熱休克蛋白在肌萎縮側(cè)索硬化癥中作用的研究進(jìn)展

羅茂濤 張倩倩 趙慧慧 程曦 牛琦

【摘要】肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）目前仍面臨發(fā)病機(jī)制不明及無有效治療措施的困境，研究發(fā)現(xiàn)ALS中存在顯著的蛋白穩(wěn)態(tài)失調(diào)，包括蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和異常蛋白聚集體的形成，對(duì)ALS的起病及發(fā)展具有重要作用。其中，作為分子伴侶家族的熱休克蛋白（HSP）因具有維持蛋白穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)異常蛋白聚集體降解的作用而受到了越來越多的關(guān)注。

【關(guān)鍵詞】肌萎縮側(cè)索硬化癥；蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)；熱休克蛋白；熱休克反應(yīng)；治療

【中圖分類號(hào)】R651【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】16727770（2024）02022004

Progress on role of heat shock proteins in amyotrophic lateral sclerosis LUO Maotao， ZHANG Qianqian， ZHAO Huihui， et al. Department of Geriatric Neurology， The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210024， China

Corresponding author： NIU Qi

Abstract： At present， the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis（ALS） is still unclear and there is no effective treatment. Studies have found that there are significant protein homeostasis disorders in ALS， including protein misfolding and the formation of abnormal protein aggregates， which play an important role in the occurrence and development of ALS. As a family of molecular chaperones， heat shock proteins（HSPs） have received increasing attention due to their roles in maintaining protein homeostasis and promoting the degradation of abnormal protein aggregates.

Key words： amyotrophic lateral sclerosis； protein homeostasis； heat shock protein； heat shock response； treatment

肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種以上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失和肌肉萎縮為特征的進(jìn)行性致死性神經(jīng)退行性疾病。迄今為止，已超過40多個(gè)基因被報(bào)道與ALS相關(guān)，如SOD1、 TDP43、C9ORF72等［12］。目前ALS發(fā)病機(jī)制仍不明確，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的異常沉積及蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)與ALS發(fā)病密切相關(guān)［3］，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持正常的細(xì)胞代謝及細(xì)胞對(duì)刺激的應(yīng)答做出動(dòng)態(tài)反應(yīng)至關(guān)重要。其中，熱休克蛋白作為調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要分子之一，在誘導(dǎo)錯(cuò)誤折疊蛋白重新折疊、促進(jìn)其降解等方面的重要作用受到越來越多的關(guān)注。

1蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)

組織及細(xì)胞功能的最佳狀態(tài)需要良好的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)（protein homeostasis），而穩(wěn)態(tài)的平衡依賴于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制（protein quality control，PQC）系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，主要包括分子伴侶和降解系統(tǒng)。其中，分子伴侶是蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持最主要的參與者，能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)過程［4］。

1.1熱休克蛋白熱休克蛋白（heat Shock protein，HSP）是最重要的一類伴侶蛋白，根據(jù)其大小、結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行分組［5］，目前主要分為HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSPs等HSP家族。HSP是抵抗蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊及聚集的第一道防線。作為一類重要的分子伴侶，HSP不僅發(fā)揮伴侶活性，通過與新生蛋白質(zhì)相互作用，幫助穩(wěn)定蛋白質(zhì)并正確折疊成有效的構(gòu)象；同時(shí)，HSP能啟動(dòng)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)重新折疊或結(jié)合在這些蛋白質(zhì)所暴露的黏性疏水區(qū)域，以阻斷它們互相作用和聚集［4］。此外，HSP還參與了自噬及蛋白酶體系統(tǒng)等降解過程［6］，清除已經(jīng)形成的蛋白質(zhì)聚集體。因此，HSP的抗蛋白質(zhì)聚集作用在蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持中起了相當(dāng)關(guān)鍵的作用。

1.2熱休克反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)存在一種非常重要的內(nèi)源性應(yīng)激保護(hù)機(jī)制，即熱休克反應(yīng)（heat shock response，HSR），受熱休克因子1（heat shock factor1，HSF1）的調(diào)控。熱應(yīng)激、蛋白質(zhì)毒性等能誘導(dǎo)HSR發(fā)生，激活HSF1，脫離與之結(jié)合的HSP90，形成三聚體HSF1。HSF1的靶基因啟動(dòng)子區(qū)域有一段非常保守的DNA序列，稱為熱休克元件（heat shock element，HSE），三聚體HSF1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核并與HSE結(jié)合，促進(jìn)多種HSP基因表達(dá)上調(diào)，協(xié)同發(fā)揮作用，共同維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)［7］。

2ALS的HSP失調(diào)

HSP存在于神經(jīng)元的多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，參與了蛋白質(zhì)的合成、正確折疊、降解、解聚等過程，維護(hù)神經(jīng)元內(nèi)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。然而既往不少研究觀察到了ALS模型HSP的變化，如在SOD1G93A小鼠的脊髓組織勻漿中， HSP105水平出現(xiàn)降低［8］。最近，一項(xiàng)死后散發(fā)型ALS尸檢研究中，也發(fā)現(xiàn)了HSPA8、HSP40/70等HSP表達(dá)下降［9］。這些變化說明了HSP的改變與ALS的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。HSP的失調(diào)可能通過影響蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因?yàn)樵贏LS患者或模型發(fā)現(xiàn)了多種蛋白質(zhì)聚集體（aggregates），如mSOD1（superoxide dismutase 1）蛋白聚集體，幾乎存在于所有散發(fā)型ALS中的泛素及TDP43（TAR DNA binding protein 43）陽性包涵體［10］，多聚二肽重復(fù)蛋白（dipeptide repeat proteins，DPRs）［11］等，這是蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡的特征表現(xiàn)之一。

2.1HSP功能失調(diào)聚集體的存在通常被認(rèn)為對(duì)神經(jīng)元有毒性作用，核內(nèi)聚集體可以干擾DNA轉(zhuǎn)錄或RNA加工過程。胞質(zhì)內(nèi)聚集體可以影響細(xì)胞膜的完整性、損傷線粒體功能、損害自噬作用等［10］。然而，有觀點(diǎn)認(rèn)為，這些聚集體可能是PQC在處理蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊時(shí)的副產(chǎn)物，或者它們可能代表細(xì)胞的一種保護(hù)方式，即隔離和存儲(chǔ)這些有毒蛋白質(zhì)。但聚集體的存在說明，HSP可能無法阻止錯(cuò)誤折疊蛋白聚集。一方面突變蛋白與HSP的作用模式發(fā)生改變，使得突變蛋白更易聚集；Ryu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，錯(cuò)誤折疊蛋白的表達(dá)能引起HSP70/Hsc70與底物或共伴侶結(jié)合模式的動(dòng)態(tài)改變，而這種改變可能與疾病的發(fā)生發(fā)展及早期病理有關(guān)；研究表明SODIA4V的突變能促進(jìn)mSODI蛋白聚集傾向區(qū)域的暴露，但并不能促進(jìn)HSP70識(shí)別基序的暴露，因此易形成mSOD1聚集體［13］。另一方面已形成的聚集體能“隔離”HSP的保護(hù)作用，有研究顯示在一些突變SODI（mSODI）轉(zhuǎn)基因小鼠模型和患者死后組織中，發(fā)現(xiàn)了聚集體與HSP共存現(xiàn)象［14］；近期的一項(xiàng)研究也顯示，HSP能與SOD1的聚集核心發(fā)生相互作用［15］。HSP與聚集體的相互作用（共存）表明了HSP被轉(zhuǎn)移到聚集體中，因此無法執(zhí)行正常的“管家（housekeeping）”功能。此外，一些研究發(fā)現(xiàn)HSP的突變可能與ALS的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，Simona等［16］在273例意大利非親緣ALS患者的隊(duì)列研究中，發(fā)現(xiàn)了兩種HSPB1基因突變，對(duì)變異之一（p.Ala204Glyfs*6）進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)突變蛋白改變了HSPB1的動(dòng)態(tài)平衡，與野生型蛋白形成一個(gè)穩(wěn)定的二聚體，最終導(dǎo)致伴侶活性的喪失。最近，一項(xiàng)研究對(duì)166例中國(guó)ALS患者進(jìn)行二代測(cè)序，篩選出3個(gè)HSPB1基因可能的致病性罕見錯(cuò)義突變［17］。

2.2HSR失調(diào)包括HSP70、HSP40、HSP90在內(nèi)的一些HSP沒有被上調(diào)， 這是許多mSOD1小鼠模型的特征之一［8］。其中，很重要的原因之一是HSR沒有被有效誘導(dǎo)。目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到HSR在神經(jīng)元中具有更高的誘導(dǎo)閾值。體外實(shí)驗(yàn)表明，大鼠腦切片受熱應(yīng)激（41～42 ℃，15～60 min）后，少突膠質(zhì)細(xì)胞的HSP70及星形膠質(zhì)細(xì)胞的HSP27表達(dá)增加，而神經(jīng)元中未見HSP70或HSP27的表達(dá)增加［18］；一項(xiàng)對(duì)死后散發(fā)型ALS尸檢的研究表明，HSR在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中失調(diào)，HSF1的靶基因表達(dá)下降［9］。目前研究認(rèn)為，HSR失調(diào)可能的原因是HSF1無法被有效激活，而并非表達(dá)不足［9］。近期的一項(xiàng)研究也顯示，在神經(jīng)元中，ALS的致病蛋白，如mSOD1，是一種HSR的弱誘導(dǎo)劑［19］。不過另一項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)，DPRs能有效激活HSR［20］?？傊窠?jīng)元內(nèi)HSR與聚集體的關(guān)系及內(nèi)源性HSF1無法被激活的原因仍有待進(jìn)一步的研究。

3HSP的抗ALS蛋白質(zhì)聚集作用

大量研究已證實(shí)HSP能阻止ALS相關(guān)蛋白的聚集，維護(hù)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用［2122］。目前HSP的抗蛋白質(zhì)聚集作用可以歸因于兩點(diǎn)：（1）HSP減輕觸發(fā)致病性聚集的早期異常蛋白相互作用，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HSP可以有效地延長(zhǎng)聚集開始前的滯后期［23］，如果蛋白質(zhì)聚集已經(jīng)啟動(dòng)，則可延長(zhǎng)聚集體的初級(jí)及次級(jí)成核，這些作用主要是通過結(jié)合聚集蛋白質(zhì)所暴露的疏水殘基來發(fā)揮作用；（2）HSP參與聚集體轉(zhuǎn)運(yùn)至降解系統(tǒng)進(jìn)行降解［6］。

3.1小HSP的作用除了HSP70外，小HSP家族在抗蛋白質(zhì)聚集作用也受到了越來越多的重視。既往研究顯示，HSPB5（HSP27）和HSPB1（αBcrystallin）的過表達(dá)能夠抑制SOD1聚集［24］，而更多的研究主要集中在HSPB8（HSP22）的抗蛋白聚集作用上。HSPB8是小HSP家族成員之一，主要通過分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone mediated autophagy，CMA）途徑參與蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持。HSPB8能形成二聚體與HSP70及支架蛋白BAG3（BCL2associated athanogene）和E3連接酶CHIP結(jié)合，最終組成HSPB8+ HSP70+CHIP+ BAG3復(fù)合體，在微管組織中心形成自噬小體，吞噬并降解錯(cuò)誤折疊蛋白。當(dāng)CMA不足或受損時(shí)，HSP70和CHIP與輔助伴侶BAG1結(jié)合，形成HSPB8+HSP70+CHIP+BAG1復(fù)合體后將錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)靶向運(yùn)送至蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解［25］。研究發(fā)現(xiàn)在疾病發(fā)病期間和疾病末期，HSPB8在轉(zhuǎn)基因ALS小鼠模型和患者的脊髓標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)［26］，在病程短的患者側(cè)束星形膠質(zhì)細(xì)胞中也存在類似情況［27］，這種表達(dá)上調(diào)可能代表了細(xì)胞對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白誘導(dǎo)的損傷反應(yīng)，并增強(qiáng)這些存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白毒性應(yīng)激的耐受性。HSPB8通過CMA途徑，降解毒性蛋白，因此其表達(dá)水平的上調(diào)有助于從多種致病蛋白（mSOD1、TDP35/TDP25、DPRs）的ALS神經(jīng)元模型中去除聚集的錯(cuò)誤折疊蛋白［2122］。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的 HSP8可以保護(hù)腦內(nèi)突觸可塑性和認(rèn)知功能，該研究認(rèn)為過表達(dá)的 HSP8可能通過調(diào)節(jié)經(jīng)典功能通路和上游調(diào)控因子來促進(jìn)突觸可塑性［7］。

3.2HSR的作用HSF1能介導(dǎo)HSR，而神經(jīng)元中的HSR具有更高的激活閾值，其中原因之一是HSF1不能被有效激活。因此，HSF1的激活及隨后的多種HSP表達(dá)上調(diào)能促使錯(cuò)誤折疊重新折疊、解聚或通過自噬或泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitinproteasome system，UPS）被清除，阻止毒性聚集體的形成及隨后的神經(jīng)損傷。既往研究表明，活性HSF1過表達(dá)能增強(qiáng)mSOD1H46R/H48Q小鼠的HSR，表現(xiàn)為小鼠脊髓提取物中可溶性的HSP70及不溶片段中HSP70及HSPB5的增加，并顯著抑制小鼠體質(zhì)量減輕，延遲ALS疾病的發(fā)病，該研究認(rèn)為HSF1的過表達(dá)可能改變了SOD1的溶解性，改善了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)［28］。Wang等［29］的研究顯示，HSF1能抑制TDP43乙?；M物所致的病理過程，該研究認(rèn)為通過誘導(dǎo)HSP27/40的表達(dá)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行重新折疊或降解來減少TDP43聚集體，而內(nèi)源性HSF1的激活足以發(fā)揮這種作用。由此可見，HSF1的激活能使HSR增強(qiáng)以及多種相互作用的關(guān)鍵HSP表達(dá)上調(diào)，比單一過表達(dá)某種HSP的抗聚集作用更強(qiáng)。最近一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)，相比于正常衰老的小鼠，長(zhǎng)壽的小鼠可能保存和加強(qiáng)了大腦中HSF1的激活［30］，印證了HSF1激活的神經(jīng)保護(hù)作用。

4治療

聚集體的毒性作用很可能是導(dǎo)致ALS中神經(jīng)變性的重要分子機(jī)制之一。而HSP在蛋白平衡網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)應(yīng)激下被上調(diào)，因此是受調(diào)控的。

目前一些研究涉及了對(duì)單個(gè)基因調(diào)節(jié)的治療作用。如調(diào)節(jié)HSPB8基因表達(dá)的藥物：秋水仙素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑等。其中秋水仙素以HSPB8依賴的方式增強(qiáng)不溶性TDP43聚集物的清除，目前正在對(duì)一大批ALS患者進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)［31］。

與單獨(dú)上調(diào)HSP相比，作用于HSF1并上調(diào)HSR從而增加一系列應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)似乎更有能力減輕蛋白質(zhì)聚集負(fù)荷，防止神經(jīng)退化，延長(zhǎng)ALS模型小鼠的壽命。目前已研究的藥物有兩類：一類治療藥物能激活HSF1和/或上調(diào)HSR下游產(chǎn)物。這些藥物包括醉茄素A、阿莫洛莫（arimoclomol）等，能上調(diào)HSR促使存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量增加，并延長(zhǎng)mSOD1表達(dá)小鼠的壽命［14］。另一類治療藥物是針對(duì)HSF1抑制復(fù)合物，如17AAG，可上調(diào)HSP70表達(dá)，減少HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)易聚集的TDP43 C末端片段的病理性聚集體的數(shù)量［32］。

羥胺衍生物阿莫洛莫是一種HSR共誘導(dǎo)劑，能穩(wěn)定處于活化狀態(tài)的HSF1，延長(zhǎng)HSF1與HSE的結(jié)合時(shí)間，并上調(diào)一些HSP家族的表達(dá)［33］。在ALS的SOD1G93A小鼠模型中，阿莫洛莫已被證明可以延緩疾病進(jìn)展，延長(zhǎng)壽命，增加肌肉功能，并防止突變SOD1的聚集［34］。此外，最近一項(xiàng)研究表明，阿莫洛莫能增強(qiáng)HSR并改善mVCP小鼠脊髓和腦中ALS/FTD樣病理特征，并防止神經(jīng)元丟失［35］。雖然阿莫洛莫第二階段200 mg每日3次劑量的安全性和耐受性試驗(yàn)獲得成功［36］，但在一大群散發(fā)ALS 參與者中進(jìn)行的3期研究未顯示任何益處。因此，為了確定阿莫洛莫的作用是否可以在SOD1介導(dǎo)的疾病中得到最充分的體現(xiàn)，可能需要進(jìn)行一項(xiàng)針對(duì)攜帶mSOD1患者的更大規(guī)模試驗(yàn)。

5總結(jié)與展望

蛋白平衡紊亂及隨后發(fā)生的蛋白聚集是ALS的普遍特征。雖然蛋白質(zhì)聚集與神經(jīng)元功能障礙和死亡之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，但它們之間的關(guān)系及機(jī)制仍然是該領(lǐng)域的最大問題之一。很明顯，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)崩潰是蛋白質(zhì)聚集的關(guān)鍵部分，而HSP廣泛參與蛋白穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，其功能下降或缺失及作用模式改變都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，最終引起蛋白質(zhì)聚集及隨后的神經(jīng)變性。在ALS環(huán)境中，HSP的表達(dá)與細(xì)胞存活有關(guān)，通過增加HSP水平可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡(luò)的能力仍是未來研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻(xiàn)］

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