[29]。通過(guò)對(duì)K07 與K08 菌株抗氧化能力分析發(fā)現(xiàn)，K07 具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，其完整細(xì)胞與無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力分別可以達(dá)到32.51%和42.39%。解文利等[30]測(cè)試了從四川傳統(tǒng)泡菜中分離出的乳酸菌對(duì)DPPH 自由基的清除能力，其中完整細(xì)胞組及無(wú)細(xì)胞提取物組對(duì)DPPH 自由基的清除率均在15%左右。劉少敏[31]研究發(fā)現(xiàn)商業(yè)菌種嗜酸乳桿菌NCFM 及植物乳桿菌ATCC 14917 的菌體對(duì)DPPH自由基的清除率分別為22.60%和38.00%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，K07 具有較強(qiáng)的DPPH 清除能力。

此外菌株K07 的羥自由基清除率及還原力也強(qiáng)于K08。K07 和K08 菌株的無(wú)細(xì)胞提取物羥自由基清除率和還原力分別為15.69%、17.96%和14.56%、15.35%。

有研究者對(duì)自然發(fā)酵的東北酸菜和人源乳酸菌進(jìn)行了羥自由基清除能力及還原力評(píng)估，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，無(wú)細(xì)胞提取物具有更強(qiáng)的羥基自由基清除能力[32,33]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。K07 與K08 菌株的無(wú)細(xì)胞提取物整體抗氧化能力強(qiáng)于完整細(xì)胞組，且K07 菌株情況整體優(yōu)于K08。

2.8 羅伊氏菌素含量

部分羅伊氏粘液乳桿菌能夠產(chǎn)生羅伊氏菌素，該物質(zhì)具有良好的抗菌活性，在食品及養(yǎng)殖領(lǐng)域均有一定的應(yīng)用。經(jīng)測(cè)定K07 與K08 菌株均能產(chǎn)生一定的羅伊氏菌素，且含量分別為183.05 mmol/L 和113.05 mmol/L。有研究者發(fā)現(xiàn)，處于初期穩(wěn)定期的羅伊氏粘液乳桿菌細(xì)胞內(nèi)的甘油脫水酶活力最強(qiáng)，此時(shí)轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)羅伊氏菌素的產(chǎn)量最高[34]。Bell 等[35]發(fā)現(xiàn)羅伊氏粘液乳桿菌產(chǎn)生的羅伊氏菌素在腸道內(nèi)能夠有效降低結(jié)腸癌的發(fā)生，保障腸道健康。Lüthi-Peng 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，羅伊氏粘液乳桿菌ATCC 53608 轉(zhuǎn)化200 mmol/L 的甘油，可以生成約170 mmol/L 的羅伊氏菌素，與本研究的K07 菌株產(chǎn)羅伊氏菌素的能力相近，說(shuō)明K07 菌株具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的潛質(zhì)。

2.9 全基因組分析

利用全基因組測(cè)序可以對(duì)相關(guān)菌株的遺傳信息、生理功能和代謝途徑有更深入的了解。因此對(duì)生長(zhǎng)性能等各方面表現(xiàn)良好的羅伊氏粘液乳桿菌K07 菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序。由表2、3 可知，羅伊氏粘液乳桿菌K07 菌株的基因組全長(zhǎng)1 950 440 bp，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)編碼基因2 067 種，可進(jìn)行功能注釋的基因1 922 種，GC 含量38.69%。K07 的基因組信息與已經(jīng)報(bào)道的羅伊氏粘液乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM 20016 的基因組信息相符，該標(biāo)準(zhǔn)株基因組全長(zhǎng)1 999 618 bp，包含1 900 種基因，GC 含量為38.9%[37]。趙玉楊對(duì)母乳中分離出的羅伊氏粘液乳桿菌B1-27 進(jìn)行了全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)共含有2 024 個(gè)基因，總長(zhǎng)為1 759 164 bp，編碼基因長(zhǎng)度為2 017 551 bp，占全基因組的87.19%，結(jié)果與羅伊氏粘液乳桿菌K07 的測(cè)序結(jié)果相近。當(dāng)前已公布全基因組的羅伊氏粘液乳桿菌約有12 株，基因組大小在1 900 000～2 950 000 bp 之間，GC 含量在39%左右[38]。通過(guò)對(duì)比可知，K07 菌株符合羅伊氏粘液乳桿菌的特征。

表2 羅伊氏粘液乳桿菌K07的基因組拼接結(jié)果Table 2 Genome splicing results of Limosilactobacillus reuteri K07

表3 羅伊氏粘液乳桿菌K07的基因組預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Genomic prediction results of Limosilactobacillus reuteri K07

2.9.1 耐藥基因分析

評(píng)判一株菌是否能作為益生菌使用，需要進(jìn)行安全性評(píng)估。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，通常是由基因突變或者通過(guò)獲得耐藥基因，在表達(dá)后對(duì)相應(yīng)的藥物產(chǎn)生耐藥性[39]。使用BLAST（v 2.2.28）將K07 基因蛋白序列與CARD 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。從表4 可以看到，K07 菌株預(yù)測(cè)到的抗性基因蛋白總個(gè)數(shù)為25個(gè)，占基因蛋白總數(shù)的1.30%。預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)K07菌株主要對(duì)達(dá)托霉素、林可霉素、氨基香豆素和氟喹諾酮類(lèi)抗生素有抗性。Alayande 等[40]對(duì)羅伊氏粘液乳桿菌PNW1 進(jìn)行了耐藥基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其具有對(duì)林可酰胺和四環(huán)素的耐藥基因。Egervarn 等[41]對(duì)羅伊氏粘液乳桿菌和植物乳值桿菌中的耐藥基因進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)羅伊氏粘液乳桿菌具有四環(huán)素和紅霉素的耐藥基因。研究表明，絕大多數(shù)的羅伊氏粘液乳桿菌攜帶有四環(huán)素類(lèi)的耐藥基因，而K07 菌株經(jīng)耐藥基因預(yù)測(cè)分析后，發(fā)現(xiàn)其不含四環(huán)素類(lèi)抗性基因。有研究者對(duì)植物乳桿菌JDM1 的全基因組序列進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)51 個(gè)抗性基因，且這些基因大都不可轉(zhuǎn)移[42]。以上結(jié)果與本研究結(jié)果相似，說(shuō)明從自然界分離到的乳酸菌菌株，部分會(huì)含有少量的抗性基因，但相對(duì)穩(wěn)定。

表4 耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果分析Table 4 Analysis of drug resistance gene prediction results

2.9.2 碳水化合物活性酶分析

碳水化合物活性酶（Carbohydrate Active Enzymes，CAZymes）參與了復(fù)雜碳水化合物和糖復(fù)合物的組裝與分解[43]，大部分來(lái)源于微生物和無(wú)脊椎動(dòng)物。使用HMMER3 將K07 基因集蛋白序列與CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，由圖8 可知，K07 菌株中糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyl Transferases，GTs）和糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs）含量較多，與安曉娜對(duì)34 株羅伊氏粘液乳桿菌的5 大類(lèi)碳水化合物活性酶分析結(jié)果一致，其中GT 家族主要負(fù)責(zé)糖苷鍵的形成，GH 家族主要負(fù)責(zé)水解或重排糖苷鍵，且K07 菌株與安曉娜分析的34 株羅伊氏粘液乳桿菌均不含多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases，PLs）。由表5 可知，羅伊氏粘液乳桿菌K07 的GT家族中GT2、GT4 數(shù)量相對(duì)較多，分別有11 和7個(gè)。GT2 和GT4 主要編碼蔗糖合酶與纖維素合酶等酶類(lèi)，跟蔗糖、脂多糖和纖維素合成有關(guān)。GH 家族中的GH73 數(shù)量最多，有4 個(gè)，主要負(fù)責(zé)編碼溶菌酶類(lèi)物質(zhì)，跟細(xì)菌的抑菌能力有關(guān)[44]。本研究的羅伊氏粘液乳桿菌K07 與安曉娜分析的11 株來(lái)源于發(fā)酵食品的羅伊氏粘液乳桿菌的編碼碳水化合物活性酶的基因預(yù)測(cè)結(jié)果類(lèi)似，且K07 菌株也分離自發(fā)酵產(chǎn)品，故推測(cè)相同環(huán)境分離的菌株為同源[39]。

表5 羅伊氏粘液乳桿菌K07的GTs和GHs家族數(shù)量Table 5 Numbers of GTs and GHs family for Limosilactobacillus reuteri K07

圖8 CAZy功能分類(lèi)圖Fig.8 Function classification diagram of CAZy

3 結(jié)論

本文從新疆昭蘇縣傳統(tǒng)發(fā)酵乳酪中分離出兩株羅伊氏粘液乳桿菌K07、K08，對(duì)它們的益生特性研究發(fā)現(xiàn)，跟菌株K08 相比，K07 在各方面表現(xiàn)優(yōu)異。K07 菌株生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)酸耐酸性能良好，能夠耐受模擬胃腸道環(huán)境的脅迫，存活率可達(dá)74.13%；對(duì)白色念珠菌和無(wú)乳鏈球菌的抑制能力強(qiáng)于K08 菌株，K07 對(duì)兩株致病菌的抑菌圈直徑分別為15.79 mm 和19.31 mm?？寡趸钚苑矫?，K07 的無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)DPPH 自由基清除率達(dá)到42.39%，羥自由基清除率為15.69%，還原力為17.96%。基因測(cè)序顯示K07 基因全長(zhǎng)1 950 440 bp，預(yù)測(cè)到的抗性基因蛋白總個(gè)數(shù)為25 個(gè)，占基因蛋白總數(shù)的1.30%，對(duì)達(dá)托霉素、林可霉素等有一定的抗性；菌株中GTs 和GHs 含量相對(duì)豐富。綜上所述，羅伊氏粘液乳桿菌K07 具有優(yōu)良的益生特性，為菌株應(yīng)用及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了研究支撐。