葛根素對心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展

賈亞倩，王慧，趙振營，曹月娟*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，天津 301617

2.天津市人民醫(yī)院，天津 300121

急性心肌梗死是臨床上常見心血管系統(tǒng)危急重癥，臨床上主要通過溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療，減少心肌梗死面積，防止病情進(jìn)一步發(fā)展甚至死亡。然而，臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著血運(yùn)重建、心臟的功能和結(jié)構(gòu)并未恢復(fù)，反而進(jìn)一步加重?fù)p傷，這被稱為心肌缺血再灌注損傷[1]。心肌缺血再灌注損傷可導(dǎo)致心律失常、心肌梗死面積擴(kuò)大、心臟功能減退、冠脈微血管功能障礙[2]。因此預(yù)防心肌缺血再灌注損傷是預(yù)防心臟損傷的重要因素。心肌缺血再灌注損傷與多種病理、生理特征相關(guān)，包括鈣超載、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、鐵死亡、線粒體功能障礙、心肌細(xì)胞凋亡和自噬[3]。目前尚無有效的防治心肌缺血再灌注損傷的方法。葛根素是一種從葛根中提取的異黃酮化合物，藥理作用廣泛，在臨床上用于治療多種疾病，包括心腦血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、骨壞死、阿爾茨海默病和子宮內(nèi)膜異位癥等[4]。多項(xiàng)臨床前研究表明，葛根素通過減少梗死面積、改善冠狀動(dòng)脈血流量、改善心肌耗氧量和減少炎癥來預(yù)防心肌缺血再灌注損傷[5]。既往研究表明，葛根素的保護(hù)作用與對氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬、鐵死亡的調(diào)控作用相關(guān)[6]。因此本文總結(jié)了葛根素保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，以期為葛根素臨床治療急性心肌梗死提供參考。

1 抗氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是由氧化劑與抗氧化防御系統(tǒng)之間的失衡引起的。低水平的氧自由基和氧化劑在生理狀態(tài)下存在于細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、存活、有絲分裂、分化和信號傳導(dǎo)等過程。活性氧（ROS）過量產(chǎn)生通常對細(xì)胞有毒性，對細(xì)胞中蛋白質(zhì)、DNA 和脂質(zhì)造成損害。氧化應(yīng)激致心肌缺血再灌注損傷的主要原因是ROS 大量產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷增加，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。在再灌注過程中，隨著血流恢復(fù)，心肌組織被重新氧合，在最初的幾分鐘內(nèi)ROS 大量生成，是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的潛在致病機(jī)制之一[8]。因此減少氧化應(yīng)激是防治心肌缺血再灌注損傷的一種策略，待進(jìn)一步研究。

已有體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明葛根素具有抗氧化應(yīng)激功能[9-10]。有實(shí)驗(yàn)表明，心肌缺血再灌注損傷可導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化劑超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平降低，并破壞抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激[11]。1 項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，葛根素可以減弱缺血再灌注誘導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生，對大鼠原代心肌細(xì)胞中的抗氧化劑SOD 和GSH-Px 有促進(jìn)作用[12]。另一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)也證明，缺氧復(fù)氧模擬心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致SOD 活性以及CAT、GSH-Px 水平降低，用葛根素200 μmol/L 預(yù)處理H9c2 心肌細(xì)胞1 h 后在進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理，可顯著提高細(xì)胞的SOD 活性、CAT 和GSH-Px 水平，提示葛根素對心肌缺血再灌注損傷后抗氧化防御系統(tǒng)的促進(jìn)作用，進(jìn)而降低內(nèi)源性ROS 的生成，顯著減弱心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。此外，有報(bào)道稱mir-21 過表達(dá)可減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[14]。研究也證實(shí)，轉(zhuǎn)染敲低mir-21 的表達(dá)可通過增加ROS 的產(chǎn)生來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而葛根素200 μmol/L 預(yù)處理H9c2 心肌細(xì)胞1 h 后可以逆轉(zhuǎn)效果，表現(xiàn)出來對ROS 的抑制作用[13]。這些實(shí)驗(yàn)表明，葛根素通過抑制氧化應(yīng)激過程對心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡起到保護(hù)作用。葛根素的另一個(gè)保護(hù)機(jī)制可能涉及核因子紅細(xì)胞2 相關(guān)因子2（Nrf2）蛋白。Nrf2 處于氧化應(yīng)激的中心位置，可調(diào)控多種抗氧化酶基因的表達(dá)，這些酶能夠促進(jìn)抗氧化應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)表明，Nrf2 缺乏的小鼠在心肌缺血再灌注損傷期間表現(xiàn)出比其他小鼠更加嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和心肌損傷[15]。1 項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，用葛根素100 mg/kg 喂養(yǎng)大鼠7 d，發(fā)現(xiàn)Nrf2 表達(dá)顯著升高，而ROS 產(chǎn)生大量減少；同一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，用葛根素250 nmol/L 預(yù)處理心肌細(xì)胞3 h 可以逆轉(zhuǎn)缺氧復(fù)氧造成心肌細(xì)胞中Nrf2 表達(dá)水平的下降，從而逆轉(zhuǎn)SOD 活性以及CAT 和GSH-Px 的低水平，以達(dá)到抑制ROS 生成的作用[16]。因此葛根素可通過不同途徑、不同通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

2 抗炎

炎癥反應(yīng)貫穿于心肌缺血再灌注全程，通常與多種發(fā)病機(jī)制相互影響、共同作用。在正常情況下，炎癥是機(jī)體的一種積極防御機(jī)制，但在病理情況下，炎癥的延長或失調(diào)與心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)病密切相關(guān)。心肌細(xì)胞在缺血缺氧的狀態(tài)下，大量釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素（IL）-6 等炎性物質(zhì)，隨著再灌注的產(chǎn)生，炎癥反應(yīng)變得更嚴(yán)重[17]。

有文獻(xiàn)顯示，葛根素已被證明可以抑制炎癥介質(zhì)，包括IL-6、IL-2、誘導(dǎo)型NO 合成酶（iNOS）、核因子-κB（NF-κB）等的表達(dá)[18]。炎癥小體的激活是引發(fā)炎癥的重要機(jī)制，眾所周知，NF-κB 是一種重要的炎癥轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核細(xì)胞中，參與許多細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。有研究報(bào)道，NF-κB 在心血管疾病中不可或缺，并且在缺血的早期發(fā)病機(jī)制中被激活[19]。葛根素可以通過下調(diào)NF-κB 通路激活TNF 信號傳導(dǎo)來抑制炎癥小體成分的轉(zhuǎn)錄，從而對調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)激有至關(guān)重要的作用[20]。1 項(xiàng)動(dòng)物研究表明，用葛根素100 mg/kg 治療后明顯減少了異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞的炎癥損傷，降低了IL-1β、TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平，顯著抑制IL-6 的表達(dá)，并證實(shí)了葛根素通過作用于NFκB 信號通路的機(jī)制抑制促炎因子的產(chǎn)生[21]。

另一信號通路沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）也參與心臟保護(hù)。越來越多的證據(jù)表明，心肌缺血再灌注損傷后組織中SIRT1 表達(dá)降低，而SIRT1 過表達(dá)可減少心肌缺血再灌注損傷[22]。1 項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，葛根素100 mg/kg 喂養(yǎng)小鼠后進(jìn)行心肌缺血再灌注處理，小鼠的心肌梗死面積、血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平和凋亡細(xì)胞顯著降低，且小鼠心臟結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙也得到改善[5]。此外，SIRT1 調(diào)節(jié)許多下游因子，如NF-κB，據(jù)報(bào)道，SIRT1抑制NF-κB 磷酸化，表明SIRT1 具有抗炎作用[22]。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葛根素在心肌缺血再灌注中起保護(hù)作用，此作用是通過調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB 通路減弱了心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，葛根素增加了心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞的活力，并抑制炎癥，在分子水平上這也恰恰與NF-κB 通路的失活有關(guān)。另一項(xiàng)大鼠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，葛根素預(yù)處理減弱了心臟結(jié)構(gòu)惡化和炎癥反應(yīng)[23]。因此葛根素可通過抑制炎癥因子分泌和減少炎癥通路激活來抑制炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)心臟免受缺血再灌注損傷。

3 抑制自噬反應(yīng)

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)保護(hù)機(jī)制，受Bcl-2、Beclin-1、LC3II 等多種蛋白調(diào)控。有研究表明，自噬參與了心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制[24]。自噬是哺乳動(dòng)物細(xì)胞降解大分子和細(xì)胞器的過程，對細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，在各種應(yīng)激條件下，自噬被激活以緩解不良反應(yīng)。研究表明，自噬通過清除蛋白質(zhì)和恢復(fù)細(xì)胞ATP 水平在心肌缺血期間發(fā)揮保護(hù)作用，然而，在再灌注階段，心肌細(xì)胞自噬過度增加又成為一種不良反應(yīng)，導(dǎo)致進(jìn)一步的心肌損傷和細(xì)胞死亡[25]。因此，調(diào)控自噬可能被認(rèn)為是一種緩解心肌缺血再灌注的新方法體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)[26]，在缺氧復(fù)氧前2 h 將葛根素50、100、200 μmol/L 作用于大鼠心肌細(xì)胞，與對照組比，缺氧復(fù)氧組細(xì)胞活力顯著降至（38.4±2.8）%，與缺氧復(fù)氧組比，經(jīng)50、100、200 μmol/L 葛根素預(yù)處理后，細(xì)胞活力顯著提高15.2%～22.5%，其中200 μmol/L 組增幅最大，與50 μmol/L 葛根素預(yù)處理組比，細(xì)胞活力顯著提高。3-MA 是一種經(jīng)典的自噬抑制劑，通過抑制III PI3K 來阻斷自噬體的形成，用200 μmol/L 葛根素預(yù)處理心肌細(xì)胞后，在缺氧復(fù)氧模型中進(jìn)行測試，與缺氧復(fù)氧組相比，3-MA治療顯著提高心肌細(xì)胞活力，這與葛根素預(yù)處理后觀察到的效果相似。這些結(jié)果提示心肌缺血再灌注損傷過程中的自噬可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

葛根素可促進(jìn)心肌缺血再灌注后大鼠原代心肌細(xì)胞Bcl-2 相關(guān)凋亡基因（BAG3）的表達(dá)，BAG3是參與心肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要蛋白，葛根素對BAG3 的表達(dá)有劑量相關(guān)性，200 μmol/L 葛根素預(yù)處理后心肌細(xì)胞中BAG3的表達(dá)比缺氧復(fù)氧組高約2 倍，BAG3 過表達(dá)可刺激心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞的自噬，表現(xiàn)出對心肌缺血再灌注在細(xì)胞活力和凋亡中的保護(hù)作用[27]。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，葛根素預(yù)處理也可以通過Akt 信號通路抑制自噬來減弱心肌缺血再灌注損傷[26]。在缺血再灌注過程中，葛根素還可以下調(diào)蛋白Beclin-1、LC3II 和細(xì)胞色素C 的表達(dá)水平，從而減少過度自噬和細(xì)胞凋亡，還能通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的自噬相關(guān)基因抑制自噬，促進(jìn)心肌細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡，降低乳酸脫氫酶（LDH）、MDA 含量，減輕心肌損傷[24]。

自噬在心肌缺血再灌注中起著重要作用，其作用是雙向的，在心臟病理學(xué)中，自噬過度或不足都可能會(huì)損害心肌。自噬不足會(huì)導(dǎo)致代謝產(chǎn)物積累，過度自噬會(huì)導(dǎo)致自噬細(xì)胞凋亡[24,27]。只有當(dāng)自噬適中時(shí)，才會(huì)對細(xì)胞起到保護(hù)作用，這與中醫(yī)理論中的陰陽自調(diào)不謀而合。近年來研究發(fā)現(xiàn)，葛根素既能抑制自噬改善心肌缺血再灌注損傷，又能通過促進(jìn)自噬保護(hù)心肌細(xì)胞[28]，造成這種差異的原因目前尚不得而知，但葛根素可以通過調(diào)節(jié)自噬減少心肌缺血再灌注損傷，這是毫無疑問的。這為后續(xù)研究指明方向，可以利用適度葛根素調(diào)節(jié)自噬治療心肌缺血再灌注損傷，充分發(fā)揮中藥治療靶點(diǎn)、調(diào)控和不良反應(yīng)小特點(diǎn)，并進(jìn)一步探索自噬調(diào)控缺血再灌注機(jī)制，選擇性抑制或激活自噬減少心肌損傷，將成為一種新的治療方法。

4 抑制鐵死亡

與既往報(bào)道的程序性細(xì)胞死亡形式不同，鐵死亡是一種鐵相關(guān)性細(xì)胞死亡形式，伴有大量鐵積累和脂質(zhì)過氧化[29]。鐵死亡已被證明存在于多種疾病病理過程中，如癌癥[30]、腦部疾病[31]、腎臟疾病[32]和心肌缺血再灌注損傷[33]。對于一些鐵死亡易感腫瘤，鐵死亡的激活可能是一種治療思路[34]。但在心臟組織中，卻需要抑制可能導(dǎo)致心血管疾病的鐵死亡。臨床數(shù)據(jù)表明，鐵是心肌缺血再灌注后左心室重構(gòu)的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素[35-36]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷引發(fā)了心肌細(xì)胞中鐵的積累，這反過來又通過誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生來破壞脂質(zhì)膜，用鐵死亡特異性抑制劑Fer-1 治療可顯著減小心肌梗死面積，并改善心臟功能，這表明在缺血再灌注期間心肌中發(fā)生了鐵死亡[37]。因此，靶向鐵死亡可能是預(yù)防心肌缺血再灌注損傷的潛在策略。

有研究表明，葛根素80 μmol/L 預(yù)處理24 h 可以逆轉(zhuǎn)藥物誘導(dǎo)鐵死亡后心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物、谷胱甘肽過氧化物水平降低，這些都是鐵死亡的發(fā)生條件，并減輕心肌缺血再灌注模型中的組織學(xué)損傷；同樣一項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在心肌缺血再灌注造模前24、2 h 分別予葛根素100 mg/kg 預(yù)處理小鼠，給藥組小鼠的心肌梗死面積小于單純心肌缺血再灌注組，表明葛根素預(yù)處理可減輕心肌損傷，并保留心臟功能[4]。另一項(xiàng)葛根素用于心臟的實(shí)驗(yàn)中，在心肌缺血再灌注損傷模型中評估了葛根素對鐵穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)過氧化的影響，這是鐵死亡的兩個(gè)關(guān)鍵特征。結(jié)果表明，葛根素在體內(nèi)和體外均能緩解鐵過載，減少ROS、脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，促進(jìn)缺血再灌注損傷后谷胱甘肽的合成，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡。葛根素大大減輕了缺血再灌注的不利影響，包括細(xì)胞活力、線粒體完整性的改善以及氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS、脂質(zhì)過氧化的減少[38]。有研究發(fā)現(xiàn)葛根素可以有效消除鐵死亡激活劑的表達(dá)，對缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷起到保護(hù)作用，用葛根素100 mg/kg 處理大鼠1 周后，檢測到給藥組大鼠心肌中鐵死亡激活劑顯著低于模型組，同樣小鼠心肌中鐵含量也明顯降低，此實(shí)驗(yàn)證實(shí)了葛根素通過抑制鐵死亡在心肌損傷中起到關(guān)鍵作用[39]。這些發(fā)現(xiàn)表明葛根素作為以缺血性細(xì)胞損傷為特征的疾病的治療劑的潛力，突出了進(jìn)一步臨床探索的必要性。

5 結(jié)語

葛根素具有廣泛的藥理作用，對心肌損傷后的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬反應(yīng)、鐵死亡都具有一定的調(diào)控作用。葛根素也可通過調(diào)控各種損傷反應(yīng)的上游信號通路、蛋白改善心肌缺血再灌注造成的心肌損傷。也有越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明葛根素在治療心臟缺血再灌注損傷方面具有很大的前景。但是對于葛根素用于心血管疾病也存在一些局限性，上述研究均是針對動(dòng)物和體外實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道葛根素的藥理作用。因此，需要精心設(shè)計(jì)多中心、大樣本、隨機(jī)對照試驗(yàn)來評估葛根素對缺血性心肌病的療效和不良反應(yīng)。另外，葛根素作為具有重要應(yīng)用前景的心血管疾病的潛在治療藥物，應(yīng)進(jìn)一步開展代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，闡明其藥理活性和分子機(jī)制，以待未來開發(fā)出更有效的葛根素制劑，用于預(yù)防和治療心血管疾病，如心肌缺血再灌注損傷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突