蘿卜硫苷的高效純化技術(shù)研究進(jìn)展

李金旺，甄少波，李修德，周麟依，劉奕忍，李金峰

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）（2.中國勞動關(guān)系學(xué)院酒店管理學(xué)院，北京 100048）（3.北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測試研究所(北京市理化分析測試中心)，北京 100094）（4.青島儒商飲料有限公司，山東青島 266418）

蘿卜硫苷（Glucoraphanin，RAA）是一種由甲硫氨酸衍生而成的脂肪族硫代葡萄糖苷。RAA 由一個帶側(cè)鏈的β-硫代葡萄糖苷N-羥基硫酸鹽和一個β-D-吡喃葡萄糖殘基構(gòu)成的水溶性物質(zhì)，其廣泛的存在于十字花科植物中[1-3]。RAA 的代謝產(chǎn)物具有抑菌、抗炎和抑制癌癥的生理活性，對維護(hù)機(jī)體健康具有重要作用[4,5]。然而，目前從十字花科植物中提取的RAA提取物富含大量的蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，不利于RAA 的后期利用，因此需要對RAA 進(jìn)行純化。目前，分離純化RAA 的主要方法是色譜純化技術(shù)[6]。色譜純化技術(shù)主要是柱色譜純化技術(shù)和液相色譜純化技術(shù)（Liquid Chromatography，LC）。然而，色譜純化技術(shù)在純化RAA 方面有諸多缺點(diǎn)，如色譜純化技術(shù)的純化效率較低、RAA 的損失率高和RAA 的回收率低。

為進(jìn)一步提高RAA 純化效率，研究人員開始探究其他純化技術(shù)在RAA 純化中應(yīng)用的可能性。其中研究人員關(guān)注最多的技術(shù)是膜純化技術(shù)，該技術(shù)的原理是利用膜的選擇透過性和膜兩側(cè)的壓力差，將溶液中無法分離的組分分開。由于膜純化技術(shù)是物理純化技術(shù)，因此不會對溶液中的成分造成化學(xué)變化，對天然產(chǎn)物具有一定的保護(hù)作用[7-9]。在此背景下，膜純化技術(shù)被廣泛用于食品加工和制藥等行業(yè)[10-14]。盡管研究表明膜純化技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)植物天然產(chǎn)物的有效純化，但膜純化技術(shù)在RAA 純化過程中的純化效果仍有不足[15-17]。本文主要分析了目前RAA 純化的主要技術(shù)以及膜純化技術(shù)與色譜純化技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用在RAA 純化領(lǐng)域的可能性，也為進(jìn)一步拓展RAA 高效純化技術(shù)提供理論和方法支撐。

1 色譜技術(shù)在RAA純化過程中的應(yīng)用

1.1 柱色譜技術(shù)在RAA純化過程中的應(yīng)用

由于RAA 結(jié)構(gòu)中存在離子化的硫酸鹽和親水性的硫代葡萄糖殘基等結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蘿卜硫苷的辛醇—水分配系數(shù)較低，使得難以從RAA 粗提取物中分離純化得到RAA 純品[6]。目前，分離純化RAA 的主要技術(shù)是柱色譜技術(shù)（圖1）。Toribio等[18]利用硫酸基團(tuán)與烷基銨離子配對原理成功構(gòu)建了一種強(qiáng)離子交換離心分配色譜（Strong Ion-Exchange Centrifugal Partition Chromatography，SIXCPC）。RAA 粗提取物經(jīng)SIX-CPC 分離純化后，粗提取物中大部分的蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)被去除，得到RAA 純化物，并且分離純化后RAA 純度為98%。由于SIX-CPC 可以獲得高純度的RAA，研究人員開始探究柱色譜技術(shù)在RAA 純化中應(yīng)用前景。

圖1 柱色譜技術(shù)純化RAA 機(jī)制Fig.1 Mechanism of purification of RAA by column chromatography

近年來，研究人員[19]發(fā)現(xiàn)，以D261 強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂為柱色譜填充材料同樣可以實(shí)現(xiàn)純化RAA 的目的。自印度芥菜籽中提取的RAA 在D261強(qiáng)堿性陰離子交換色譜純化后的純度是58.37%，且蘿卜硫苷的回收率是79.82%。盡管該條件下的RAA 回收率較高，但是RAA 的純度較低，不利于RAA 的后續(xù)利用。因此，為進(jìn)一步提高RAA 的純度，Wang 等[20]以大孔陰離子樹脂色譜純化黑芥子苷后發(fā)現(xiàn)大孔陰離子樹脂色譜純化后的黑芥子苷純度為95%，黑芥子苷回收率約77.38%。然而，另有研究人員在此基礎(chǔ)上結(jié)合樹脂改性技術(shù)構(gòu)建了另一種純化RAA 的大孔樹脂純化技術(shù)[21]。該色譜技術(shù)以聚甲基丙烯酸縮水甘油酯（Poly Glycidyl Methacrylate，PGMA）和強(qiáng)堿性三乙胺改性PGMA 為填充材料，通過該色譜技術(shù)純化RAA 的色度顯著降低，且純化后RAA 的純度為75%，回收率為81%。但是，基于大孔離子樹脂的色譜純化技術(shù)無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)高RAA 純度和高回收率的目標(biāo)。

因此，為提高RAA 純度和回收率，Chen等[22]將硅膠色譜純化技術(shù)應(yīng)用于RAA 純化，且純化后的RAA 純度為91.7%，回收率為5.5 g/100 g種子。同時(shí)，Chen 等的結(jié)果同樣表明，傳統(tǒng)的柱色譜技術(shù)可以從十字花科植物粗提取液中分離純化得到RAA，但是無法同時(shí)兼顧RAA 的純度和回收率。另外，色譜柱的吸附和解吸能力有限，在柱色譜純化過程中會損失大量的RAA。另外，柱色譜的洗脫液為無機(jī)鹽溶液，導(dǎo)致RAA 溶液中無機(jī)鹽離子濃度較高，導(dǎo)致RAA 終產(chǎn)物中含有無機(jī)鹽離子，影響RAA 的生產(chǎn)和應(yīng)用。

1.2 LC純化技術(shù)在RAA純化過程中的應(yīng)用

隨著研究的深入，LC 技術(shù)已成為有機(jī)物分離純化的首選方法（表1）。LC 技術(shù)可以純化大分子有機(jī)物和小分子有機(jī)物。隨著材料科學(xué)的發(fā)展，符合食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的LC 填充材料不斷被研發(fā)[23]。因此，從總硫代葡萄糖苷提取物中分離純化RAA 的LC 技術(shù)得到迅速發(fā)展并成為目前純化RAA 的主要技術(shù)之一。

表1 色譜法純化RAATable 1 Purification of RAA by chromatography

研究表明，逆流色譜（Countercurrentchromatography，CCC）作為一種液-液分配色譜技術(shù)可以利用固定相和流動相對各組分分配系數(shù)（KD）的不同來實(shí)現(xiàn)RAA 的分離純化（圖2）。純化過程中，KD 低的組分先被分離，從而實(shí)現(xiàn)不同組分的分離純化[28]。有研究人員利用高速逆流色譜（High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC）純化RAA，純化后RAA 的純度為98%，回收率約為90%[24]。結(jié)果表明，HSCCC 可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)RAA 純度高和高回收率兩個目標(biāo)，與柱色譜技術(shù)純化RAA的效率相比有明顯提高。因此，結(jié)合鹽析理論的HSCCC 可進(jìn)一步提高RAA 的純度[25]。

圖2 液相色譜技術(shù)純化RAA 機(jī)制Fig.2 Mechanism of purification of RAA by liquid chromatography

由于LC 技術(shù)的發(fā)展，研究人員探究了反相LC技術(shù)在純化RAA 中的效果。Xie 等[26]以O(shè)DS-BP為固定相，結(jié)合反相LC 純化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了RAA 的純化。反相ODS-BP LC 技術(shù)利用RAA 的離子特性，實(shí)現(xiàn)不同硫代葡萄糖苷同分異構(gòu)體的分離，在此條件下，RAA 的純度為98%。也有研究者采用半制備型HPLC 純化RAA，該研究以乙腈為洗脫液，葡聚糖凝膠柱Sephadex lh-20 (MeOH)為脫鹽處理?xiàng)l件，發(fā)現(xiàn)經(jīng)該方法處理之后RAA 的純度和回收率明顯提升，無機(jī)鹽離子含量降低[27]。通過超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用/質(zhì)譜分析表明，從板藍(lán)根提取液中同時(shí)分離純化出4 種硫代葡萄糖苷（Progoitrin、Epprogoitrin、Gluconapin 和Neoglucobrassicin）。但是，由于半制備HPLC 洗脫液類型為有機(jī)溶劑，嚴(yán)重影響了該技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

雖然LC 純化技術(shù)可以從總硫代葡萄糖苷中分離純化RAA，但該過程需要大量的高濃度無機(jī)鹽溶液和高極性溶液。因此，液相色譜純化技術(shù)會消耗大量的時(shí)間和溶劑。同時(shí)，部分純化溶劑有毒，不適合食品級產(chǎn)品的開發(fā)利用。但基于目前的工業(yè)基礎(chǔ)，LC 純化技術(shù)的設(shè)備要求和技術(shù)工藝要求高，且在LC 純化過程中，RAA 的損失比較大，因此LC 無法達(dá)到規(guī)模純化的程度。

2 膜純化技術(shù)在RAA純化過程中應(yīng)用

膜純化是利用膜的選擇透過性原理，通過外加壓力，使高于膜截留分子量的物質(zhì)被截留在膜表面，低于膜截留分子量的物質(zhì)通過濾膜，從而使液體中的成分實(shí)現(xiàn)分離的方法。根據(jù)膜孔徑的大小依次可以將過濾膜分為微濾膜、超濾膜和納濾膜等。由于所使用的過濾膜種類和性質(zhì)的不同，膜純化法可以分為微濾法（Microfiltration，MF）、超濾法（Ultrafiltration，UF）、納濾法（Nanofiltration，NF）和反滲透（Reverse Osmosis，RO）等，且基于膜的純化技術(shù)（UF 和NF 等）已被證明能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模的生物活性物質(zhì)的回收、分離和純化（表2）[29,30]。

表2 食品工業(yè)常用的膜純化技術(shù)Table 2 Membrane purification technology commonly used in food industry

研究表明，膜純化技術(shù)是分離純化乳制品中脂類、寡糖和蛋白膠束等大分子物質(zhì)最常用的純化技術(shù)[31-33]。在純化乳清中的蛋白質(zhì)過程中發(fā)現(xiàn)，膜純化技術(shù)對乳制品中的天然物質(zhì)也具有分離純化作用[34-36]。隨著膜純化技術(shù)研究的不斷深入，膜純化技術(shù)被應(yīng)用于植物天然產(chǎn)物的分離純化[37-39]。研究人員證明膜純化技術(shù)對多酚具有很高的純化效率[40-45]。同時(shí)，膜純化技術(shù)對黃酮類[46]、類胡蘿卜素[47,48]、維生素[49]、有機(jī)酸[50-53]、氨基酸[54,55]和脂肪酸[56]等天然物質(zhì)也有較高的純化效率。隨著時(shí)間的發(fā)展，膜純化技術(shù)在純化水[57-63]和醫(yī)藥制造[64-68]中也有廣泛的應(yīng)用。

陶瓷膜具有穩(wěn)定性高、抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在物質(zhì)的分離和純化中有著廣泛的應(yīng)用[69-73]。由于陶瓷管式超濾膜可以去除雜質(zhì)物質(zhì)，Sjolin 等[74]用陶瓷管式濾膜純化蔗糖。結(jié)果表明，采用陶瓷管純化技術(shù)可以得到高純度蔗糖，且蔗糖的材料結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。但是研究人員發(fā)現(xiàn)，單一的陶瓷膜純化系統(tǒng)的純化效果不是十分理想，且純化效率較慢。因此，研究人員將兩種截留分子量不同的超濾膜（100 ku 和1 ku）組合集成膜純化系統(tǒng)，并用該集成膜純化系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了自甜葉菊的水提取物中純化甜菊皂苷A（Rebaudioside A，Reb A）的目的[16]。集成膜純化后Reb A 的顏色得到了進(jìn)一步純化，但是該集成膜純化系統(tǒng)純化Reb A 的時(shí)間較長，嚴(yán)重制約了集成膜系統(tǒng)的純化效率。

同時(shí)，研究人員[16,74]發(fā)現(xiàn)膜純化技術(shù)是蔗糖最佳的純化技術(shù)，且同為葡萄糖衍生物的Reb A 同樣可以通過膜純化技術(shù)進(jìn)行純化，而且膜純化后的蔗糖和Reb A 表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性、純度以及回收率。由于RAA 同樣是葡萄糖衍生物，與Reb A 具有相似的葡萄糖殘基，因此膜純化技術(shù)可用于RAA純化。超濾法作為以酸性氧化鋁填充材料的制備色譜法純化硫代葡萄糖苷的除雜技術(shù)，用來除去亞麻籽提取物中的蛋白質(zhì)[75]。Eder 等[76]以10 ku 聚醚砜超濾膜純化多糖，多糖回收率為90%。因此，膜純化技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于多糖的純化[77,78]。近年來，死端過濾技術(shù)被應(yīng)用于RAA 的純化，在1 ku 超濾膜純化條件下，果汁中的大部分雜質(zhì)（蛋白質(zhì)和膠體）被除去，果汁中的硫代葡萄糖苷純度從35.2%提高到90.1%，且RAA 沒有降解（圖3）[15]。但研究人員同時(shí)發(fā)現(xiàn)，死端過濾在純化RAA 一段時(shí)間后的純化效率會降低，主要是大部分的雜質(zhì)被截留于超濾膜表面，阻塞膜孔，限制了死端過濾純化RAA的效率。

圖3 膜純化技術(shù)純化RAA 機(jī)制Fig.3 Purification mechanism of RAA by membrane purification technology

因此，膜純化技術(shù)具有以下特點(diǎn)：可控的溫度和壓力操作條件能夠保持目標(biāo)物質(zhì)的功能性；無需其他化學(xué)試劑或添加助劑，從而避免了目標(biāo)物質(zhì)的二次污染；對特定化合物具有極高的選擇性，對重金屬離子和無機(jī)鹽離子的去除效果較好[9,30,79]。基于膜純化的優(yōu)勢，祝亞輝等[80]通過膜過濾技術(shù)將粗提液中RAA 的純度由34.96%成功提升至54.89%。然而，膜純化技術(shù)在分離純化過程中仍存在一些不足，如該技術(shù)需要外加壓力會導(dǎo)致濾膜的結(jié)晶化并降低其機(jī)械強(qiáng)度，進(jìn)而導(dǎo)致膜純化的效率降低；純化過程中需要多級膜純化設(shè)備，得到的產(chǎn)品純度無法達(dá)到色譜純化技術(shù)的效果[81]。

因此，色譜純化技術(shù)和膜純化技術(shù)各有的優(yōu)缺點(diǎn)，故為了進(jìn)一步提高RAA 的純化效率及效果，今后可以開展膜純化技術(shù)和色譜純化技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。通過膜純化技術(shù)將RAA 純度提升至50%以上之后，再次利用色譜純化技術(shù)對RAA 粗提液進(jìn)一步純化，可有效提高RAA 的回收率以及純度。能夠一定程度上規(guī)避色譜純化過程中因有機(jī)試劑的添加造成RAA 二次污染的問題，縮短利用色譜純化技術(shù)獲得高純度RAA 的時(shí)間，提升RAA 純化效率。

3 展望

RAA 純化的主要技術(shù)為色譜純化技術(shù)，但該技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)高效且規(guī)?；腞AA 純化，且該技術(shù)具有二次污染和低回收率的缺點(diǎn)。此外，因膜純化技術(shù)具有規(guī)避二次污染和實(shí)現(xiàn)規(guī)模化純化的特點(diǎn)而被視為一種潛在的純化RAA 技術(shù)，其可在一定程度克服色譜純化技術(shù)的不足，為RAA 純化提供新的解決方案。因此，利用色譜純化和膜純化聯(lián)用技術(shù)對RAA 進(jìn)行純化可有效提升RAA 的回收率以及純度，提升RAA 純化效率。此外，色譜純化和膜純化聯(lián)用技術(shù)在食品工業(yè)中同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。