低密度中性粒細(xì)胞的表型和功能多樣性

李佳玉 張野 黃長形 （空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院傳染病科，西安 710038）

中性粒細(xì)胞是人體數(shù)量最多的白細(xì)胞，占循環(huán)白細(xì)胞的50%～70%，在機(jī)體發(fā)生感染時(shí)首先被招募至感染部位，是宿主抵御外來病原體入侵的第一道防線，在清除病原體方面起重要作用［1-2］。中性粒細(xì)胞可通過吞噬、排出顆粒內(nèi)容物和釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）等方式發(fā)揮免疫防御及清除病原微生物等作用［3-4］。長期以來，人們一直認(rèn)為中性粒細(xì)胞是一種非特異性終末分化細(xì)胞，具有特定細(xì)胞核形態(tài)，功能單一，半衰期短，轉(zhuǎn)錄活性低［5-6］。但越來越多的研究者認(rèn)識(shí)到中性粒細(xì)胞是一種更為復(fù)雜的細(xì)胞，可合成細(xì)胞因子、趨化因子，對適應(yīng)性免疫也發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，具有不均一性和可塑性的特點(diǎn)［7-10］。在炎癥反應(yīng)中，中性粒細(xì)胞受多種細(xì)胞因子和趨化因子誘導(dǎo)發(fā)生活化使其壽命延長并呈現(xiàn)不同細(xì)胞表型［11-12］。越來越多的研究證實(shí)，在不同生理或病理狀況下，循環(huán)或組織中的確存在不同中性粒細(xì)胞表型和不同功能的中性粒細(xì)胞亞群［2，6，11，13］。

中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性是免疫病理生理學(xué)的重要特征［5，13］。有研究者已提出基于其成熟程度評估中性粒細(xì)胞亞群的策略［14-15］。但近20年來，越來越多的研究者根據(jù)中性粒細(xì)胞密度進(jìn)行分群。密度梯度離心采用Ficoll分離技術(shù)，這種技術(shù)在1976年開始應(yīng)用，常用于從人外周血白細(xì)胞中分離單個(gè)核細(xì)胞［16］。血液白細(xì)胞分層于Ficoll溶液，在離心過程中根據(jù)密度不同導(dǎo)致包含不同細(xì)胞類型的層形成。由于外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）密度較低（包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞），位于血漿和Ficoll之間的界面，而正常密度中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞位于底層。膿毒血癥、腫瘤、病毒感染、過敏性哮喘及系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）病理情況下，將患者全血密度梯度離心后，PBMCs中存在一個(gè)與正常密度中性粒細(xì)胞功能不同的低密度中性粒細(xì)胞亞群［14，17-23］。人們將中性粒細(xì)胞這個(gè)重要且獨(dú)特的亞群稱為低密度中性粒細(xì)胞（low density neutrophils，LDNs）。

LDNs名稱的由來是相對于紅細(xì)胞層分離出的正常密度中性粒細(xì)胞（normal density neutrophils，NDNs）或高密度中性粒細(xì)胞（high density neutrophils，HDNs）而言的。LDNs由活化的成熟中性粒細(xì)胞和不成熟的中性粒細(xì)胞共同組成［14］。在細(xì)菌、病毒等病原微生物所致感染性疾病和自身免疫性疾病中，中性粒細(xì)胞被招募和激活，一部分NDNs活化脫顆粒，導(dǎo)致密度降低，浮力改變，還有部分未成熟的中性粒細(xì)胞從骨髓中過早釋放，這兩種原因都使LDNs與PBMCs在同一密度梯度中共存［7，22］。流式細(xì)胞術(shù)測定表面標(biāo)志物表達(dá)可區(qū)別PBMCs中的單核細(xì)胞和LDNs。單核細(xì)胞高表達(dá)CD14和低表達(dá)CD15，LDNs高表達(dá)CD15和低表達(dá)CD14［24］。LDNs的表面標(biāo)志物主要為CD66b、CD11b、CD16、CD10等，CD66b是一種特定的粒細(xì)胞標(biāo)志物，參與呼吸暴發(fā)［8］；CD11b存在于明膠酶顆粒膜，分泌囊泡；CD16是成熟中性粒細(xì)胞標(biāo)志物，參與脫顆粒；CD10亦是一種中性粒細(xì)胞成熟標(biāo)志物，有研究發(fā)現(xiàn)CD10表達(dá)可將LDNs明確分為成熟和不成熟細(xì)胞，成熟的CD10+亞群表現(xiàn)為抑制T細(xì)胞增殖，而不成熟的CD10-亞群則表現(xiàn)為促進(jìn)T細(xì)胞增殖［6］。不同疾病的LDNs表面標(biāo)志物不同，如多發(fā)性骨髓瘤患者LDNs表達(dá)為CD11b+CD14-CD33+CD15+HLA-DRlow/-；HIV患者LDNs表達(dá)為CD15highCD33highCD66bhighCD62LlowPD-L1low［8］。目前研究發(fā)現(xiàn)，在多種疾病中LDNs比例明顯升高，在固有和適應(yīng)免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［14］。而在健康人體內(nèi)，LDNs比例極低［6］。

中性粒細(xì)胞表型在表面標(biāo)志物功能表達(dá)方面也存在異質(zhì)性［25］。根據(jù)其功能LDNs可分為促炎LDNs［也稱低密度粒細(xì)胞（LDGs）］和免疫抑制性LDNs［也稱粒細(xì)胞源性抑制細(xì)胞（PMN-MDSCs/GMDSCs）］。如在SLE和牛皮癬患者中發(fā)現(xiàn)的LDNs具有促炎功能，而在癌癥、慢性細(xì)菌和病毒感染、創(chuàng)傷和敗血癥多種病理?xiàng)l件下，PBMCs中發(fā)現(xiàn)的骨髓衍生抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）則具有免疫抑制功能。下面重點(diǎn)介紹SLE和癌癥中LDNs的表型和生物學(xué)特征。

1 SLE與促炎LDNs（LDGs）

SLE是一種嚴(yán)重的慢性且無法治愈的自身免疫性疾病。SLE患者血液中出現(xiàn)大量不成熟的嗜中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞失調(diào)與SLE的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［21，26］。1986年，研究者從成年SLE患者獲得的PBMCs制劑中發(fā)現(xiàn)了“低浮力密度中性粒細(xì)胞”［27］，越來越多的研究證明采用密度梯度法可在PBMCs中分離出LDNs。

SLE患者的LDNs表達(dá)CD15、CD16b、CD33和CD11b，與NDNs不同的是，SLE患者的LDNs表達(dá)更高水平的激活標(biāo)志物CD11b、CD66b、CD63和CD107a。LDNs的表面標(biāo)志還發(fā)現(xiàn)了CD11c、CD31、粒細(xì)胞集落刺激因子受體和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體。重要的是，SLE中LDNs執(zhí)行中性粒細(xì)胞功能的能力是兩極分化的，基于成熟的CD10+和不成熟的CD10-中性粒細(xì)胞。SLE患者的HDNs中90%為成熟細(xì)胞，而LDNs中60%為成熟細(xì)胞。

LDNs在SLE患者循環(huán)中明顯升高，CARMONARIVERA等［27］發(fā)現(xiàn)其檢查的成年SLE患者PBMCs層均存在LDNs。LDNs能積極產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子并在體外殺死內(nèi)皮細(xì)胞，具有促炎功能。研究表明，SLE中的LDNs分泌的促炎細(xì)胞因子水平升高、吞噬功能受損、NETs形成增多［14］。值得注意的是，SLE患者的LDNs顯示NETs形成增強(qiáng)，生成NETs能力增強(qiáng)依賴于線粒體ROS，通過增強(qiáng)線粒體ROS生成的NETs，在誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和其他炎癥細(xì)胞因子方面比其他刺激生成的NETs具有更強(qiáng)的免疫刺激性，提示這種類型中性粒細(xì)胞的存在可能是其他形式自身免疫性疾病的基礎(chǔ)［28］。值得注意的是，LDNs產(chǎn)生NETs的能力因疾病而異，如在SLE和銀屑病中，LDNs比同一患者的NDNs產(chǎn)生更多NETs；而在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，NETs形成似乎無差異［7］；高血壓中NETs形成減少［22］。MISTRY等［21］也證實(shí)了LDNs的這些特性，利用個(gè)體和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀遺傳學(xué)和功能分析發(fā)現(xiàn)SLE患者的LDNs具有顯著轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳異質(zhì)性，LDNs的轉(zhuǎn)錄因子基序分析與NDNs和健康對照中性粒細(xì)胞存在差異，各亞群在NETs形成、氧化線粒體DNA釋放、趨化性、吞噬作用、脫顆粒、損害內(nèi)皮能力以及對Ⅰ型干擾素刺激的反應(yīng)等方面差異明顯。

SLE的致病因素與Ⅰ型干擾素密切相關(guān)，超過50%SLE患者的干擾素通路被激活［29］。研究發(fā)現(xiàn)，SLE中的LDNs可增加Ⅰ型干擾素分泌，有助于炎癥和組織損傷循環(huán)［14，21］。與其他免疫細(xì)胞亞群相比，LDNs的干擾素基因表達(dá)最高。不同LDNs亞群與狼瘡的具體臨床特征和冠狀動(dòng)脈疾病的存在和嚴(yán)重程度相關(guān)。LDNs在SLE中促進(jìn)免疫失調(diào)和顯著血管損傷［21］。

目前不少研究者將LDNs作為SLE治療的新靶點(diǎn)，認(rèn)為對致病性LDNs亞群的識(shí)別可能有助于開發(fā)靶向中性粒細(xì)胞群體的藥物，同時(shí)保留中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的宿主防御。LDNs中促進(jìn)NETs形成或促進(jìn)NETs清除的藥物可能為SLE提供新的治療策略。

2 癌癥與免疫抑制LDNs（PMN-MDSCs/G-MDSCs）

中性粒細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中具有功能可塑性，同時(shí)具有促腫瘤和抗腫瘤功能，在癌癥進(jìn)展中起重要作用［30-32］。癌癥早期，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils，TANs）可能顯示抗腫瘤特性，但在癌癥晚期，中性粒細(xì)胞發(fā)揮增殖、侵襲和擴(kuò)散以及免疫抑制功能促進(jìn)癌癥進(jìn)展，因此多數(shù)研究將中性粒細(xì)胞描述為癌癥進(jìn)展的主要驅(qū)動(dòng)力。一項(xiàng)對數(shù)千例人類癌癥的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞與疾病預(yù)后差相關(guān)［33］。越來越多的研究將循環(huán)中的中性粒細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比例作為評估癌癥進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志物［15，34-35］。

值得注意的是，中性粒細(xì)胞的表型和功能在腫瘤進(jìn)展過程中變化較大［36］。大量關(guān)于癌癥的研究都報(bào)道了一種中性粒細(xì)胞的亞群——LDNs，其比例隨著癌癥進(jìn)展顯著升高，因此LDNs往往成為循環(huán)中性粒細(xì)胞的主導(dǎo)群體［37］。LDNs已在乳腺癌、肺癌、頭頸部癌癥、泌尿系統(tǒng)癌癥和淋巴瘤患者中被發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，晚期肺癌患者LDNs比例越高（＞10%）預(yù)示生存率越低［2］。癌癥中的LDNs由未成熟的MDSCs和成熟的細(xì)胞組成［15］。癌癥研究中，LDNs具有免疫抑制特性，通常也稱為PMN-MDSCs/GMDSCs。

MDSCs是2007年提出的術(shù)語，代表未成熟髓樣細(xì)胞的異質(zhì)群體，參與疾病免疫調(diào)節(jié)各方面，包括癌癥、感染、自身免疫性疾病、創(chuàng)傷等［38］。其中，MDSCs在腫瘤微環(huán)境內(nèi)為抑制細(xì)胞并能防止腫瘤細(xì)胞被免疫消除［39］。MDSCs由兩大群細(xì)胞組成：多形核MDSCs（PMN-MDSCs）和單核M-DSCs（M-MDSCs）［39-40］。PMN-MDSCs/G-MDSCs在表型和形態(tài)上與中性粒細(xì)胞相似，而M-MDSCs與單核細(xì)胞相似。

目前，從PMN-MDSC中分離中性粒細(xì)胞的唯一方法是梯度離心。最初使用術(shù)語“G-MDSCs”描述PMN-MDSCs，但目前發(fā)現(xiàn)PMN-MDSCs能更好地定義MDSCs這個(gè)亞群。PMN-MDSC在表型上不同于正常成熟的中性粒細(xì)胞，PMN-MDSC顆粒減少，浮力改變，CD16和CD62L表達(dá)減少，精氨酸酶1增加，CD11b和CD66b表達(dá)增加［38］。

人類PMN-MDSC的特征為CD11b+CD14-CD15+HLA-DR-或CD11b+CD14-CD66b+，小鼠PMN-MDSC特征為CD11b+Ly6GhighLy6Clow細(xì)胞和類似中性粒細(xì)胞。人類M-MDSC特征為CD11b+CD14+CD15-HLADRlow/-，由于HLA-DR低表達(dá)或缺失，M-MDSC可與單核細(xì)胞區(qū)分，小鼠M-MDSC特征為CD11b+Ly6GLy6Chigh［39，41］。可見PMN-MDSC和M-MDSC不僅在表型和形態(tài)上不同，且具有獨(dú)特（雖然部分重疊）的功能特征和生化特征，這些特征反映其在不同病理?xiàng)l件下具有不同作用。

PMN-MDSCs的標(biāo)志是其抑制T細(xì)胞功能的能力，與LDNs在SLE中的研究結(jié)果不同。兩項(xiàng)調(diào)查SLE患者M(jìn)DSCs的研究表明，PMN-MDSC表型細(xì)胞水平與升高的疾病活性和干擾素信號(hào)相關(guān)，但未抑制T細(xì)胞增殖或激活，因此是LDGs而非MDSCs［23，40］。

早期癌癥發(fā)展過程中，NDNs占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致整體抗腫瘤反應(yīng)。隨著癌癥進(jìn)展，LDNs成為主導(dǎo)，導(dǎo)致整個(gè)中性粒細(xì)胞表型轉(zhuǎn)向促腫瘤功能。SAGIV等［37］研究發(fā)現(xiàn)，成熟的NDNs能夠以依賴TGF-β的方式轉(zhuǎn)換為LDNs，這種轉(zhuǎn)換會(huì)成為LDNs——未成熟粒細(xì)胞骨髓源性抑制細(xì)胞（G-MDSCs），丟失了抗腫瘤特性卻獲得免疫抑制特性。雖然HDNs和LDNs可能來自共同的祖細(xì)胞，但其進(jìn)入循環(huán)的釋放受到不同調(diào)節(jié)。LDNs在循環(huán)中迅速積累，而NDNs在循環(huán)中出現(xiàn)的時(shí)間要晚得多。盡管不少研究證明中性粒細(xì)胞表型在體內(nèi)發(fā)生了轉(zhuǎn)換，但由于中性粒細(xì)胞回收程度低，這種轉(zhuǎn)換的全部程度難以在體內(nèi)評估［37］。

3 結(jié)論

中性粒細(xì)胞具有異質(zhì)性和可塑性，在疾病中發(fā)揮復(fù)雜多樣的功能，已證實(shí)中性粒細(xì)胞具有不同亞群。近20年來，具有促炎和免疫抑制功能的LDNs亞群得到廣泛關(guān)注。研究表明，LDNs是一個(gè)異質(zhì)群體，通常有很大比例的未成熟細(xì)胞。成熟細(xì)胞和不成熟細(xì)胞的比例與疾病種類及病情均有關(guān)。LDNs在固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，活躍地參與病理性損傷，這是一個(gè)有希望干預(yù)的新治療領(lǐng)域。研究該亞群有助于開發(fā)對疾病有針對性、有選擇性的藥物，如在SLE中，促炎LDNs能通過線粒體ROS產(chǎn)生增加NETs形成，因此直接靶向LDNs為研究新的治療藥物提供策略；癌癥過程中，CCR5在引導(dǎo)免疫抑制性LDNs動(dòng)員中起關(guān)鍵作用，因此建議將阻斷CCR5作為癌癥治療的方法。目前尚無明確的標(biāo)志物確定LDNs這個(gè)群體的深度特征。LDNs亞群的表型和功能差異需要進(jìn)一步研究，作為一種新的治療目標(biāo)為疾病提供新的治療策略。