絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥免疫反應(yīng)相關(guān)基因的鑒定及其中藥活性成分的篩選

王剛，董舶昶，康伯源，徐西林

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150006

2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150006

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是女性絕經(jīng)后由于雌激素的中斷加速骨的丟失，是一種常見(jiàn)的、難治性的代謝性骨病。具有疼痛、脊柱變形、骨折以及對(duì)患者產(chǎn)生不良的心理狀態(tài)[1]。根據(jù)我國(guó)骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)調(diào)查，在50 歲以上的人群中，骨質(zhì)疏松癥的患者約為19.2%，其中女性的患病率可達(dá)32.5%，患病率是男性的5 倍[2]。在骨免疫學(xué)領(lǐng)域認(rèn)為免疫細(xì)胞與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞均來(lái)源于骨髓，因此在生理病理狀態(tài)下，免疫細(xì)胞與骨細(xì)胞相互影響。絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素含量減少導(dǎo)致機(jī)體處于長(zhǎng)期低水平炎癥狀態(tài)，這時(shí)機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞和免疫因子，因而骨細(xì)胞生物學(xué)功能發(fā)生改變，進(jìn)一步導(dǎo)致骨代謝平衡發(fā)生改變[3]。絕經(jīng)后女性的Th 細(xì)胞通過(guò)分泌大量的白細(xì)胞介素（IL）-17 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）參與核因子-κB 受體活化因子（RANK）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化[4]。同時(shí)，女性絕經(jīng)后，腸道菌群的數(shù)量、分布會(huì)發(fā)生顯著改變，影響免疫調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致骨礦物質(zhì)的丟失[5-6]。CD4＋T 細(xì)胞中的Treg細(xì)胞，對(duì)Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞的分化和功能具有抑制作用，同時(shí)可以分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1和抗炎因子IL-4、IL-10，抑制了破骨細(xì)胞的增殖分化[7-8]。而Th17 細(xì)胞所分泌的RANKL、IL-17、TNF-α，對(duì)破骨細(xì)胞的生成具有激活作用[4]。因此，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中免疫調(diào)節(jié)在骨代謝平衡中起到了關(guān)鍵作用。

抑制免疫反應(yīng)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治過(guò)程中起著重要的作用。研究表明，腸道菌群中的長(zhǎng)雙歧桿菌可通過(guò)Breg-Treg-Th17 細(xì)胞軸增加抗炎細(xì)胞因子（IL-10、IFN-γ）的水平，并降低促炎因子（IL-6、IL-17、TNF-α）的表達(dá)，發(fā)揮抑制免疫反應(yīng)以達(dá)到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[9]；Resolvins 來(lái)源Omega-3 脂肪酸，可通過(guò)下調(diào)炎癥細(xì)胞因子的釋放和抑制炎癥損傷部位中性粒細(xì)胞的募集來(lái)消除炎癥反應(yīng)，以達(dá)到減少破骨細(xì)胞生成的目的，作為骨質(zhì)疏松癥的新型治療方法[10]。本研究旨在闡明免疫反應(yīng)促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并探索絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥免疫反應(yīng)相關(guān)基因的生物學(xué)功能和信號(hào)通路以及靶向中藥活性成分的篩選，為靶向抑制免疫反應(yīng)和探究治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥潛在藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥差異表達(dá)基因（DEGs）的篩選

在GEO和Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)搜索“postmenopausal osteoporosis”獲得GSE230665 數(shù)據(jù)集和2 123 個(gè)基因。GSE230665 包括3 個(gè)對(duì)照組和12 個(gè)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥組，其中這15 個(gè)樣本來(lái)源于股骨的骨組織；通過(guò)R 軟件中的“l(fā)imma”數(shù)據(jù)包篩選DEGs。限定標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05 和|lg2FC|＞1 篩選出DEGs。并構(gòu)建DEGs 的火山圖進(jìn)行可視化分析。

1.2 免疫反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵基因的篩選

將GSE230665 的DEGs 和Gene Cards 數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Venny 2.1 軟件，獲得2 個(gè)數(shù)據(jù)集公共基因。將604 個(gè)公共基因輸入David 工具，依次選擇“Gene_Ontology”“GOTERM_BP_DIRECT”，在表格中查看富集在“immune response”條目的基因，并將這些基因定義為免疫反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵基因。

1.3 關(guān)鍵基因的基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析

將篩選出的關(guān)鍵基因輸入David 工具獲取GO和KEGG 通路相關(guān)分析。其中GO 功能富集分析包括生物學(xué)過(guò)程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）3 個(gè)部分。

1.4 關(guān)鍵基因的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因篩選。

利用STRING 平臺(tái)和Cystoscope 3.9.1 軟件對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。并在Cystoscope 3.9.1軟件上使用CytoNCA 插件獲取核心基因，將前10個(gè)基因定義為核心基因，并使用MCODE 插件對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行聚類分析。

1.5 鑒定與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的核心基因

在GSE230665 數(shù)據(jù)集中找到核心基因，利用熱圖觀察核心基因的表達(dá)。并用CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)的“疾病-基因”中搜索“postmenopausal osteoporosis”，得到與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)基因，然后與前10 位核心基因取交集，進(jìn)一步證實(shí)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥與核心基因相互作用，并剔除與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥無(wú)關(guān)的核心基因。

1.6 核心基因?qū)?yīng)中藥活性成分的篩選

在 CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索“postmenopausal osteoporosis”，并在“Chemical-Genes Interaction”模塊中分別搜索核心基因?qū)?yīng)的中藥活性成分，并篩選出靶向作用于各核心基因的前6 位中藥活性成分（不足6 個(gè)按實(shí)際篩選的結(jié)果）。

1.7 分子對(duì)接

在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與核心基因相互作用指數(shù)較高的中藥活性成分的3D 結(jié)構(gòu)（PDB 格式），在Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)輸入核心基因找到對(duì)應(yīng)的Uniport ID，然后將Uniport ID 輸入PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中，下載對(duì)應(yīng)的靶蛋白（PDB 格式），用PyMol 軟件對(duì)蛋白進(jìn)行處理后，再用Autodock 4 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，最后用PyMol 軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的DEGs 的確定

在 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索“ postmenopausal osteoporosis”獲得GSE230665 數(shù)據(jù)集，用R 語(yǔ)言“l(fā)imma”數(shù)據(jù)包獲得差異表達(dá)基因表格，并以“P＜0.05”和“|lg2FC|＞1”篩選出12 856 個(gè)DEGs，利用R 軟件中的“ggplot2”構(gòu)建DEGs 的火山圖，見(jiàn)圖1。

圖1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥差異表達(dá)基因的火山圖Fig.1 Volcano map of postmenopausal osteoporosis differentially expressed genes

2.2 免疫反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵基因的確定

將GSE230665 數(shù)據(jù)集的12 856 個(gè)DEGs 與GeneCards 的2 123 個(gè)基因?qū)隫enny 2.1 軟件（圖2），獲得604 個(gè)公共基因熱圖。將公共基因輸入David 工具，發(fā)現(xiàn)有前列腺素E2 受體EP4 亞型（PTGER4）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CEBPB）、信號(hào)素-7A（SEMA7A）、神經(jīng)源性基因位點(diǎn)切口同源物蛋白1（NOTCH1）、CXC 趨化因子受體4 型（CXCR4）等 43 個(gè)關(guān)鍵基因富集在“immune response”條目上，并且這43 個(gè)基因在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的表達(dá)中均上調(diào)（圖3）。

圖2 公共基因韋恩圖Fig.2 Venn diagram of public genes

圖3 關(guān)鍵基因表達(dá)熱圖Fig.3 Heat map of key gene expression

2.3 免疫反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵基因的GO 與KEGG 富集分析

將43 個(gè)關(guān)鍵基因輸入DAVID 工具進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路相關(guān)分析。GO 功能富集分析，關(guān)鍵基因主要富集在正向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、IL-12 的產(chǎn)生、干擾素-γ 介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞遷移、腫瘤壞死因子的產(chǎn)生等BP；CC 主要涉及細(xì)胞膜外側(cè)、細(xì)胞表面；MF 主要涉及肽抗原結(jié)合、受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、TAP 結(jié)合。KEGG 主要富集到趨化因子信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、TNF 信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子、核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路、TGF-β 信號(hào)通路等，見(jiàn)圖4。

圖4 關(guān)鍵基因的GO 功能富集分析和KEGG 通路分析Fig.4 GO functional enrichment analysis and KEGG pathway analysis of key genes

2.4 關(guān)鍵基因PPI 網(wǎng)絡(luò)和核心基因的確定

將關(guān)鍵基因?qū)隨TRING 平臺(tái)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化分析（圖5A），隱藏網(wǎng)絡(luò)中的斷開(kāi)節(jié)點(diǎn)，獲得40 個(gè)節(jié)點(diǎn)313 條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)，將TSV 格式表格導(dǎo)入Cytoscape，使用CytoNCA 插件計(jì)算介數(shù)中心性（BC），節(jié)點(diǎn)的大小對(duì)應(yīng)介數(shù)中心性的大小。將BC 評(píng)分前10 位基因確定位核心基因。前10 個(gè)核心基因分別為IL-10、β2-微球蛋白（B2M）、IL-17A、CXCR4、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞蛋白4（CTLA4）、Toll樣受體4（TLR4）、C-C 趨化因子受體5 型（CCR5）、神經(jīng)源性基因位點(diǎn)切口同源物蛋白1（NOTCH1）、Toll 樣受體2（TLR2）、SMAD 同源物3 重組蛋白（SMAD3）作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥免疫反應(yīng)相關(guān)的核心基因。且這10 個(gè)核心基因在DEGs 中表達(dá)均上調(diào)。對(duì)這10 個(gè)核心基因進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)互作（圖5B），獲得10 個(gè)節(jié)點(diǎn)和40 條邊，平均局部聚類系數(shù)為0.903，PPI 富集：P＜0.01。核心基因共表達(dá)結(jié)果顯示這10 個(gè)核心基因表達(dá)存在一定相關(guān)性。在Cytoscape 軟件上使用MCODE 插件構(gòu)建關(guān)鍵基因的子網(wǎng)絡(luò)2 個(gè)。子網(wǎng)絡(luò)1（圖5C）主要涉及細(xì)胞黏附分子、用于產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)；子網(wǎng)絡(luò)2（圖5D）主要涉及趨化因子信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路。對(duì)核心基因進(jìn)行富集通路分析，其富集結(jié)果大多與免疫細(xì)胞、炎癥反應(yīng)等通路相關(guān)（圖6）。

圖5 關(guān)鍵基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)（A）、核心基因PPI 網(wǎng)絡(luò)（B）、子網(wǎng)絡(luò)1 PPI 網(wǎng)絡(luò)（C）、子網(wǎng)絡(luò)2 PPI 網(wǎng)絡(luò)（D）Fig.5 PPI network of key genes (A),and PPI network of core genes (B),PPI network of subnetwork 1 (C),PPI network of subnetwork 2 (D)

圖6 核心基因富集通路圖Fig.6 Core gene enrichment pathway map

2.5 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥免疫反應(yīng)相關(guān)的核心基因的篩選與鑒定

在GSE230665 數(shù)據(jù)集中觀察篩選出的核心基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)2.4 項(xiàng)下10 個(gè)核心基因的表達(dá)均上調(diào)，再使用CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證核心基因與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥之間的相互作用，在CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)“疾病-基因”搜索“postmenopausal osteoporosis”，結(jié)果顯示有16 710 個(gè)基因與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)。16 710 個(gè)基因和篩選出的10 個(gè)核心基因取交集，交集結(jié)果顯示IL-10、B2M、IL-17A、CXCR4、TLR4、CCR5、NOTCH1、TLR2、SMAD3這9 個(gè)核心基因與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CTLA4不在交集內(nèi)，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥沒(méi)有相互作用關(guān)系，并剔除CTLA4。因此，提示上述9 個(gè)核心基因可能是修復(fù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的重要靶點(diǎn)，見(jiàn)圖7。

圖7 核心基因與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的推斷分?jǐn)?shù)Fig.7 Core gene and postmenopausal osteoporosis inference score

2.6 靶向核心基因的活性成分的篩選

選取CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)靶向作用于各核心基因的前6個(gè)中藥活性成分，見(jiàn)表1，其中相互作用數(shù)是指證明某個(gè)中藥活性成分作用于某個(gè)基因的論文數(shù)。結(jié)果顯示核心基因?qū)?yīng)的中藥活性成分為雌二醇、白藜蘆醇、槲皮素、姜黃素、雙酚A 和木黃酮等，提示這些活性成分可能是通過(guò)抑制免疫反應(yīng)來(lái)防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

表1 核心基因?qū)?yīng)的中藥活性成分Table 1 Active ingredients of traditional Chinese medicine corresponding to core genes

2.7 分子對(duì)接

使用Autodock 4 軟件將雌二醇的3D 結(jié)構(gòu)分別與核心基因TLR4、SMAD3、TLR2、IL-10、CXCR4、B2M、NOTCH1、IL-17A、CCR5進(jìn)行對(duì)接（圖8）。對(duì)接后發(fā)現(xiàn)其結(jié)合能分別為-6.79、-6.45、-6.03、-7.67、-6.49 和-6.54、-8.86、-8.51、-6.65 kcal/mol（1 cal＝4.2 J），結(jié)合能均小于-6 kcal/mol，因此，雌二醇與核心基因結(jié)合穩(wěn)定。雌二醇結(jié)構(gòu)構(gòu)象穩(wěn)定，與各蛋白形成的氫鍵豐富。如雌二醇通過(guò)氨基酸殘基GLU-230 與TLR4 形成1 個(gè)氫鍵；通過(guò)氨基酸殘基GLU-182、ALA-135 和LYS-140 與SMAD3 形成4 個(gè)氫鍵；通過(guò)氨基酸殘基LYS-150 與TLR2 形成1 個(gè)氫鍵；通過(guò)氨基酸殘基GLU-154、VAL-165 和ASP-164 與IL-10 形成4 個(gè)氫鍵；通過(guò)氨基酸殘基ARG-188 與CXCR4 形成1 個(gè)氫鍵；通過(guò)氨基酸殘基MET-99、SER-11 與B2M 形成2 個(gè)氫鍵；通過(guò)氨基酸殘基GLU-47、HIS-58 和GLU-62 與NOTCH1形成3 個(gè)氫鍵；通過(guò)氨基酸殘基GLU-118、SER-64和TRY-67 與IL17A 形成4 個(gè)氫鍵；通過(guò)氨基酸殘基THR-284、GLN-280 與CCR5 形成2 個(gè)氫鍵。對(duì)接結(jié)果顯示雌二醇可能通過(guò)核心基因?qū)^經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)揮修復(fù)作用。

圖8 雌二醇與核心基因結(jié)合點(diǎn)Fig.8 Estradiol binding sites to core genes

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是老年女性雌激素中斷后導(dǎo)致骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生損壞為特征的全身性骨病[11]。骨免疫學(xué)認(rèn)為免疫微環(huán)境參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展，RANK/RANKL/OPG 通路可通過(guò)免疫細(xì)胞、免疫因子和趨化因子對(duì)骨代謝進(jìn)行調(diào)控，導(dǎo)致骨量的吸收和形成失去平衡[12]。因此，在防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的過(guò)程中不僅要從骨代謝角度考慮，還要從抑制免疫反應(yīng)角度考慮。絕大多數(shù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者通常得不到及時(shí)的治療來(lái)預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生，從而使患者的生活質(zhì)量下降并承擔(dān)高昂的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至導(dǎo)致高死亡率[13-15]。因此，尋找絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因以及其靶向的中藥活性成分是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，為后續(xù)從免疫微環(huán)境角度出發(fā)診斷和修復(fù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供更多的機(jī)會(huì)。

本研究針對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者篩選出604個(gè)DEGs，對(duì)其進(jìn)行GO 分析，并篩選出43 個(gè)與免疫反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵基因，進(jìn)一步通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析以及CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證篩選出9 個(gè)核心基因，表明所篩選出的核心基因與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)。

研究結(jié)果顯示，這些關(guān)鍵基因主要富集于正向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、IL-12 的產(chǎn)生、TNF-α 的產(chǎn)生、細(xì)胞遷移和趨化作用等；主要作用于細(xì)胞膜外側(cè)、細(xì)胞表面和細(xì)胞外空間。研究表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血清炎癥細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-12）促進(jìn)了破骨細(xì)胞的增殖，且絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者在服用重組人甲狀旁腺激素聯(lián)合雌激素后，可有效降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，提高患者骨密度[9,16-17]。KEGG 通路分析結(jié)果顯示，趨化因子信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等。Wojdasiewicz 等[18]發(fā)現(xiàn)趨化因子CX3CL1 可以直接促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，同時(shí)CX3CL1 與免疫細(xì)胞結(jié)合并在骨表面附近產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性細(xì)胞因子。Xi 等[19]證實(shí)PI3K/Akt 通路在維持骨量的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)揮著重要作用，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化并逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生。Yasuda 等[20]證實(shí)RANKL/RANK/NF-κB 通路對(duì)破骨細(xì)胞的激活起著重要的作用，成骨細(xì)胞產(chǎn)生的RANKL 與破骨細(xì)胞表面的RANK 相結(jié)合，并誘導(dǎo)NF-κB 活化，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化；趨化因子屬于免疫調(diào)節(jié)因子，可將白細(xì)胞募集至炎癥及損傷部位，對(duì)骨的重塑具有重要的影響[12]。研究結(jié)果提示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病與趨化因子信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等密切相關(guān)。

為進(jìn)一步了解核心基因的生物功能，本研究重點(diǎn)分析了TLR4、SMAD3、TLR2、IL-10、CXCR4、B2M、NOTCH1、IL-17A、CCR5。這9 個(gè)核心基因可能在PMOP 的生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TLR4、TLR2 屬模式識(shí)別受體，Toll 受體家族成員。N-Myc 和STAT 交互子（NMI）和人干擾素誘導(dǎo)蛋白35（IFP35）可通過(guò)TLR4 激活NF-κB 通路，從而激活巨噬細(xì)胞釋放促炎癥細(xì)胞因子，并且這些炎癥細(xì)胞因子可反作用于TLR4 炎癥通路引發(fā)瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[21-22]；MYD88 和TRAF6 可通過(guò)與TLR2 相結(jié)合使NF-κB 活化，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌和炎癥反應(yīng)。并且還可以激活免疫細(xì)胞并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23-24]。SMAD3 是細(xì)胞內(nèi)的蛋白，是TGFβ 和相關(guān)蛋白的中心效應(yīng)器，對(duì)傷口愈合和骨折的早期愈合具有抑制作用[25]；IL-17A 具有潛在的強(qiáng)免疫炎癥，可激活下游TRAF6 介導(dǎo)的NF-κB 和MAP激酶途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞因子，趨化因子的轉(zhuǎn)錄激活[26]；CXCR4 可與細(xì)菌脂多糖（LPS）結(jié)合介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時(shí)可激活單核細(xì)胞分泌TNF[27]；CCR5是許多炎癥因子的受體，參與T 淋巴細(xì)胞向感染部位遷移[28]。B2M 是第一類主要組織相容性復(fù)合體（MHC）重要組成部分，參與肽抗原向免疫系統(tǒng)的呈遞[29]。NOTCH1 作為膜結(jié)合配體的受體參與胸腺中CD4 和CD8 細(xì)胞的成熟[30]。上述8 個(gè)核心基因的功能多參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和激活NF-κB 通路以促進(jìn)骨吸收，抑制骨形成，促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。而IL-10 可作用多種免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)因子，具有較強(qiáng)的抗炎作用，防止炎癥反應(yīng)過(guò)度損傷組織[31]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥屬于慢性炎性疾病，因此，抗炎和促炎細(xì)胞因子可同時(shí)存在。研究表明[32]，與健康的同齡人相比，骨質(zhì)疏松患者IL-10的表達(dá)上調(diào)，以抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生（如IL-17A），使鈣磷代謝達(dá)到平衡，抑制骨的吸收。

通過(guò)CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢各核心基因與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥之間的推斷分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示TLR2、TLR4、SMAD3、IL-10、CXCR4、B2M、NOTCH1、IL-17A、CCR5與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的推斷分?jǐn)?shù)分別為34.48、28.74、24.23、20.66、20.38、13.75、12.67、12.35、10.31。提示這些基因可能從免疫反應(yīng)角度出發(fā)修復(fù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。再用CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心基因?qū)?yīng)的中藥活性成分進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)核心基因?qū)?yīng)的中藥活性成分為雌二醇、白藜蘆醇、槲皮素、姜黃素、雙酚A 和木黃酮等，為后續(xù)靶向治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供新的方向。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，雌二醇與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中免疫反應(yīng)相關(guān)的核心基因結(jié)合穩(wěn)定。有研究表明，雌二醇可抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)TLR4 的表達(dá)，同時(shí)雌二醇可抑制NF-κB 通路的激活，從而抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥起到修復(fù)作用[33]；姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)和FoxO3a 通路有抑制作用并間接抑制解除Wnt 通路，以達(dá)到改善和延遲絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[34]；槲皮素可調(diào)節(jié)NF-κB 受體，并上調(diào)RANKL/RANK/OPG 信號(hào)通路以減少骨的丟失[34]。與研究篩選結(jié)果一致。因此，本研究所篩選的中藥活性成分為后續(xù)臨床靶向抑制免疫反應(yīng)以治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究提供新思路。

本研究篩選出絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中與免疫反應(yīng)相關(guān)的核心基因和信號(hào)通路，篩選出TLR2、TLR4、SMAD3、IL-10、CXCR4、B2M、NOTCH1、IL-17A和CCR5這9 個(gè)核心基因和趨化因子信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路和NF-κB 信號(hào)通路等，這些核心基因與通路可能與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突