桑白皮湯含藥血清調(diào)控人支氣管上皮細胞黏液高分泌的機制研究*

譚 衛(wèi) 劉 雨 張 鈺 李福星 彭朗萍 章 澳 譚光波，3△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)研究院，湖南 長沙 412000；3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 412000）

氣道黏液高分泌是一類嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病的特征，其中以慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的臨床表現(xiàn)尤為突出［1］。呼吸道黏液分泌機制是氣道的第一道防御機制的關(guān)鍵組成部分，在保持呼吸道濕化、保護上皮細胞功能等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。炎癥是導(dǎo)致氣道黏液高分泌的關(guān)鍵因素，多種炎癥細胞因子、炎癥介質(zhì)促使了杯狀細胞增生、黏蛋白合成以及調(diào)控黏液分泌［3］。根據(jù)實驗報道，抽煙、炎癥細胞因子和炎癥介質(zhì)、細菌產(chǎn)物如脂多糖、宿主細胞產(chǎn)物可通過多種途徑作用于氣道杯狀細胞，致使MUC5AC 的表達上調(diào)，導(dǎo)致氣道黏液分泌量增加［4-6］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)在應(yīng)對氣道黏液高分泌上缺乏特效藥物，不能達到理想的效果。而中醫(yī)藥在疾病治療上具有多靶點、多成分、整體把控的優(yōu)勢，在許多慢性、疑難疾病的治療中取得了較好的療效［7］。

中醫(yī)學(xué)將痰飲與COPD 視為一個始終伴隨的病理狀態(tài)，認為“氣道黏液高分泌”相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)中“痰飲”［8］。桑白皮湯出自《醫(yī)統(tǒng)大全·醫(yī)林》，具有清降肺氣、止咳化痰之效，臨床常用于治療嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病所致之痰多。研究表明，桑白皮湯能有效減輕氣道黏液分泌量，稀釋痰液黏稠度，助力痰液咯出［9］。前期數(shù)據(jù)挖掘表明，桑白皮湯可通過與白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等蛋白結(jié)合，進而調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)信號通路，發(fā)揮抗炎、抑制氣道黏液高分泌等作用。目前有研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究桑白皮湯治療COPD 的機制，但桑白皮湯對于氣道黏液高分泌的改善機制未深入研究。因此，本研究將以細胞實驗的方法觀察桑白皮湯含藥血清對于人支氣管上皮細胞中IL-1β、TNF-α 蛋白表達的影響，深入探究其治療氣道黏液高分泌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人支氣管上皮細胞，北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。培養(yǎng)箱條件為（37±0.3）℃，CO2濃度為5%。

1.2 實驗動物 12 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（260±50）g，飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃，相對濕度（60±5）%，通風(fēng)換氣（10±2）次/h 的無菌實驗室（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中心實驗樓）。動物由湖南斯萊克景達公司提供，許可證號SYXK（湘）2019-0009。

1.3 實驗藥物 桑白皮湯組成為桑白皮9 g，法半夏9 g，紫蘇子9 g，杏仁9 g，浙貝母9 g，山梔9 g，黃芩9 g，黃連3 g（湖南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院門診中藥房）。常規(guī)化學(xué)試劑；脂多糖溶液（LPS，碧云天，ST1470-10 mg）；CSE 原液（黃金葉香煙：河南中煙工業(yè)公司）；胎牛血清（購于Abiowell 公司）；乙酰半胱氨酸溶液（海南贊邦制藥有限公司）。

1.4 試劑制備 香煙溶液（CES）、脂多糖溶液（LSP）、含藥血清的制備。參考劉雨等［8］的CES 溶液及LSP 溶液制備方案，制備相應(yīng)造模用溶液。桑白皮湯含藥血清制備［10］：按照桑白皮湯原方劑量，按原藥材量加入10倍水，濃縮熬制后得到生藥濃度為1.5 g/mL 的藥液，使其冷卻裝入滅菌藥瓶，密封并置于4 ℃冰箱冷藏備用。方法：將12只SPF級雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，隨機分為兩組?？瞻捉M6 只、桑白皮湯組6 只,桑白皮湯臨床用量60 kg 體質(zhì)量成人每日服用66 g 生藥，按體表面積法換算成大鼠的等效劑量為每日6.87 g/kg、每日1 次，連續(xù)7 d 進行灌胃。第7 日最后一次灌胃后1 h，對大鼠進行麻醉、采血后離心，殺菌過濾后置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 細胞培養(yǎng) 按標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)條件，制備含有15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，將人支氣管上皮細胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，每天換液1次，按1∶3比例傳代。

1.6 分組及干預(yù) 將培養(yǎng)好的細胞分為4組：空白組加入10%胎牛血清；模型組加入15%香煙溶液和20 ng/mL脂多糖溶液以及10%胎牛血清；桑白皮湯組加入15%香煙溶液、20 ng/mL 脂多糖溶液以及10%桑白皮湯含藥血清；乙酰半胱氨酸組加入15%香煙溶液、20 ng/mL脂多糖溶液以及150 μmol/L 乙酰半胱氨酸溶液［10］。各組按標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)1 d后對細胞進行測定。

1.7 細胞形態(tài)學(xué)觀察 造模及藥物干預(yù)后，分別觀察正常組、模型組、桑白皮湯組、乙酰半胱氨酸組的細胞數(shù)目和形態(tài)。

1.8 細胞活性檢測 將檢測細胞按1.6 節(jié)中所述分組（空白組、模型組、桑白皮湯組、乙酰半胱氨酸溶液組），將CCK-8 溶液添加到細胞培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2.5 h后，酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度值。細胞存活率計算公式為：100%-（空白細胞組吸光值-藥物干預(yù)組吸光值）÷（空白細胞組）×100%。

1.9 Western blotting檢測 人支氣管上皮細胞黏液高分泌模型制備及取材：使用4～12代的人支氣管上皮細胞分為空白組、模型組、桑白皮湯組、乙酰半胱氨酸組，待細胞的生長情況約占培養(yǎng)瓶80%時開始實驗。正常組和模型組的干預(yù)過程同1.6節(jié)細胞干預(yù)措施一致，桑白皮湯組先加入15%香煙溶液和20 ng/mL 脂多糖溶液干預(yù)12 h 后，再次加入10%濃度的桑白皮湯含藥血清干預(yù)；乙酰半胱氨酸組先加入15%香煙溶液和20 ng/mL 脂多糖溶液干預(yù)12 h 后，再次加入150 μmol/L乙酰半胱氨酸溶液藥血清干預(yù)；12 h 后進行蛋白表達測定。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。資料符合正態(tài)性及方差齊性時，組間比較采用單因素方差分析；不滿足正態(tài)性或方差齊性時，采用非參數(shù)檢驗秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞形態(tài)數(shù)目改變 電子顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)和數(shù)目，空白組貼壁后細胞數(shù)目多，而且形態(tài)正常，大多為梭形?？瞻捉M與模型組對比，其形態(tài)大多呈現(xiàn)橢圓或不規(guī)則形改變，數(shù)目相對減少。桑白皮湯組、乙酰半胱氨酸組與模型組對比，形態(tài)基本同空白組類似，有較好的改善，且細胞數(shù)目增多。見圖1。

圖1 各組細胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2 各組CCK-8 細胞活性比較 見表1。15%香煙溶液與20 ng/mL脂多糖溶液干預(yù)后人支氣管上皮細胞增殖受到抑制，使用桑白皮湯含藥血清以及乙酰半胱氨酸溶液作用于損傷的人支氣管上皮細胞后，CCK-8結(jié)果顯示桑白皮湯含藥血清以及乙酰半胱氨酸溶液對損傷的人支氣管上皮細胞具有一定的促進增殖的作用（P＜0.05）。

表1 各組CCK-8細胞活性比較（±s）

表1 各組CCK-8細胞活性比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與正常組比較，◇P ＜0.05；與桑白皮湯組比較，△P ＜0.05。下同。

450 nm吸光度值1.60±0.50 0.62±0.13◇0.95±0.13*0.94±0.15△組 別空白組模型組桑白皮湯組乙酰半胱氨酸組

2.3 各組IL-1β、TNF-α 蛋白表達比較 見表2、圖2。模型組與空白組對比，IL-1β、TNF-α 蛋白條帶增粗且顏色變深（P＜0.05），證明氣道高分泌細胞模型建立成功。乙酰半胱氨酸組、桑白皮湯組與模型組相比，IL-1β、TNF-α 蛋白條帶不同程度的變細、顏色變淺，說明乙酰半胱氨酸組、桑白皮湯組均可抑制IL-1β、TNF-α 的表達。

表2 各組BEAS-2B細胞黏蛋白IL-1β、TNF-α表達比較（±s）

表2 各組BEAS-2B細胞黏蛋白IL-1β、TNF-α表達比較（±s）

組 別空白組模型組桑白皮湯組乙酰半胱氨酸組IL-1β 0.03±0.01 0.28±0.02 0.17±0.01 0.10±0.01 TNF-α 0.04±0.01 0.41±0.03 0.25±0.03 0.20±0.03參照蛋白（β-actin）117.71±17.19 113.82±14.04 117.48±17.12 114.80±6.82

圖2 各組IL-1β、TNF-α蛋白電泳條帶

3 討 論

氣道黏液高分泌是指黏蛋白基因調(diào)控、分泌釋放以及生物合成等一系列過程，其機制與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細胞失衡等病理生理機制有密切關(guān)聯(lián)［11］，呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病如哮喘、COPD、支氣管擴張癥導(dǎo)致的咯痰均伴隨著氣道黏液高分泌。有研究表明，炎癥介導(dǎo)了氣道黏液高分泌，機體的多種炎癥細胞因子、炎癥介質(zhì)促使了杯狀細胞增生、MUC 合成以及調(diào)控黏液分泌。過往研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對氣道黏液分泌有作用的細胞因子有TNF-α、IL-1β、白細胞介素-13（IL-13）、白細胞介素-17（IL-17）［3］，其中TNF-α、IL-1β、IL-13 是引起氣道黏液高分泌最主要的，也是目前研究最多的炎癥細胞因子［8］。

中醫(yī)學(xué)將痰飲與慢性阻塞性肺疾病視為一個始終伴隨的病理狀態(tài)，現(xiàn)代研究對于此狀態(tài)進行了深入探討研究，發(fā)現(xiàn)“氣道黏液高分泌”與中醫(yī)學(xué)中“痰飲”關(guān)系密切［12-13］。中醫(yī)學(xué)認為肺的生理功能為通調(diào)水道，肺氣之宣發(fā)與肅降對機體水液的輸布、運行和排泄進行調(diào)控，痰飲的形成與肺內(nèi)水道失衡、水津輸布失常有關(guān)。氣道黏液高分泌的中醫(yī)病機在于肺氣宣發(fā)與肅降失常，導(dǎo)致肺內(nèi)水道不利［14］。桑白皮湯是治療本病的經(jīng)典方劑之一，具有清熱化痰、宣肺平喘之功，運用于臨床治療COPD 效果良好［15］。藥物效能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桑白皮提取物槲皮素及桑白皮湯可調(diào)節(jié)氣道黏液分泌，使痰液稀釋,有利于痰液咯出［10］。

相關(guān)研究表明TNF-α 是氣道黏液高分泌的關(guān)鍵信號分子之一。TNF-α 介導(dǎo)的信號通路通過磷酸化IκB而抑制NF-κB的表達，使MUC5AC 基因表達增加，黏液合成增多［16-18］。楊曉敏等報道顯示健脾益肺化痰方能調(diào)控大鼠氣道黏液高分泌，這與抑制TNF-α/EGFR/PI3K 信號通路有關(guān)［19］。有實驗研究表明槲皮素通過激活NF-κB 途徑和EGFR 磷酸化,抑制氧化應(yīng)激和炎癥，減弱了CSE 誘導(dǎo)的Muc5ac 表達，從而減弱粘蛋白合成［10］。有研究表明，IL-1β 參與黏液高分泌的機制，是經(jīng)MAPK 激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p38-MAPK 及NF-κB 途徑而激活cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），從而誘導(dǎo)MUC5AC 基因表達［20-22］。

前期數(shù)據(jù)挖掘表明，桑白皮湯可通過與白細胞介素-6（IL-6）、TNF-α 等蛋白結(jié)合，進而調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)信號通路，發(fā)揮抗炎、抑制氣道黏液高分泌等作用。本研究通過香煙煙霧和脂多糖誘導(dǎo)人支氣管上皮細胞在體外建立氣道黏液高分泌模型，使用桑白皮湯含藥血清及乙酰半胱氨酸溶液進行干預(yù)處理，細胞實驗結(jié)果顯示，模型組細胞活性較空白組明顯下降，香煙煙霧以及脂多糖溶液構(gòu)建的模型細胞活性受損，桑白皮湯組的細胞活性上升，表明桑白皮湯可減少細胞損害。通過Western blotting 分析，模型組與空白組相對比，IL-1β、TNF-α 蛋白表達均明顯升高，桑白皮湯組與模型組比較，其能明顯降低IL-1β、TNF-α 蛋白表達，提示桑白皮湯可抑制IL-1β、TNF-α 蛋白表達。有研究表明，TNF-α、IL-1β 是引起氣道黏液高分泌最主要的，也是目前研究最多的炎癥細胞因子［8］，而桑白皮湯能夠抑制IL-1β、TNF 蛋白的表達，這表明桑白皮湯能抑制氣道黏液高分泌。

綜上所述，桑白皮湯可抑制TNF-α、IL-1β 蛋白的表達，而TNF-α、IL-1β 是引起氣道黏液高分泌最主要的炎癥細胞因子。由此可推測，桑白皮湯對氣道黏液高分泌的調(diào)節(jié)機制與調(diào)控炎癥細胞因子相關(guān)，且與TNF-α、IL-1β 蛋白的表達呈正相關(guān)。本研究拓寬了臨床上治療氣道黏液高分泌的思路。桑白皮湯調(diào)控炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 蛋白還需要在動物模型上進一步驗證。