微小RNA與重癥肌無(wú)力關(guān)系的研究進(jìn)展

王欽 徐勇 武星星 魏玉惠 王云甫 （湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰 442000）

重癥肌無(wú)力（myasthenia gravis，MG）是一種累及神經(jīng)肌肉接頭處的由抗乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）抗體介導(dǎo)、CD4+T細(xì)胞依賴(lài)的自身免疫性疾病，表現(xiàn)為肌肉病態(tài)疲勞和無(wú)力，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［1］。miRNA是一類(lèi)小分子非編碼RNA，在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其參與調(diào)控CD4+T細(xì)胞的分化和功能，與多種自身免疫性疾病有關(guān)［2-3］?，F(xiàn)有研究表明MG患者體內(nèi)存在多種miRNAs表達(dá)異常，miRNA可能在MG的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能是MG有效的生物標(biāo)志物。有研究者以miRNA為治療靶點(diǎn)明顯改善了患者實(shí)驗(yàn)性重癥肌無(wú)力（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）癥狀。本文現(xiàn)就miRNAs與MG的關(guān)系進(jìn)行綜述，以期對(duì)MG的診斷及治療策略提供新的思路。

1 miRNA概述

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)18～25 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，起源于細(xì)胞核，在免疫應(yīng)答過(guò)程中，miRNAs在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的發(fā)育和分化方面具有關(guān)鍵作用。miRNA首先在細(xì)胞核內(nèi)被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成初始miRNA（primary miRNA，pri-miRNA），再由一種核糖核酸酶ⅢDrosha酶剪切，形成60～70 nt的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)前體（pre-miRNA）。Pre-miRNA再通過(guò)蛋白Exportin5和G蛋白因子Ran（Ran-GTP）轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，與Dicer酶（一種核糖核酸酶Ⅲ）結(jié)合并被其加工形成成熟的雙鏈miRNA。然后其一條鏈被迅速降解，另一條鏈與Dicer酶、Argonaute蛋白等生物大分子裝配形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）［4］。miRNA基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶mRNAs的3'端非翻譯區(qū)（3' untranslated region，3'UTR）中的特定序列結(jié)合，指導(dǎo)RISC抑制靶mRNA的翻譯，或誘導(dǎo)靶mRNA降解，從而影響基因表達(dá)的微調(diào)、蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

2 miRNA與MG的相關(guān)性

MG作為一種自身免疫性疾病，存在基于表觀(guān)遺傳、環(huán)境因素相互作用的致病機(jī)制。miRNA是基因表達(dá)最重要的表觀(guān)遺傳調(diào)控因子之一，對(duì)各種生理和病理過(guò)程的調(diào)控至關(guān)重要，其與MG的關(guān)系引起許多學(xué)者的關(guān)注與思考［5-6］。

BARZAGO等［7］采用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法比較了抗AChR抗體陽(yáng)性早發(fā)型重癥肌無(wú)力患者（early onset myasthenia gravis，EOMG）和健康對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)AChR-EOMG患者有11種pre-miRNAs差異表達(dá)，其中miR-612、miR-3654和miR-3651表達(dá)上調(diào)。SABRE等［8］對(duì)比了4例未經(jīng)免疫抑制治療的遲發(fā)型MG患者（late onset myasthenia gravis，LOMG）和4例健康對(duì)照者的外周血miRNA，在LOMG中發(fā)現(xiàn)miR-106b-3p、miR-30e-5p、miR-223-5p、miR-140-5p、miR-19b-3p水平明顯升高。CRON等［9］通過(guò)miRNA基因組分析發(fā)現(xiàn)特定的胸腺miRNAs可能與MG相關(guān)。在肌肉特異性酪氨酸激酶抗體陽(yáng)性的MG患者中也發(fā)現(xiàn)存在miRNAs水平異常，miR-423-5p、let-7d-3p、miR-409-3等表達(dá)上調(diào)，而miR-25-3p、miR-140-3p表達(dá)下調(diào)［10］。這些研究表明MG中存在多種miRNAs異常表達(dá)。

MG是一種免疫耐受障礙導(dǎo)致的自身免疫性疾病，有研究報(bào)道在MG中Th17細(xì)胞數(shù)量增多，Treg細(xì)胞亞群減少［11-12］。Th17細(xì)胞參與B細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性抗體的過(guò)程，與MG神經(jīng)肌肉接頭處的慢性炎癥有關(guān)［13］。Treg細(xì)胞參與免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)的維持，在MG患者中，免疫耐受障礙被認(rèn)為與Treg細(xì)胞功能障礙有關(guān)。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞失衡被認(rèn)為是MG免疫發(fā)病機(jī)制的主要驅(qū)動(dòng)因素［14］。miRNA是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，許多研究表明miRNA在病理生理?xiàng)l件下對(duì)調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的分化和功能具有重要作用［15-17］。

WANG等［18］在EAMG大鼠模型中發(fā)現(xiàn)miR-145表達(dá)顯著下調(diào)，其靶蛋白CD28、NFATc1過(guò)表達(dá)，從而促進(jìn)了Th17細(xì)胞分化。CRON等［19］發(fā)現(xiàn)在 EAMG小鼠模型中Th17細(xì)胞增多可能與miR-29表達(dá)減少有關(guān)。叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Treg細(xì)胞生成及行使免疫抑制功能的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其下調(diào)可導(dǎo)致Treg細(xì)胞功能喪失。LI等［20］在伴胸腺瘤的MG患者中檢測(cè)到miR-125a-5p高表達(dá)，并與Foxp3 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。隨后進(jìn)一步證實(shí)Foxp3是miR-125a-5p的靶點(diǎn)，miR-125a-5p可下調(diào)Foxp3表達(dá)，表明miR-125a-5p可能通過(guò)影響Foxp3表達(dá)參與胸腺相關(guān)MG的發(fā)病。以上研究表明miRNA可能通過(guò)影響Th17及Tregs在MG的發(fā)生中發(fā)揮作用。

3 miRNA與MG的診斷

MG作為一種抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，其診斷標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)明確，但尚缺可靠的反映疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物及可能更好地支持治療進(jìn)展的藥效學(xué)生物標(biāo)志物。血清抗體有助于明確診斷，但抗體滴度不一定與患者的疾病進(jìn)展或治療反應(yīng)相關(guān)。臨床肌肉疲勞的客觀(guān)測(cè)量容易出現(xiàn)波動(dòng)，可能受對(duì)癥治療的影響，胸腺病理評(píng)估也不適合隨時(shí)間追蹤病程。

循環(huán)中的miRNAs在體液（尿液、血液等）中具有高度穩(wěn)定性，在某些癌癥中已將循環(huán)中的miRNAs用作生物標(biāo)志物和診斷工具［21］。miRNA可能是一種非常有潛力的MG生物標(biāo)志物。PUNGA等［22］采用逆轉(zhuǎn)錄定量（qRT-PCR）方法檢測(cè)71例MG患者和55例健康對(duì)照者及23例自身免疫性疾?。ˋddison病、Crohn病和銀屑病）患者血清中miR-150-5p和miR-21-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MG患者血清中miR-150-5p和miR-21-5p水平高于健康對(duì)照者，而在自身免疫性疾病患者組中，miR-150-5p和miR-21-5p水平與健康對(duì)照組者相當(dāng)，表明miR-150-5p和miR-21-5p在MG中具有特異性。SABRE等［8］對(duì)4例LOMG患者和4例健康對(duì)照的發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和73例LOMG患者的前瞻性診斷驗(yàn)證隊(duì)列中的循環(huán)miRNA進(jìn)行評(píng)估，并進(jìn)行了縱向隨訪(fǎng)，發(fā)現(xiàn)miR-150-5p、miR-21-5p和miR-30e-5p的水平在免疫抑制治療開(kāi)始后隨著臨床的改善而降低，其水平與臨床MG的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。XU等［23］發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p在MG中表達(dá)下調(diào)，且在不同類(lèi)型的MG中表達(dá)不同，其與MG的嚴(yán)重程度相關(guān)。CAVALCANTE等［24］對(duì)40例免疫抑制治療有效和無(wú)效的意大利MG患者的外周血進(jìn)行miRNome全序列測(cè)定，然后用實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證miRNAs，鑒定出41個(gè)miRNAs在治療無(wú)效MG患者與治療有效MG患者中存在表達(dá)差異，驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-323b-3p、miR-409-3p和miR-485-3p在無(wú)效組中與有效組相比顯著降低，miR-181D-5p和miR-340-3p呈相反趨勢(shì)。隨后作者在免疫抑制治療有效和無(wú)效的以色列MG患者中（n=33）進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-323b-3p、miR-409-3p、miR-485-3p、miR-181D-5p和miR-340-3p可作為檢驗(yàn)藥物療效的生物標(biāo)志物。

4 miRNA與MG的治療

目前MG的治療主要以MG亞型為基礎(chǔ)，包括使用乙酰膽堿酯酶抑制劑的對(duì)癥治療、胸腺切除術(shù)和免疫治療及靜脈注射免疫球蛋白和血漿置換等用于疾病惡化的快速治療方法。這些治療手段均不能有效防止疾病的復(fù)發(fā)與進(jìn)展，而且在長(zhǎng)期使用后存在感染、股骨頭壞死等嚴(yán)重并發(fā)癥，并且仍有10%的MG患者難以治療［25］。開(kāi)辟新的能夠抑制免疫病理變化，阻斷MG病情且副作用小的治療途徑是許多研究者的目標(biāo)。

LIU等［26］發(fā)現(xiàn)在MG患者中miR-181a表達(dá)減少，其靶向細(xì)胞因子IL-2影響Th17細(xì)胞分化，隨后他們用miR-181a治療EAMG小鼠，發(fā)現(xiàn)miR-181a降低了Th17細(xì)胞比例，提高了Treg細(xì)胞比例，且抗AchR抗體水平降低，EAMG小鼠癥狀得到明顯改善。此外，ZHANG等［27］使用抑制劑AntagomiR-146a沉默miR-146a有效改善了正在進(jìn)行的EAMG小鼠的臨床肌無(wú)力癥狀，WANG等［28］通過(guò)沉默miR-155降低了AChR特異性抗體，有效改善了EAMG癥狀。這些研究表明miRNA可能是治療MG的潛在靶點(diǎn)，有望在未來(lái)推動(dòng)MG的個(gè)性化治療。

5 展望

MG作為一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，其免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制及新型治療途徑的開(kāi)辟備受關(guān)注。miRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在MG的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，某些miRNA也可能成為治療MG的有效靶點(diǎn)，且檢測(cè)體液中的miRNA可能有助于MG的診斷和監(jiān)測(cè)。因此，研究可以從miRNA入手，聚焦于miRNA在MG免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中的作用，發(fā)掘miRNA中可能存在的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，從而促進(jìn)MG的臨床分子診斷和個(gè)性化治療。