高效液相色譜-內(nèi)標(biāo)法測(cè)定香辛料中15種多環(huán)芳烴類污染物（PAHs）

侯美玲，馮桂蓉，蔡小欽，黃丹丹，董憲兵

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（調(diào)味品監(jiān)管技術(shù)），重慶 401121）

多環(huán)芳香族碳?xì)浠衔铮≒olycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是一類具有“致畸、致癌、致突變”特性的環(huán)境污染物，因其危害性較大，美國(guó)環(huán)保署已將其中的16 種列為監(jiān)測(cè)重點(diǎn)對(duì)象，歐盟食品安全局也對(duì)其中8 種做了限量要求，并選取了4 種（?、苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽和苯并[a]蒽）作為評(píng)價(jià)食品中PAHs 污染的指標(biāo)[1]。我國(guó)現(xiàn)行污染物限量標(biāo)準(zhǔn)（GB2762）中對(duì)苯并[a]芘作了限量要求，類別包括乳制品、谷物、肉類等，與歐盟等國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)相比，無(wú)論品種還是限量，目前均存在一定差距。目前對(duì)香辛料中多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法以及污染水平國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，重慶作為香辛料盛產(chǎn)基地，在全國(guó)調(diào)味品市場(chǎng)占有十分重要地位，因此，有必要建立香辛料中多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法，對(duì)我市地產(chǎn)香辛料中多環(huán)芳烴污染污染狀況及其生態(tài)防治研究具有重要意義。

多環(huán)芳烴檢測(cè)方法中，氣相色譜質(zhì)譜法和高效液相色譜法運(yùn)用較廣，其中，高效液相色譜法法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，靈敏度高，被廣泛運(yùn)用于地下水、熏烤肉制品、植物油等食品中多環(huán)芳烴的檢測(cè)[2,3]。前處理方面主要有固相萃取方法或者不同固相萃取小柱串聯(lián)的方式[4,5]、凝膠滲透色譜法[6]、QuEChERS法（Quick,Eeasy,Cheap,Effective,Rugged and Safe）[7]、超分子溶劑微萃取[8,9]等技術(shù)。香辛料基質(zhì)復(fù)雜，內(nèi)含色素、糖類、有機(jī)酸、甾類等多種成分，現(xiàn)行報(bào)道的檢測(cè)方法大多數(shù)為有機(jī)溶劑提取，外標(biāo)法定量，前處理對(duì)于香辛料類來(lái)說(shuō)，存在的難點(diǎn)為：一是正己烷等脂溶性有機(jī)試劑提取目標(biāo)物的同時(shí)也會(huì)將香辛料中油脂等雜質(zhì)提取出來(lái)，凈化時(shí)會(huì)堵塞小柱，凈化效果不佳；二是香辛料中色素等雜質(zhì)未能去除，上機(jī)前樣品顏色太深，容易堵塞儀器；三是外標(biāo)法定量，目標(biāo)物回收率太低，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性不好。

本研究選取來(lái)自市內(nèi)不同種植基地花椒（青花椒、紅花椒）和辣椒（二荊條、小米辣、石柱紅）樣品，建立了香辛料中多環(huán)芳烴污染的高效液相色譜-熒光檢測(cè)器結(jié)合內(nèi)標(biāo)定量方法，同時(shí)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)不同區(qū)縣、不同品種的香辛料樣品中多環(huán)芳烴污染水平進(jìn)行分析，以期為香辛料的食品安全科學(xué)監(jiān)管，以及評(píng)價(jià)其環(huán)境污染程度及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒和花椒樣品均來(lái)自市內(nèi)各種植基地，詳見(jiàn)表1。

表1 香料樣品信息Table 1 Sample information of spices

PAHs 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（含萘（Nap）、苊（Ace）、芴（Flu）、菲（Phe）、蒽（Ant）、熒蒽（Fle）、芘（Pyr）、苯并 [a]蒽（BaA）、?（Chr）、苯并 [b]熒蒽（BbF）、苯并[k]熒蒽（BkF）、苯并 [a]芘（BaP）、茚并 [1,2,3-c,d]芘（Inp）、二苯并[a,h]蒽（DahA）和苯并[g,h,i]苝)（BghiP）（200 μg/mL），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；苯并 [a]芘標(biāo)準(zhǔn)溶液-D12（BaP-D12）（200 μg/mL），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

C18 多環(huán)芳烴專用色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；弗羅里硅土（Florisil）固相萃取小柱（500 mg，6 mL），華譜生物科技（重慶）有限公司；QuEChERS 凈化管（2 mL），華譜生物科技（重慶）有限公司；高效液相色譜儀—熒光檢測(cè)器（U3000），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

氫氧化鈉溶液（5 mol/L）：稱取20 g 氫氧化鈉，用水定容至100 mL，臨用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

提?。悍Q取1 g 試樣于50 mL 離心管中，加入100 μL BaP-D12內(nèi)標(biāo)使用液（100 ng/mL），加入5 mL氫氧化鈉溶液（5 mol/L）渦旋，超聲10 min，加入10 mL 乙腈溶液，超聲30 min，5 000 r/min 離心，上層溶液于30 ℃氮吹干，10 mL 正己烷溶解，待凈化。

凈化：Florisil 小柱依次用3 mL 正己烷，3 mL二氯甲烷活化，將正己烷溶解液轉(zhuǎn)移至小柱中，流量控制1 mL/min，待樣液全部通過(guò)小柱后，依次用5 mL 正己烷和10 mL 二氯甲烷淋洗和洗脫，收集洗脫液于30 ℃氮吹，乙腈定容至1 mL，待測(cè)。

1.3 液相條件

流動(dòng)相：A 乙腈和B 水。

梯度洗脫時(shí)間：0～25 min，40% A；25～35 min，40% A～100% A；35～40 min，100% A；40～45 min，40% A。

流量：1.0 mL/min。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。波長(zhǎng)設(shè)置：見(jiàn)表2。

表2 多環(huán)芳烴的波長(zhǎng)切換參數(shù)Table 2 15th PAHs parameters of excitation wavelength and emission wavelength and switching time

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Dionex UltiMate 3000 的Chromeleon 色譜管理系統(tǒng)軟件計(jì)算樣品含量，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 22.0 以及Origin Pro 2022 進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

多環(huán)芳烴屬于非極性物質(zhì)，常用提取溶劑有正己烷、石油醚、乙腈等[10-12]，因正己烷極性較弱，根據(jù)相似相溶原理，選取正己烷當(dāng)提取液，分別對(duì)陰性辣椒、花椒以及試劑空白進(jìn)行同一質(zhì)量濃度（20 μg/kg）加標(biāo)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試劑空白和花椒樣品中多環(huán)芳烴化合物能有效分開(kāi)，響應(yīng)較穩(wěn)定，回收率分別在81.40%～101.59%、74.06%～91.08%范圍內(nèi)，辣椒中多環(huán)芳烴響應(yīng)值明顯下降，回收率在3.22%～22.42%之間，且雜質(zhì)峰較多，影響目標(biāo)物出峰。因辣椒中主要含有辣椒素，辣椒素極性與多環(huán)芳烴類似，且具有熒光性質(zhì)[13]，通過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)摸索，我們推測(cè)辣椒素是影響辣椒中多環(huán)芳烴響應(yīng)值的主要因素，因此，實(shí)驗(yàn)分別配制了含辣椒素與不含辣椒素的多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行對(duì)比（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有辣椒素200 ng/mL 的多環(huán)芳烴與不含辣椒素的多環(huán)芳烴響應(yīng)值相差不大，但含有辣椒素40 μg/mL 的多環(huán)芳烴響應(yīng)值僅為不含辣椒素的十分之一，即多環(huán)芳烴響應(yīng)值隨著辣椒素濃度的升高而降低。辣椒素是辣椒的主要成分，不同辣椒的辣椒素含量雖不盡相同，但基本都在mg/kg 以上，含量較高[14]。有研究表明，辣椒素能抑制負(fù)責(zé)致癌多環(huán)芳烴代謝的芳香烴羥化酶，從而能夠?qū)Χ喹h(huán)芳烴誘導(dǎo)的癌癥具有保護(hù)作用[15]，這也可能是辣椒素影響多環(huán)芳烴的原因之一，但具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖1 添加不同濃度辣椒素的多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值比較Fig.1 Comparison fluorescent response of standard solution of polycyclic aromatic hydrocarbons containing different concentrations of capsaicin

辣椒素因含有酚羥基，能溶于堿性水溶液，堿水法目前在辣椒素的分離、純化中運(yùn)用較廣泛[16]，因此，本研究考慮采用氫氧化鈉溶液去除辣椒素的干擾。分別對(duì)比了添加氫氧化鈉和不添加氫氧化鈉溶液的回收率（圖2）。結(jié)果表明，加氫氧化鈉的樣品，多環(huán)芳烴回收率能提高1 倍左右，提取效率大大提高。

圖2 加氫氧化鈉和不加氫氧化鈉的多環(huán)芳烴回收率對(duì)比Fig.2 The recovery of adding sodium hydroxide and not adding sodium hydroxide

多環(huán)芳烴屬于親脂性化合物，水溶液中多環(huán)芳烴需用有機(jī)溶劑萃取，本文分別考察了乙腈、正己烷、丙酮、二氯甲烷提取效果。向陰性辣椒基質(zhì)中加入20 μg/kg 多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，比較提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 種試劑的回收率范圍在42.26%～64.07%之間，各試劑間回收率差別不明顯，但是丙酮和二氯甲烷提取液的顏色更深，后續(xù)較難凈化，這可能是因?yàn)橐恍┲苄陨卦诒投燃淄橹腥芙庑愿脤?dǎo)致[17]，其中二氯甲烷因密度大，目標(biāo)物在下層，萃取不方便。乙腈和正己烷溶液去除色素效果更好，正己烷沸點(diǎn)較低，在后續(xù)超聲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中容易揮發(fā)，綜合分析，采用乙腈作為萃取溶劑。

2.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

受雜質(zhì)影響，辣椒中多環(huán)芳烴響應(yīng)值較低，加入堿性溶液后回收率雖有所提高，但也僅在60%左右。為了提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本文考慮使用內(nèi)標(biāo)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行校正。目前內(nèi)標(biāo)法一般與氣相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合測(cè)定多環(huán)芳烴運(yùn)用較多，如沙賢亮等[18]、孫細(xì)珍等[19]和錢雅慧等[20]基于同位素內(nèi)標(biāo)分別建立了辣條、中藥材以及土壤中多環(huán)芳烴測(cè)定方法，并取得了很好的效果，暫未有內(nèi)標(biāo)法與液相色譜法結(jié)合測(cè)定多環(huán)芳烴的報(bào)道。因辣椒中多環(huán)芳烴的獨(dú)特性，本文考慮使用跟多環(huán)芳烴性質(zhì)類似的同位素化合物作為內(nèi)標(biāo)，主要難點(diǎn)是將同一種化合物與其同位素內(nèi)標(biāo)峰有效分開(kāi)。實(shí)驗(yàn)分別配制了苯并[a]蒽-D12（BaA-D12）、?-D12（Chr-D12）、苯并[b]熒蒽-D12（BbF-D12）、苯并[k]熒蒽-D12（BkF-D12）、BaP-D12共5 種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機(jī)測(cè)試，并分別與各自外標(biāo)溶液出峰時(shí)間進(jìn)行對(duì)比（圖3）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：通過(guò)調(diào)節(jié)梯度，Chr-D12與Chr 以及BbF-D12和BbF 能有效分開(kāi)，但Chr-D12與BaA、BbF-D12與Chr 出峰時(shí)間相近，對(duì)目標(biāo)物存在一定干擾。BaA-D12與BaA、BkF-D12與BkF以及BaP-D12與BaP 均能有效分開(kāi)，適合作內(nèi)標(biāo)，但個(gè)別品種辣椒在BaA-D12出峰附近有雜質(zhì)峰，難以區(qū)分，BaP-D12比BkF-D12響應(yīng)值高很多，且出峰時(shí)間附近無(wú)其他干擾，綜合分析，本文最終采用BaP-D12作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法處理后的回收率見(jiàn)圖4，從圖中看出，加入內(nèi)標(biāo)校正后，15 種多環(huán)芳烴化合物回收率均不同程度上升，回收率在62.70%～109.81% 之間，能滿足日常檢測(cè)需求。

圖3 多環(huán)芳烴內(nèi)標(biāo)溶液與外標(biāo)溶液保留時(shí)間對(duì)比Fig.3 Comparison of retention time between internal and external standard mixed solutions of PAHs

圖4 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法處理樣品后回收率比較Fig.4 Comparison of recoveries of samples pretreated by internal standard method and external standard method

2.3 凈化條件的優(yōu)化選擇

目前對(duì)多環(huán)芳烴凈化處理大多數(shù)采用固相萃取、QuEChERS 和超分子溶劑等方式，其中，超分子溶劑法對(duì)溶劑要求較高，適用性不強(qiáng)。對(duì)于富含脂質(zhì)和色素的食品，用固相萃取方式凈化效果較好[21-23]。本研究對(duì)比了4 種小柱（石墨碳化黑（Graphite Carbide Black，GCB）、分子印跡柱、QuEChERS和Florisil）對(duì)辣椒中多環(huán)芳烴的凈化效果，如圖5所示。

圖5 4 種凈化方式處理辣椒中多環(huán)芳烴回收率比較Fig.5 Comparison of recovery of 4th purification method effect on pepper

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GCB 小柱使目標(biāo)物損失較大。GCB 帶有芳香性的正六元環(huán)平面分子結(jié)構(gòu)，能吸附平面環(huán)狀目標(biāo)物，而多環(huán)芳烴大多數(shù)種類都具有平面環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如萘、菲、芘等，因此GCB 雖對(duì)吸附辣椒色素具有良好效果，但同時(shí)也造成目標(biāo)物損失，這與陳玲等[24]的研究結(jié)果相似。Florisil、分子印跡柱以及QuEChERS 方法回收率相差不大，其中，分子印跡柱除色效果不佳，對(duì)辣椒基質(zhì)中多環(huán)芳烴的吸附特異性表現(xiàn)不強(qiáng)，且上樣時(shí)流動(dòng)性差，凈化效果不理想；QuEChERS 方法雖前處理簡(jiǎn)單，但對(duì)色素凈化效果不明顯，而Florisil 小柱不僅能吸附色素，除去部分極性物質(zhì)，使樣液保持透明澄清狀態(tài)，同時(shí)回收率也能滿足實(shí)驗(yàn)要求，F(xiàn)lorisil、分子印跡柱以及QuEChERS 處理的樣液見(jiàn)圖6。綜合考慮，本研究最終選擇Florisil 小柱。

圖6 分子印跡柱、QuEChERS 和Florisil 處理后的辣椒濃縮樣品圖Fig.6 Concentrated chilli samples after processed by monolithic molecular imprinted,QuEChERS and Florisil

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

配制質(zhì)量濃度為0～100 ng/mL 的PAHs 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（含BaP-D1210 ng/mL），以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度（x）為橫坐標(biāo)，PAHs 峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示15 種PAHs 呈良好線性，相關(guān)系數(shù)（r）在0.996 4～0.999 6 之間。分別向空白辣椒和花椒中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 倍、10 倍信噪比確定方法檢出限和定量限，辣椒中檢出限：0.5～3.0 μg/kg；定量限2.0～10.0 μg/kg；花椒中檢出限：0.5～1.0 μg/kg；定量限2.0～3.0 μg/kg，詳見(jiàn)表3。

表3 15種PAHs方法學(xué)參數(shù)Table 3 Methodological parameters of 15th PAHs

分別向空白辣椒和花椒中添加2.0、10.0 和50.0 μg/kg 三個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2 前處理步驟每個(gè)水平做6 個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4 和表5，得到辣椒粉中回收率范圍為60.58%～119.48%，RSD 為1.25%～9.61%?；ń贩壑谢厥章史秶鸀?0.46%～119.24%，RSD 為1.10%～8.56%。

表4 辣椒中多環(huán)芳烴回收率和RSDTable 4 Recovery and relative standard deviation of PAHs in Capsicum (n=6)

表5 花椒粉中多環(huán)芳烴回收率和RSDTable 5 Recovery and relative standard deviation of PAHs in Zanthoxylum (n=6)

以添加濃度水平、化合物以及品種為固定因子，回收率為因變量，進(jìn)行了多因素方差分析,對(duì)不同數(shù)據(jù)間進(jìn)行事后多重比較,以P＜0.05 作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，不同濃度水平以及化合物間回收率有顯著差異（P＜0.05），而品種間差別不大（P=0.133）。

2.5 地產(chǎn)香辛料中多環(huán)芳烴污染水平

采用所建立的方法對(duì)我市種植基地的69 批次樣品進(jìn)行了測(cè)定（含辣椒30 批次，花椒39 批次），包括二荊條、石柱紅、小米辣和青花椒、紅花椒5 個(gè)品種，多環(huán)芳烴總量（∑PAHs）檢出值從大到小依次為：青花椒（561.2 μg/kg）＞二荊條（448.8 μg/kg）＞紅花椒（358.3 μg/kg）＞石柱紅（353.6 μg/kg）＞小米辣（243.5 μg/kg）。不同品種中多環(huán)芳烴檢出含量差別較大，其中，Nap、BghiP 和InP 檢出率較低，僅在二荊條和青花椒中檢出，石柱紅和小米辣均未檢出這三種物質(zhì)；Ace、BkF、BaP、DahA 平均含量均低于10.0 μg/kg；Phe、Fle、Pyr 檢出率較高，且都是各品種中檢出值較高的化合物，Phe 的平均檢出值最高，范圍為170.8～243.6 μg/kg；Fle 的平均值范圍為28.3～83.0 μg/kg；Pyr 的平均值范圍為21.7～118.2 μg/kg，各種植區(qū)縣中，璧山、江津、榮昌、黔江受多環(huán)芳烴污染較嚴(yán)重，∑PAHs 檢出值在500 μg/kg 以上。詳見(jiàn)圖7 和圖8。將樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行方差分析，得出F=6.022，P＜0.05。其中，產(chǎn)地、品種和化合物均P＜0.05，說(shuō)明不同產(chǎn)地、不同品種、不同化合物間均具有顯著差異，產(chǎn)地與化合物之間交互作用不明顯，詳見(jiàn)表6。

圖7 5 種香辛料中多環(huán)芳烴污染水平Fig.7 Contamination levels of 15 kinds of PAHs in 5 kinds of spices (μg/kg)

圖8 不同種植區(qū)縣香辛料中∑PAHs 檢出值Fig.8 Distribution total content of 15 kinds of PAHs in different districts of Chongqing spices materials (μg/kg)

表6 樣品方差分析Table 6 Variance analysis of samples

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)PAHs 在種植土壤、地下水、蔬菜等介質(zhì)中的殘留、分布及特征等進(jìn)行了大量研究。如Agarwal 等[25]分析了印度德里各個(gè)農(nóng)場(chǎng)表層土壤中16 種PAHs 范圍在830～3 880 μg/kg 之間，并且市區(qū)濃度均高于農(nóng)村；楊國(guó)義等[26]研究表明珠江三角洲典型區(qū)域農(nóng)業(yè)土壤中16 種PAHs 的平均含量24 412 μg/kg 且以三環(huán)和四環(huán)的PAHs 為主；龍明華等[27]檢測(cè)出南寧市不同區(qū)域5 種蔬菜的∑PAHs 含量范圍在140.62～741.06 μg/kg；也有少量報(bào)道表明香辛料在加工過(guò)程中容易受到多環(huán)芳烴污染，如Rozentale 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)由干燥后的大部分干香料（黑胡椒、辣椒粉和肉豆蔻）和香草（小葉薄荷、羅勒和百里香）樣品的PAH4 含量增加至1.0～25.8 μg/kg；Fasano 等[29]測(cè)得西班牙煙熏辣椒粉中的10 種PAHs，范圍從5 332 μg/kg 到18 118 μg/kg，主要為是熒蒽和芘，與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

本研究采用氫氧化鈉-乙腈作為提取液，經(jīng)正己烷復(fù)溶后，采用弗羅里硅土固相萃取小柱富集除雜，用苯并[a]芘-D12對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量，建立了香辛料中多環(huán)芳烴的高效液相色譜方法。與之前的研究方法相比，本文創(chuàng)新性的采用內(nèi)標(biāo)與液相結(jié)合的方式，提高了檢測(cè)效率，適用于含香辛料基質(zhì)的食品中PAHs 的檢測(cè)。另外，本文對(duì)我市地產(chǎn)辣椒和花椒樣品中多環(huán)芳烴含量水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)我市不同種植基地以及不同香辛料品種均不同程度受到多環(huán)芳烴污染，下一步可對(duì)不同香辛料、不同種植區(qū)域、不同種植土壤等研究，以探究其影響因素、產(chǎn)生來(lái)源及暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等。