黑龍江省松樹(shù)天牛高致病力蟲(chóng)生真菌的篩選與鑒定1)

張瑤 宋小雙 張值榮 刁桂萍 李亞洲 鄧勛

(東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040) (黑龍江省森林保護(hù)研究所) (東北林業(yè)大學(xué)) (黑龍江省森林保護(hù)研究所)

松樹(shù)天牛主要危害松科、杉科植物,主要危害方式是通過(guò)幼蟲(chóng)鉆蛀樹(shù)干、枝條的韌皮部及木質(zhì)部,破壞和切斷輸導(dǎo)組織,影響水分和養(yǎng)分運(yùn)輸,進(jìn)而影響樹(shù)木的生長(zhǎng),嚴(yán)重時(shí)可造成植株死亡[1]。松樹(shù)天牛的部分種類是松材線蟲(chóng)病的傳播媒介[2],松材線蟲(chóng)病的傳播可對(duì)松林資源造成重大危害,因此有效防控天牛危害一直是我國(guó)森林保護(hù)的重要工作和研究重點(diǎn)[3]。

近年來(lái),化學(xué)藥劑的使用對(duì)控制天牛等害蟲(chóng)的種群密度具有良好的效果,趙鵬等[4]通過(guò)打孔注入吡蟲(chóng)啉或啶蟲(chóng)脒等內(nèi)吸性較好的化學(xué)藥劑對(duì)天牛進(jìn)行防控;馬海麗等[5]通過(guò)“樹(shù)干注藥+樹(shù)冠噴藥”的有機(jī)結(jié)合來(lái)防治黃斑星天牛;徐云等[6]使用“辛硫磷+克百威+橙皮桔油”直接噴干,防治光肩星天牛幼蟲(chóng)。目前,由于缺乏對(duì)化學(xué)藥劑的有效安全管理策略,使用化學(xué)農(nóng)藥的負(fù)面影響會(huì)持續(xù)存在于土壤、濕地、地下水、非目標(biāo)植物、脊椎動(dòng)物的環(huán)境中[7],因此,利用生物防治害蟲(chóng)越來(lái)越受歡迎。蟲(chóng)生真菌具有寄主廣、防治害蟲(chóng)不產(chǎn)生抗藥性、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[8],將其加工制作成真菌殺蟲(chóng)劑,可作為有毒化學(xué)殺蟲(chóng)劑的安全替代品[9]。

蟲(chóng)生真菌廣泛分布于自然界中,能寄生于多種昆蟲(chóng),且致病能力強(qiáng)、改良潛力大、對(duì)非靶標(biāo)生物毒性低,是一種具有巨大開(kāi)發(fā)潛力的環(huán)境友好型殺蟲(chóng)劑[10]。目前,已作為殺蟲(chóng)菌劑應(yīng)用的昆蟲(chóng)病原真菌菌種包括球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、羅伯茨綠僵菌(Metarhiziumrobertsii)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinum)、蠟蚧輪枝菌(Lecanicilliumlecanii)等。本研究從黑龍江省哈爾濱市、牡丹江市林區(qū)收集67份土樣,使用黃粉蟲(chóng)誘集和稀釋涂布平板法分離純化出蟲(chóng)生真菌,通過(guò)逐步測(cè)定菌株對(duì)松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)的致病力篩選出高致病菌株,并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析確定菌株分類地位,初步探究昆蟲(chóng)病原真菌防治松樹(shù)天牛的潛力。

1 材料與方法

供試菌株:土壤樣品于2021年8月份采自黑龍江省哈爾濱市、牡丹江市林區(qū),使用黃粉蟲(chóng)誘集和稀釋涂布平板法分離純化獲得純菌株。將純菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基的試管斜面上,26 ℃恒溫培養(yǎng)10 d后,放入冰箱內(nèi)4 ℃保存。供試菌株詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 供試菌株的基本情況

供試蟲(chóng)源:松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)于2022年4月份收集于野外的紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)蟲(chóng)害木,通過(guò)木段解剖獲取灰長(zhǎng)角天牛幼蟲(chóng)共328只,實(shí)驗(yàn)時(shí)挑選活力好、蟲(chóng)齡一致的幼蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。松樹(shù)天牛成蟲(chóng)于2022年5月份收集于野外的紅松蟲(chóng)害木,將蟲(chóng)害木置于養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi),待松樹(shù)天牛成蟲(chóng)羽化后放入打孔塑料盒內(nèi),用新鮮松樹(shù)枝條飼養(yǎng),共獲得灰長(zhǎng)角天牛成蟲(chóng)372只,實(shí)驗(yàn)時(shí)挑選活力好且羽化日齡差異小的成蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

不同濃度孢子懸液的制備方法:用體積分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫-80溶液洗脫平板上的孢子,并轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的50 mL離心管中,然后用漩渦振蕩器振蕩,使孢子充分分散,用三層無(wú)菌紗布過(guò)濾,稀釋后在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),計(jì)算母液的濃度,將母液稀釋成孢子濃度為107個(gè)·mL-1的孢子懸液備用。取1 mL孢子濃度為107個(gè)·mL-1的孢子懸液,加入到9 mL體積分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫-80溶液中,將其稀釋成孢子濃度為106個(gè)·mL-1的孢子懸液,再次稀釋獲得孢子濃度為105個(gè)·mL-1的孢子懸液。

蟲(chóng)生真菌菌株的篩選方法:將菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上,放入培養(yǎng)箱內(nèi)26 ℃培養(yǎng)10 d。使用爬行法[11]接種,將5只松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)放進(jìn)培養(yǎng)好菌株的平板內(nèi)活動(dòng)1 h,對(duì)照組放入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)1 h,然后將試蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到打孔且裝有濕潤(rùn)木屑的10 mL無(wú)菌離心管內(nèi),每只松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)使用1個(gè)離心管,室溫培養(yǎng),每天觀察試蟲(chóng)狀態(tài)至6 d,試蟲(chóng)死亡后繼續(xù)保濕培養(yǎng),觀察體表是否有菌絲長(zhǎng)出,以確定是否被菌株感染致死。

將菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上,放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)26 ℃培養(yǎng)10 d。使用爬行法接種,將3只松樹(shù)天牛成蟲(chóng)放進(jìn)培養(yǎng)好菌株的平板內(nèi)活動(dòng)1 h,對(duì)照組放入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)1 h,然后將試蟲(chóng)放入底部墊有3張濕潤(rùn)濾紙的組培瓶?jī)?nèi),每2 d供應(yīng)1根新鮮的松樹(shù)枝條和補(bǔ)充0.5 mL無(wú)菌水作為食物和水源。每天觀察記錄試蟲(chóng)狀態(tài)至6 d,試蟲(chóng)死亡后繼續(xù)保濕培養(yǎng),觀察體表是否有菌絲長(zhǎng)出,以確定是否被菌株感染致死。

不同菌株生長(zhǎng)速度與產(chǎn)孢量的測(cè)定方法:用移液槍吸取20 μL孢子濃度為107個(gè)·mL-1的孢子懸液,滴至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中央,放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)26 ℃培養(yǎng),在5、10、15 d時(shí),采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。培養(yǎng)至15 d時(shí),用體積分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫-80溶液將平板上所有孢子沖洗下來(lái)制成孢子懸液,使用漩渦振蕩器振蕩,使孢子充分分散后,在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子懸液濃度,然后計(jì)算產(chǎn)孢量,實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

不同濃度孢子懸液對(duì)松樹(shù)天牛室內(nèi)致病力的測(cè)定方法:利用M14-1、H2菌株,制備孢子濃度為107、106、105個(gè)·mL-1的孢子懸浮液,以體積分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫-80溶液為空白對(duì)照。采用浸液法[12],將松樹(shù)天牛成蟲(chóng)放入孢子懸液中浸泡5 s后取出,用濾紙吸干多余水分,放到底部墊有1張濕潤(rùn)濾紙的組培瓶中,每2 d供應(yīng)1根新鮮的松樹(shù)枝條和補(bǔ)充0.5 mL無(wú)菌水。每2 d觀察記錄試蟲(chóng)的狀態(tài),試蟲(chóng)死亡后繼續(xù)補(bǔ)充無(wú)菌水保濕,且每天移至體視顯微鏡下觀察試蟲(chóng)體表菌絲生長(zhǎng)情況,并記錄試蟲(chóng)形態(tài)特征。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理,每處理重復(fù)3次。

菌株M14-1、H2種類的鑒定方法:將分離得到的菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng),5 d時(shí)挑取菌絲于載玻片上,在顯微鏡下觀察并記錄菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)。培養(yǎng)至14 d時(shí)觀察并記錄菌落形態(tài)特征。然后用DNA提取試劑盒提取DNA,采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。引物:ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)或ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’);反應(yīng)體系(40 μL):2×20 μL的Taq Master Mix、2 μL的引物ITS1、2 μL的引物ITS4、2 μL的DNA模板、14 μL的ddH2O;PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次,72 ℃延伸5 min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),合格后送往睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

數(shù)據(jù)處理:利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;利用DPS軟件擬合毒力回歸方程與計(jì)算半致死時(shí)間(LT50);并采用MEGA7.0軟件構(gòu)建發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)松樹(shù)天牛具有高毒力的蟲(chóng)生真菌菌株篩選

表2為菌株對(duì)松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)致病的累計(jì)死亡率和感染率。在松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)被接種4 d時(shí),有16株菌接種的松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)出現(xiàn)僵蟲(chóng)。在接種6 d時(shí),18株菌接種的松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)都出現(xiàn)了僵蟲(chóng),表明這18株菌對(duì)松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)都具有致病力,其中菌株M8-2、M33-2、T11接種的松樹(shù)天牛幼蟲(chóng),在4、6 d累計(jì)死亡率分別達(dá)到了60%、100%,該菌株對(duì)松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)的致病力高于其他菌株;M14-1、H2、M3、M5等多種菌株在6 d時(shí),累計(jì)死亡率均高達(dá)100%,感染率均達(dá)到80%及以上,對(duì)松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)致病力效果較好;菌株M25-3、M10的感染率未達(dá)到80%,通過(guò)觀察,發(fā)現(xiàn)未被菌株感染的僵蟲(chóng)蟲(chóng)體變黑且流出濃液,其是受培養(yǎng)條件影響致死。

表2 菌株對(duì)松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)致病的累計(jì)死亡率和感染率

松樹(shù)天牛成蟲(chóng)被接種3 d,有9株菌接種的松樹(shù)天牛成蟲(chóng)出現(xiàn)僵蟲(chóng)。在被接種的6 d,18株菌接種的松樹(shù)天牛成蟲(chóng)出現(xiàn)了僵蟲(chóng),表明這18株菌對(duì)松樹(shù)天牛成蟲(chóng)都具有致病力。其中菌株M14-1、M33-2、H2、Z1對(duì)松樹(shù)天牛成蟲(chóng)致病力均高于其他菌株,被接種的松樹(shù)天牛成蟲(chóng)在3、6 d累計(jì)死亡率分別達(dá)到66%、100%,且感染率均達(dá)到100%。菌株M10、M19-2、H1、T6-1對(duì)松樹(shù)天牛成蟲(chóng)致病力效果次之,被接種的松樹(shù)天牛成蟲(chóng)在3、6 d累計(jì)死亡率分別為33%、100%,感染率均達(dá)到100%(表2)。

松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)被菌株感染死亡后,試蟲(chóng)體表黃色變深,身體略微皺縮,接著試蟲(chóng)體表逐漸出現(xiàn)菌絲,且菌絲極易沾上木屑而影響觀察;松樹(shù)天牛成蟲(chóng)被感染后,試蟲(chóng)體表觸角、足、基節(jié)、口器變得脆弱,且很快長(zhǎng)出菌絲,隨后菌絲逐漸長(zhǎng)滿全身。松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)被同一菌株感染后,菌絲、孢子堆的顏色、形態(tài)等基本特征變化不大(圖1)。

圖1 松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)被感染后的特征

2.2 不同菌株的生長(zhǎng)速度與產(chǎn)孢量測(cè)定

表3為不同菌株菌落在5、10、15 d的直徑及產(chǎn)孢量。其中菌株M14-1的菌落在三個(gè)時(shí)期的直徑均顯著大于其他菌株,在5、10、15 d時(shí),其直徑分別為2.50、4.13、5.68 cm;菌株H2的直徑在5、10 d相比其他菌株沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì),但在15 d時(shí)菌株直徑僅次于M14-1。菌株M14-1、H2培養(yǎng)到15 d時(shí)的產(chǎn)孢量顯著高于其他菌株,其中菌株M14-1的產(chǎn)孢量為3.86×108個(gè)·板-1,菌株H2產(chǎn)孢量為4.10×108個(gè)·板-1。

表3 菌落的直徑與產(chǎn)孢量

總體上,菌株M14-1、H2對(duì)松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的致死率較高、致死時(shí)間短,且生長(zhǎng)速度快,產(chǎn)孢量大,可作為優(yōu)良菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 菌株M14-1、H2不同濃度孢子懸液對(duì)松樹(shù)天牛室內(nèi)致病力的測(cè)定

表4為菌株M14-1、H2對(duì)松樹(shù)天牛成蟲(chóng)致病的死亡率和半致死時(shí)間。隨著孢子懸液濃度的降低,菌株對(duì)松樹(shù)天牛成蟲(chóng)的半致死時(shí)間逐漸增加,死亡率逐漸降低。在孢子濃度為107個(gè)·mL-1時(shí),兩株菌的致死率均為100%,M14-1的半致死時(shí)間為4.15 d,H2的半致死時(shí)間為4.31 d。而在孢子濃度為106、105個(gè)·mL-1時(shí),松樹(shù)天牛成蟲(chóng)死亡率皆未達(dá)到100%。

表4 兩株菌對(duì)松樹(shù)天牛成蟲(chóng)致病的死亡率和半致死時(shí)間

在接種5 d時(shí),試蟲(chóng)開(kāi)始大量死亡,將試蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到體視顯微鏡下觀察,可在觸角、跗節(jié)、口器上觀察到少量菌絲,繼續(xù)保濕培養(yǎng)。死亡2 d時(shí),試蟲(chóng)體表可見(jiàn)大量白色菌絲,主要分布在基節(jié)窩、口器以及前胸與中胸之間,菌絲表面已產(chǎn)生少量墨綠色的分生孢子堆;死亡4 d時(shí),試蟲(chóng)體表已布滿墨綠色的分生孢子堆,此時(shí)試蟲(chóng)觸角和足十分脆弱,很容易斷裂;死亡6 d時(shí),試蟲(chóng)體表的分生孢子堆更加密集,觸角和足變得柔軟脆弱(圖2)。

A、B為菌株M14-1;C、D為菌株H2。圖2 松樹(shù)天牛成蟲(chóng)感染背面和腹面形態(tài)

表5為菌株M14-1、H2不同濃度孢子處理松樹(shù)天牛后不同時(shí)期的累計(jì)死亡率,可知孢子懸液濃度越高,累計(jì)死亡率就越高,當(dāng)處理時(shí)間為2 d時(shí),在濃度為106、107個(gè)·mL-1時(shí)已有成蟲(chóng)死亡。當(dāng)處理時(shí)間為8 d時(shí),兩株菌在106、105孢子·mL-1濃度處理的天牛累計(jì)死亡率均未到達(dá)100%,表明仍有少數(shù)天牛成蟲(chóng)未感染致死。

表5 菌株M14-1和H2不同濃度孢子處理后的天牛累計(jì)校正死亡率

2.4 菌株M14-1和H2的種類鑒定

圖3為菌株M14-1、H2培養(yǎng)14 d的菌落形態(tài)。菌株M14-1的菌體為圓形,直徑約6.10 cm,整體形態(tài)為灰色絨毛狀,部分呈現(xiàn)為黃色、白色,邊緣有一圈輪環(huán),中間突起,菌株H2的菌體為不規(guī)則圓形,直徑約6.91 cm,整體形態(tài)為白色絮狀,中部菌絲老化,呈現(xiàn)為淺綜色,邊緣菌絲表面有一層黑綠色分生孢子堆。兩菌株的分生孢子單個(gè)存在時(shí)均為無(wú)色透明、長(zhǎng)圓柱形,聚集時(shí)為黑綠色,菌株H2的分生孢子顏色略深于菌株M14-1,形態(tài)微長(zhǎng)于菌株M14-1,菌絲均光滑透明,且分枝分隔,培養(yǎng)基質(zhì)色澤為淡褐色。

圖3 菌株M14-1、H2的形態(tài)特征

以ITS1/ITS4為引物,對(duì)菌株M14-1、H2的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度分別為522、526 bp。使用該序列在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行局部序列排比檢索基本工具(BLAST)比對(duì),并下載相似性高的序列,使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。菌株M14-1與MetarhiziumanisopliaeSC44A03 (MW113483)聚為一支,同源性為99.00%,菌株H2與MetarhiziumanisopliaeBL23 (MW832543)聚為一支,同源性高達(dá)99.22%,根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析可知,菌株M14-1和H2均屬于金龜子綠僵菌(Mertarhiziumanisopliae)。

圖4 利用rDNA-ITS序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論與結(jié)論

蟲(chóng)生真菌是一種能夠主動(dòng)侵染害蟲(chóng),并在害蟲(chóng)體內(nèi)大量繁殖使其快速病死或衰弱的生防菌[13]。由于蟲(chóng)生真菌的真菌殺蟲(chóng)劑具有防控有效期長(zhǎng)、寄主范圍廣、對(duì)非靶標(biāo)生物無(wú)害等優(yōu)點(diǎn),因此真菌殺蟲(chóng)劑被廣泛應(yīng)用到農(nóng)林害蟲(chóng)的防治上[14]。松樹(shù)天牛在黑龍江省分布廣泛且國(guó)內(nèi)針對(duì)松樹(shù)天牛的實(shí)際防治策略研究較少。致病力是衡量?jī)?yōu)良菌株的重要指標(biāo),測(cè)定不同菌株對(duì)害蟲(chóng)的致病力可以篩選出高致病力菌株,菌株的生長(zhǎng)特性也是重要的考察指標(biāo)之一[15]。為了開(kāi)發(fā)針對(duì)松樹(shù)天牛綠色防控方法,本研究將從黑龍江省哈爾濱市、牡丹江市林區(qū)土壤樣品分離純化的18株蟲(chóng)生真菌進(jìn)行篩選。篩選獲得的菌株M14-1、H2菌落生長(zhǎng)速度快,產(chǎn)孢量大,對(duì)松樹(shù)天牛成蟲(chóng)的致病力均高于其他菌株,在接種的3、6 d累計(jì)死亡率均分別達(dá)到66%、100%,菌株M14-1、H2對(duì)松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)致病力高于其他菌株,在接種的6 d累計(jì)死亡率均達(dá)到100%,綜合考慮其應(yīng)用于生物防治的潛力較高。通過(guò)觀察形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,鑒定2株菌株均為金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)。

金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae),作為應(yīng)用廣泛的一種昆蟲(chóng)病原真菌,在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前,綠僵菌的生產(chǎn)、應(yīng)用和安全性已被許多國(guó)家做了大量細(xì)致的研究,能夠被金龜子綠僵菌寄生的昆蟲(chóng)約有200余種,有些害蟲(chóng)已開(kāi)發(fā)出綠僵菌殺蟲(chóng)劑,且具有良好防治效果[16]。劉建波[17]對(duì)星天牛成蟲(chóng)采用爬行法測(cè)定了4株金龜子綠僵菌和1株球孢白僵菌的致病力,金龜子綠僵菌MaYTTR-04在15 d內(nèi)的致死率為100%,半致死時(shí)間為9.36 d,僵蟲(chóng)率為40.0%;趙建偉[18]采用浸漬法測(cè)定了8株綠僵菌對(duì)草地貪夜蛾2年齡幼蟲(chóng)的致病力,在孢子濃度為5×107個(gè)·mL-1時(shí),致死率分別為88.76%、82.13%,半致死時(shí)間分別為4.81、4.93 d,獲得2株高致病力萊氏綠僵菌;何學(xué)友[19]采用浸漬法測(cè)定了7株金龜子綠僵菌對(duì)油茶象幼蟲(chóng)的致病力,結(jié)果表明,菌株FJMa201101的半致死時(shí)間為1.65 d,感染率為86.60%,FJMa201205的半致死時(shí)間為1.71 d,感染率為91.10%。本試驗(yàn)篩選獲得的2株菌M14-1、H2在孢子濃度為107個(gè)·mL-1時(shí),用浸液法接種松樹(shù)天牛成蟲(chóng)的半致死時(shí)間分別為4.15、4.31 d,其致病性要高于其他供試菌株;劉玉軍[20]在篩選高致病力白僵菌時(shí),發(fā)現(xiàn)菌株的平均生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率均與致病力相關(guān);蔡守平[21]篩選高致病力白僵菌和綠僵菌時(shí),發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)孢量與致病力也具有相關(guān)性。而本試驗(yàn)中M14-1、H2的菌落生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量均顯著高于其他菌株,表明其應(yīng)用于生物防治的潛力較高。

本研究雖然通過(guò)松樹(shù)天牛幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)進(jìn)行毒力測(cè)定篩選獲得了2株高致病力金龜子綠僵菌,但其培養(yǎng)方法、生物特性、林間實(shí)際害蟲(chóng)防治效果等尚未明確,今后可繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究,為利用金龜子綠僵菌防治松樹(shù)天牛提供更多支持。