小細胞外囊泡（sEVs）介導HBV感染及相關機制的研究進展

劉佳敏 張自力 曾蓉 徐旭 楊艷紅 彭彬 戢敏 潘萬龍

（1.川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學與法醫(yī)學研究所，南充 637000；2.川北醫(yī)學院電子顯微鏡結構研究單位，南充 637000；3.簡陽市人民醫(yī)院，成都 641400）

小細胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）作為細胞間通訊的重要橋梁，由脂質雙分子層組成，內、外層膜在磷脂組成方面無明顯差異，包含與本源細胞相同的內容物，如：DNA，核酸，蛋白質等。sEVs因其結構特異性而具有抗降解能力，在體液中可以保護包裹的物質不易被破壞，從而能夠更好地促進物質的轉運和調控［1］。大多數(shù)用于分離外泌體的方法也是共同分離不同生物源性的EVs異質群體的方法，所以2018年國際細胞外囊泡學會（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）重新定義了胞外囊泡。將直徑小于200 nm的EVs定義為小EVs，大于或等于200 nm為大或中EVs［2-3］。近年來，細胞外囊泡因其特異性的結構和功能逐漸引起研究者廣泛的關注和興趣，特別是在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）研究方面［4］。

乙型肝炎是世界傳染性疾病之一。全球有2.96億人是慢性HBV攜帶者，約有100萬攜帶者死于HBV嚴重并發(fā)癥［5］。近年來，盡管乙型肝炎通過疫苗預防有效降低了新發(fā)疾病數(shù)量，但仍存在5%疫苗無應答個體，加之感染人群基數(shù)巨大，因此，診斷和治療HBV感染仍是亟待解決的問題［6］。人體一旦感染HBV，HBV可能持續(xù)存在［7］。治愈乙型肝炎患者的基礎在于充分掌握HBV復制調控的分子機制，HBV主要與肝細胞膜表面的肝膽汁酸轉運蛋白?；悄懰徕c共轉運多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）或硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）受體結合進入細胞內部進行復制傳播［8-9］，但近期發(fā)現(xiàn)這并不是HBV傳染的唯一途徑。據(jù)文獻報道，除了受體途徑以外，sEVs可以介導HBV傳播未感染的肝細胞［10］。HBV與sEVs之間相互作用尚未被充分了解，因此迫切需要在這一領域進行進一步的研究，本文主要綜述sEVs與HBV傳遞的關系及sEVs介導HBV感染的分子機制，為研究HBV持續(xù)感染提供新的視角。

1 HBV的生命周期

HBV是一種小包膜DNA病毒，通過吸附表面受體進入胞內釋放核衣殼，松弛環(huán)狀雙鏈DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）穿梭到核內并轉化為共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），轉錄病毒RNA并出核翻譯，裝載前基因組RNA（pregenomic RNA，PgRNA）和病毒聚合酶形成新的核衣殼，逆轉錄產生成熟的病毒粒子［11-12］。而聚集在內質網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）-高爾基體（Golgi）中間隔室的HBV，一旦與核衣殼接觸，便會觸發(fā)包膜蛋白在MVB膜中形成緊密的排列，隨后驅動向內出芽，產生完整的包膜病毒粒子。在HBV包膜病毒粒子的產生的過程中需要一種E類蛋白AIP1/Alix，這類蛋白是多泡體（multivesicular bodies，MVB）依賴病毒粒子的結合伙伴，與內吞體分選復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）成分相互作用，從而可以催化MVB囊泡萌發(fā)的下游機制，并促進MVB的分選和囊泡的形成［13-14］。然而，ESCRT不僅是HBV病毒粒子包膜產生的重要成分，同時也是sEVs驅動、分選、膜形成和脫落的重要因子［15-16］。另外，sEVs中含有高水平的補體抑制蛋白（CD55，CD59），可以保護顆粒免受IG介導的補體招募和裂解的破壞，并且廣泛的包膜病毒（即HIV-1，HBV等）能夠挾持并利用ESCRT復合物從質膜上發(fā)芽［17］。而從質膜發(fā)芽的病毒粒子可通過網(wǎng)狀蛋白介導的內吞作用（clathrinmediated endocytosis，CME）和持續(xù)大量的胞吞作用介導病毒感染，這些途徑均可以允許sEVs進入。在sEVs內化后，可依靠脂質溶酶雙磷脂酸（lysobisphosphatidic acid，LBPA），一種能使病毒穿透sEVs密切相關的離子，促進晚期內小體/多囊泡小體（LES/MVB）的sEVs的膜融合和伴隨的內容物脫落［18］。新近研究表明，在慢性乙型肝炎患者中，從血清分離出來的純化的sEVs含有rcDNA和cccDNA等核酸物質［19］。

以上研究表明，HBV病毒粒子的產生需要利用ESCRT復合物和MVB，sEVs可能通過MVBs與質膜融合使攜帶HBV病毒粒子從質膜上脫落，從而分泌到細胞外基質中。隨后通過內吞途徑胞吞sEVs，sEVs所包裹的DNA可脫落進入肝細胞內進一步完成病毒的周期循環(huán)。

2 HBV感染中sEVs的作用

sEVs作為細胞間生物活性分子運輸?shù)妮d體，其功能不僅取決于來源細胞，也依賴于其包裹內含物，sEVs中包含與HBV相關物質，如HBV DNA，編碼和非編碼RNA，蛋白質甚至相關的線粒體DNA，它們因脂質雙分子的保護從而避免了降解，sEVs可作為細胞間的傳播者，促進內容物在體外和體內的直接轉移［20］。

2.1 HBV挾持sEVs進行傳播 在HBV感染性疾病當中，除了受體途徑之外，sEVs可作為HBV DNA的強大載體，將它們從受感染細胞運送到未受感染細胞，以促進HBV的傳播［21-22］。有研究證明，慢性乙型肝炎患者血清中的sEVs能誘導內含物HBV DNA在幼稚的人肝細胞中活動性感染，進而促進病毒的轉移［19，23］。sEVs生物發(fā)生的過程中有一種關鍵的酶即中性鞘磷脂酶2（neutral sphingomyelinase 2，nSmnase2），乙型肝炎x抗原（hepatitis B x antigen，HBx）可以通過誘導nSmase2的活性來增加sEVs的產生［24］。中性Ⅱ型鞘磷脂酶產生的神經(jīng)酰胺參與sEVs的生物發(fā)生，介導膜亞結構域的形成，誘導MVBs膜向內出芽，并觸發(fā)產生含有HBV DNA的sEVs，傳遞給未感染的肝細胞［25-26］。另外，sEVs除了可以介導HBV感染細胞DNA的傳播之外，它還可以介導線粒體DNA（mtDNA）激活ATM-Chk2（共濟失調毛細血管擴張癥突變激酶及下游靶基因Chk2）信號通路，從而預防HBV相關的肝?。?7］。

這些研究表明，在HBV感染中，HBV可挾持sEVs，在細胞間傳遞HBV DNA給未受感染的細胞介導病毒的傳播，同時還可以介導細胞質DNA預防疾病的發(fā)生。

2.2 sEVs攜帶核酸對HBV感染的影響 sEVs中富集大量的編碼和非編碼RNA并可將它們運輸?shù)绞荏w細胞，執(zhí)行各種生理功能，調節(jié)轉錄后的基因表達，尤其是在病理情況下的調控更為顯著［28］。在病毒感染過程中，sEVs攜帶的肝炎病毒因其分泌及組成受病毒感染的影響，除了可以擴大肝炎病毒的傳播范圍外，還可以攜帶大量的病毒抗原顆粒促進疾病發(fā)生［29］。在HBV感染的患者中，HBx蛋白存在時可以調節(jié)sEVs的生物發(fā)生機制，這些囊泡特異性地包裹HBx mRNA和蛋白，并在細胞外環(huán)境中脫落，從而影響內環(huán)境穩(wěn)態(tài)［24］。同時，感染也會增加肝細胞中miR-21的表達，sEVs可攜帶miR-21下調IL-12的表達從而抑制NK細胞的活性［30］。然而，這些復雜的囊泡物質賦予了sEVs在機體正常和病理環(huán)境調節(jié)過程中具有相互矛盾的關系，其不僅能介導病毒的傳播，還具有抵抗病毒的表現(xiàn)。

HBV-miR-3可通過sEVs和HBV病毒粒子釋放到循環(huán)中，sEVs穿梭HBV-miR-3靶向HBV轉錄本的特定位點，特異性地降低HBc蛋白表達、PgRNA水平和HBV復制中間產物（HBV-RI）的生成，從而抑制HBV病毒粒子的復制［31-32］。進一步，sEVs釋放的HBV-miR-3可刺激巨噬細胞M1極化，使細胞因子信號抑制因子5表達缺失從而激活JAK/STAT通路增強IFN誘導的抗HBV作用［33-34］。由此可見，sEVs中的HBV-miR-3通過減少肝細胞損傷，有助于治療HBV持續(xù)感染患者的發(fā)展。

這些研究表明，在HBV感染中sEVs具有穿梭編碼和非編碼RNA和相關蛋白質的功能，這些活性分子物質不僅會促進病毒復制，同時也具有矛盾的另一面，抵抗病毒的增加。了解HBV相關sEVs包含的這些生物活性的核酸，將有助于研究HBV引起慢性感染的過程。

2.3 sEVs內含物蛋白質對HBV感染的影響 在HBV感染狀態(tài)下，HBV抗原激發(fā)細胞外基質成分和相關因子的產生，它們是一類具有廣泛生物學活性的分子蛋白質，sEVs則是它們的關鍵傳播者。例如：sEVs可通過激活模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），如Toll樣受體3（Toll-like receptors 3，TLR3），從而增強T細胞活性產生IL-17A而加劇肝臟疾病的發(fā)展，致肝星狀細胞從靜止狀態(tài)激活啟動纖維化階段［35-36］。sEVs介導的IFN誘導的跨膜蛋白2，一種作用于Ⅰ型IFN信號的上游的負調控因子，從肝細胞向樹突狀細胞的運輸增強了IFITM2對內源性IFN-α合成的抑制作用，從而阻斷了外源性干擾素的抗乙型肝炎病毒的療效［37］。然而，在肝非實質細胞中，IFN-α誘導的sEVs卻富含具有抗病毒活性的分子，這些活性物質被肝細胞所內化后可以使機體抵御HBV病毒的入侵［38］。

這些研究表明，sEVs具有豐富的蛋白質成分，無論是大分子蛋白質如TLR3，還是小分子蛋白質如IFN-α等，在HBV感染的過程中sEVs攜帶的蛋白質對細胞均具有一定的調控作用，這種調控作用具有雙向性，既可以促進疾病的發(fā)生，也可以防止病毒的入侵。

3 sEVs在HBV感染中的臨床潛在應用

在HBV感染中，sEVs是極其復雜的獨立結構，其所攜帶的物質會促進病毒適應動態(tài)的微環(huán)境變化，導致HBV感染過程中促炎和抗炎作用的失衡，從而造成機體的損傷或抗病毒反應。同時sEVs也可成為檢測疾病的診斷和治療方法。

3.1 sEVs可作為HBV感染的生物標志物 HBV感染與肝臟疾病的發(fā)生密切相關，雖然現(xiàn)在有很多檢測肝炎及相關并發(fā)癥的診斷方法，但對于它們的早期診斷卻不具有準確性。臨床上現(xiàn)有的生化標志物存在一定的局限性，且不能準確反映肝炎情況。sEVs由于具有穩(wěn)定性、可用性以及在體液中廣泛分布等優(yōu)勢，在肝炎疾病的輔助診斷中具有重要價值，并可能成為診斷不同嚴重程度的乙型肝炎的新生物標志物［39］。有研究表明，sEVs所攜帶的mi-RNA，如miR-122和miR-151，比ALT能更穩(wěn)定和敏感地反映肝臟炎癥活動［40］。在90%以上感染HBV的肝癌患者中，發(fā)現(xiàn)血清中sEVs攜帶的miR-21和miR-17-5p等具有高度的敏感性和特異性，sEVs攜帶的miR-21標記效果要比血清miR-21更好［41-42］。此外，sEVs所攜帶的lncRNAs在HBV感染中也起著重要作用，如HAR1A、HAR1B和HOTAIR表達的變化可能表明它們通過CoREST/REST復合物參與了HBV基因的表觀遺傳抑制，在感染的預后中起重要作用，循環(huán)HOTTIP在HBV患者中表達增加，可作為一種治療和鑒定因子［43-44］。

雖然已有大量研究證實sEVs可作為HBV感染的輔助診斷工具，但其不確定性也有很多，例如sEVs的儲存困難，HCC患者的血清中也上調miR-122生物標志物，lncRNA的HOTAIR因子可促進胃癌的發(fā)生，進一步表明sEVs的miRNA和lncRNA缺乏一定的特異性［45-46］。盡管如此，sEVs在HBV感染中的價值是我們不可忽視的，闡明sEVs中miRNA和lncRNA與HBV之間的關系，將有助于我們了解HBV感染。

3.2 sEVs可作為HBV感染的新的治療方法 目前只有核苷酸類似物和PEG-IFN這兩種HBV治療方法，但易造成耐藥性和HBV反彈［47-48］。sEVs由于其自身的特異性結構和屬性，可作為納米穿孔技術的研究用于治療性蛋白質和抗病毒藥物的載體［49-51］。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內有一種未經(jīng)修飾的sEVs作為重組HBV抗原佐劑的疫苗可以誘導Th1細胞的免疫應答，從而提高IFN-γ的水平，CD4+T細胞釋放的sEVs可以活化B細胞反應從而提高HBsAg疫苗的療效，雖然這些研究還處于早期階段，需要進一步的研究來確定治療靶點，但與傳統(tǒng)疫苗相比，它更容易制備和操作，同時具有一定的安全性、可用性、穩(wěn)定性和耐用性［52-54］。來自DEXs（樹突狀細胞的sEVs）制備的疫苗已應用于Ⅰ期臨床試驗中，同時評估了其可行性和安全性［55-56］。因此表明，sEVs將來可作為針對HBV的候選疫苗。

4 討論

sEVs從代謝廢物一躍成為人們爭先恐后研究的“寵兒”，因其本身結構的異質性和特殊性，在病理微環(huán)境，信號傳導和調節(jié)炎癥反應中發(fā)揮重要的媒介作用。隨著研究的深入，sEVs在HBV感染中作用逐漸被揭示，其不僅與HBV的感染具有密切的關系，而且是HBV生命周期的關鍵調控者。盡管在HBV感染的診斷和治療方面仍然存在很多困難，并且對HBV病毒挾持sEVs進行傳播和調控機體的感染機制也不是完全明了，但sEVs作為HBV 感染的新生物標志物和診療手段未來可期。深入研究這些納米級的微小顆粒物質在HBV感染性疾病中的作用，有助于臨床上HBV感染的診斷和治愈。