茶葉中吡咯里西啶生物堿殘留量檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀

摘要：綜述了茶葉中吡咯里西啶生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）殘留量的檢測(cè)方法，包括比色法、毛細(xì)管電泳法、免疫學(xué)方法、色譜分析法等，并總結(jié)了國(guó)內(nèi)外茶葉中PAs殘留研究現(xiàn)狀，分析了茶葉中PAs的毒性作用以及國(guó)內(nèi)外關(guān)于PAs的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)目前尚缺乏茶葉中PAs的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，迫切需要制定與歐盟規(guī)定相符的21種PAs的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，并展開(kāi)茶葉PAs污染水平監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，為確保我國(guó)茶葉質(zhì)量安全，積極應(yīng)對(duì)歐盟貿(mào)易壁壘提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

關(guān)鍵詞：茶葉；吡咯里西啶生物堿；殘留；檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)：TS272.5；Q946.88" " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " "文章編號(hào)：1000－3150 （2024）03-12-9

Research Progress on Detection Methods and Current Status of Residual Pyrrolizidine Alkaloids in Tea

JIAO Yanna1， PENG Mengxiang1， LIANG Xiang1， MAO Xian1， XIAO Zhongning1， ZENG Liang2， LIU Zhonghua3*

1. Technology Center of Changsha Customs/Hunan Key Laboratory of Food Safety Science amp; Technology， Changsha 410004， China;

2. School of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China; 3. Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China

Abstract： This article reviewed the detection methods for the residual pyrrolizidine alkaloids （PAs） in tea， including colorimetric methods， capillary electrophoresis， immunological methods， chromatographic analysis， and discussed their current status and future trends. Additionally， it summarized the current research on PAs residues in tea both domestically and internationally， analyzed the toxic effects of PAs in tea， and examined the limit standards of existing PAs globally. Considering the lack of detection standards for PAs in Chinese tea， it is urgent to develop detection standards for at least 21 types of PAs， in accordance with the European Union regulations. Furthermore， research on monitoring the contamination levels of PAs in tea and conducting risk assessments is crucial. In order to ensure the quality and safety of tea in our country and actively respond to EU trade barriers， strong technical support was provided.

Keywords： tea， pyrrolizidine alkaloids， contamination， detection methods

植物通過(guò)次級(jí)代謝產(chǎn)生吡咯里西啶生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs），這些化合物具有防御作用。其中的不飽和PAs及很大一部分PAs的氮氧化物（PANOs）具有多種毒性，是常見(jiàn)的內(nèi)源性毒素，目前已在6 000余種植物中鑒定出600多種不同的PAs及PANOs，其中大概有120種具有肝毒性，一些PAs還有致癌、致突變和致畸胎的毒性，長(zhǎng)期過(guò)量攝入可導(dǎo)致肝癌^[1]。

PAs已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于茶葉、蜂蜜等多種食品中，由于攝入含PAs的草藥及食品引發(fā)中毒事件逐年遞增，其污染問(wèn)題成為日漸關(guān)注的食品安全問(wèn)題^[2]。目前，在奧地利、德國(guó)、比利時(shí)等許多歐洲國(guó)家已經(jīng)對(duì)茶葉中PAs或PANOs的污染源與污染途徑進(jìn)行了大量的研究，建立了較為完善的茶葉檢測(cè)與監(jiān)督體系。2023年，歐盟發(fā)布了（EU）2023/915法規(guī)，規(guī)定了茶葉中PAs含量限值為150 μg/kg，成為繼農(nóng)藥殘留之后的又一新型技術(shù)壁壘^[3]。根據(jù)歐洲對(duì)PAs的監(jiān)測(cè)，大多數(shù)茶葉及代用茶中均檢出1種或多種PAs，部分樣品殘留量超過(guò)了歐盟實(shí)施的限量標(biāo)準(zhǔn)。茶葉中PAs污染的主要來(lái)源可能是茶園中的雜草，這也是導(dǎo)致各國(guó)茶葉樣品中PAs污染水平、污染種類差異大的主要原因^[4]。目前，我國(guó)對(duì)茶葉中PAs污染來(lái)源與水平尚不清晰且我國(guó)茶葉中PAs的種類與歐洲國(guó)家關(guān)注的茶葉中PAs種類并不一致。這就需要對(duì)我國(guó)茶葉中的PAs種類進(jìn)行非靶向篩查與鑒定，并開(kāi)展健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為我國(guó)實(shí)施茶葉質(zhì)量安全管控提供數(shù)據(jù)支撐。

在PAs定量分析技術(shù)方面，高靈敏度和高選擇性的液相色譜和高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得到廣泛運(yùn)用，將成為今后PAs技術(shù)開(kāi)發(fā)的主要方向，但目前技術(shù)體系尚不成熟，特別是適用于茶葉中21種PAs/PANOs（表1）的檢測(cè)技術(shù)尚未得到充分研究，不能滿足輸歐茶葉中21種PAs的檢測(cè)需求。故進(jìn)行茶葉中PAs殘留水平的研究及建立茶葉中PAs的檢測(cè)技術(shù)顯得尤為重要。

1" PAs化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒性

PAs在結(jié)構(gòu)上由千里光次堿（Necine）和千里光次酸（Necic acid）兩個(gè)基本部分組成（圖1），其中千里光次堿的吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)為PA的母核。母核中的氮原子氧化形成相應(yīng)的PANOs與PAs同時(shí)存在于植物體內(nèi)，PAs的毒性高于PANOs，PANOs可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的PAs。根據(jù)母核1，2位碳原子之間形成的鍵是否飽和，可分為飽和PAs與不飽和PAs。飽和型PAs主要為闊葉千里光次堿（Platynecine），表現(xiàn)為無(wú)毒或毒性較弱；不飽和PAs根據(jù)千里光次堿基結(jié)構(gòu)差異，分為倒千里光堿型、天芥菜堿型、奧索千里光裂堿3種類型（圖2），由于其毒性和致病性，這些類型的PAs成為關(guān)注的熱點(diǎn)^[5]。

PAs的毒性與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，目前普遍認(rèn)為脫氫吡咯里西啶生物堿（Dehydropyrrolizidine alkaloids，DHPA）為PAs在體內(nèi)的主要致毒結(jié)構(gòu)，是經(jīng)細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）3A代謝脫氫生成^[6]。DHPA具有較強(qiáng)的親電子性，較易與胞內(nèi)親核類物質(zhì)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)）加合，形成加合物，造成肝細(xì)胞損傷及凋亡^[7]。PAs衍生的吡咯-蛋白加合物是引發(fā)肝毒性的主要因素。Ruan等^[8-9]根據(jù)吡咯-蛋白加合物的濃度來(lái)評(píng)估PAs的毒性程度，結(jié)果證明倒千里光堿型PAs的毒性大于奧索千里光裂堿型。同時(shí)根據(jù)產(chǎn)生的吡咯蛋白加合物數(shù)量，進(jìn)一步將倒千里光堿型PAs按毒性大小排序：開(kāi)環(huán)雙酯gt;12元閉環(huán)雙酯gt;11元閉環(huán)雙酯gt;開(kāi)環(huán)單酯。

2" PAs檢測(cè)分析

近年來(lái)，隨著科技進(jìn)步，茶葉中PAs檢測(cè)技術(shù)也在不斷發(fā)展和完善，逐步形成了從常量定性到痕量定量檢測(cè)的技術(shù)體系，主要包括比色法、毛細(xì)管電泳法、免疫學(xué)方法、色譜分析法。

2.1" 比色法

比色法是早期研究者用來(lái)測(cè)定植物中PAs的方法，檢測(cè)原理是基于顯色反應(yīng)，其中產(chǎn)生的絡(luò)合物具有特定的吸收波長(zhǎng)，通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。梁威等^[10]使用Ehrilich試劑與藥材中PAs衍生物進(jìn)行反應(yīng)，形成酒紅色物質(zhì)，在565 nm存在強(qiáng)吸收峰，該方法檢出限為1.02 mg/L；Birecka等^[11]使用甲基橙與離子化的PAs反應(yīng)形成黃色絡(luò)合物后，在525 nm處有吸收峰，方法所得檢出限為0.5 mg/L。比色分析實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，但僅適用于PAs總量的檢測(cè)，存在選擇性低、靈敏度低、檢出限高等缺陷，難以滿足痕量分析條件和要求。

2.2" 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法（CE）是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)植物樣品中各組分間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)PAs分離和測(cè)定的方法。朱雷等用動(dòng)態(tài)pH連接掃描毛細(xì)管電泳法測(cè)定了中草藥款冬中4種有毒的PAs，檢出限可達(dá)0.03 mg/L。該方法也是早期研究者建立的方法，無(wú)法滿足痕量檢測(cè)分析需求。

2.3" 免疫學(xué)方法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是基于抗原抗體的免疫檢測(cè)方法，具有高選擇性、高特異性、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于對(duì)PAs的快速定性。采用ELISA結(jié)合特異性抗原可以針對(duì)某個(gè)特定PAs進(jìn)行分析檢測(cè)，如Sakamoto等^[13]通過(guò)將野百合堿的水解產(chǎn)物惹卓裂堿與牛血清白蛋白的連續(xù)賴氨酸殘基偶聯(lián)，制備了對(duì)野百合堿具有高特異性的單克隆抗體（MAb 4B8），使用ELISA檢測(cè)的低限可達(dá)48.8 pg/mL。該方法中單克隆抗體制備步驟較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)且不具有普適性，因此免疫學(xué)分析方法主要用于PAs的毒理學(xué)研究。

2.4" 色譜分析法

有學(xué)者統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，80%的PAs相關(guān)研究文獻(xiàn)采用了色譜分析方法^[14]，主要包括高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）。因?yàn)檫@些方法的樣品制備相對(duì)簡(jiǎn)單，且可以測(cè)量各種物化特性的物質(zhì)，具有靈敏度高、穩(wěn)定性高、分離度高的優(yōu)點(diǎn)，這些都是食品安全控制方案中必需的特性。

GC-MS聯(lián)用技術(shù)，可用于除了奧索千里光裂堿外大多數(shù)PAs的檢測(cè)^[15-16]。但由于PANOs在揮發(fā)溫度下不太穩(wěn)定，因此不能直接進(jìn)行分析，需要通過(guò)化學(xué)衍化如使用Zn⁺/H⁺將PANOs還原為游離PAs進(jìn)行檢測(cè)，該方法被稱為求和參數(shù)法，最早由Kempf等提出。求和參數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)在于漏檢率低，在無(wú)需所有對(duì)照品的情況下就能更準(zhǔn)確地反映出被分析產(chǎn)品的污染程度。但是衍生化過(guò)程耗時(shí)繁瑣，不符合現(xiàn)代高通量檢測(cè)需求。近年來(lái)，研究人員通過(guò)改進(jìn)前處理技術(shù)努力提高PAs的檢測(cè)效率，如Kowalczyk等^[17]使用七氟丁酸酐（Heptafluorobutyric anhydride，HFBA）進(jìn)行衍生，70 ℃下30 min即可完成反應(yīng)。

LC-MS聯(lián)用技術(shù)可以彌補(bǔ)GC-MS在處理熱不穩(wěn)定物質(zhì)方面的缺陷。無(wú)需進(jìn)行衍生化處理，可直接用于檢測(cè)，成為當(dāng)前PAs最主流的檢測(cè)分析方法。PAs屬于極性化合物，色譜柱固定相通常選擇反相色譜柱，使用的質(zhì)量檢測(cè)器主要為三重四極桿（TQ-MS），表2列舉了茶飲基質(zhì)中PAs/PANOsLC-MS分析的主要條件。

LC-MS聯(lián)用技術(shù)也存在一定的不足，比如基質(zhì)干擾、色譜峰分離度差、分析物的共洗脫現(xiàn)象等。Kaltner等^[18]觀察到異構(gòu)體基團(tuán)的峰是不可分離的，大部分被共洗脫下來(lái)。Marianna等^[24]建立的茶葉中20種PAs的LC-MS/MS方法中，有13種化合物與1個(gè)或多個(gè)同分異構(gòu)體在色譜中共流出，因此不能完全準(zhǔn)確定量。因此Urban等^[25]和Van de Schans等^[26]分別提出了以2D-HPLC和2D-HPLC-MS/MS的方法來(lái)解決這一問(wèn)題，二維技術(shù)的使用可以顯著提高分離度和分辨率，對(duì)于PAs的檢出限低至0.7 μg/kg。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)通常只能檢測(cè)設(shè)定的MS/MS目標(biāo)，對(duì)于市場(chǎng)上無(wú)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的PAs/PANOs，還存在較大的遺漏性和不確定性。為了解決這一問(wèn)題，高分辨質(zhì)譜（HRMS）由于其精準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)測(cè)定優(yōu)勢(shì)，逐漸應(yīng)用到MS中形成新的檢測(cè)方法。LC和HRMS聯(lián)用，可以全面獲取樣品中未知PAs的精確相對(duì)分子質(zhì)量和碎片離子信息，可鑒定未知PAs的結(jié)構(gòu)，區(qū)分同分異構(gòu)體，是對(duì)多種PAs篩選鑒定和痕量分析的有效手段。Rizzo等^[27-28]建立了一種基于UHPLC-HRMS/MS方法的分析平臺(tái)，可高通量靶向篩選和鑒定復(fù)雜食物基質(zhì)中的118種PAs。超高效液相色譜-四極桿/軌道阱質(zhì)譜（UPLC-Q Exactive-MS）與超高效液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）是用于復(fù)雜樣品中的生物堿結(jié)構(gòu)解析和確證分析的主要技術(shù)。Zhang等^[29]建立的超高效液相色譜-四極桿-軌道質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q-Orbitrap/MS）方法，利用基于特征破碎模式和千里光次堿母核結(jié)構(gòu)建立大量的MS-dd-MS2全掃描數(shù)據(jù)，可在無(wú)對(duì)照品情況下鑒定野百合中PAs。Nuria等^[30]建立的LC-Q-Orbitrap HRMS分析方法可同時(shí)分析干茶和中草藥中30種PAs，定量限為5 μg/kg，準(zhǔn)確度可達(dá)87%～111%。Jeong等^[31]建立了可快速準(zhǔn)確測(cè)定琉璃苣、款冬堯、紫草、聚合草9種PAs的UPLC-ESI-Q-TOF-MS法，檢出限為0.4～2.0 ng/mL，定量限為0.6～6.0 ng/mL。許秀麗等^[32]利用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS），在正離子模式下采用全掃描-數(shù)據(jù)非依賴性采集（Full scan/data independent acquisition，F(xiàn)ull MS/DIA）模式，可定量分析茶葉中15種PAs。Martinello等^[33]研究發(fā)現(xiàn)混合四極桿軌道阱高分辨質(zhì)譜比Q-TOF-MS和TOF-MS分辨值更高。

目前，我國(guó)對(duì)歐盟21種PAs還未建立一套成熟的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。萬(wàn)靜宜等^[34]建立的茶葉中21種PAs檢測(cè)方法，雖然可同時(shí)實(shí)現(xiàn)歐盟規(guī)定的21種PAs的檢測(cè)，但該方法前處理耗時(shí)較長(zhǎng)，需要靜置過(guò)夜。因此需進(jìn)一步優(yōu)化前處理?xiàng)l件，如比較QuEChERS方法和固相萃取小柱法對(duì)PAs化合物的提取和凈化效果，建立快速高效的前處理技術(shù)；優(yōu)化色譜條件使各組分得到有效分離，考察色譜柱種類（必要時(shí)采用5-F苯基柱、雙苯基柱等對(duì)同分異構(gòu)體分離度更高的色譜柱）、流動(dòng)相組成等條件對(duì)分離效果的影響；優(yōu)化質(zhì)譜條件改善目標(biāo)組分的質(zhì)譜響應(yīng)，考察噴霧電壓和毛細(xì)管溫度等參數(shù)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)的影響。

3" 國(guó)內(nèi)外茶葉中PAs殘留研究現(xiàn)狀

3.1" 國(guó)內(nèi)茶葉中PAs殘留研究狀況

PAs是茶葉中的新型污染物，其來(lái)源尚未完全明確。Han等^[35]對(duì)370個(gè)茶葉（包括紅茶、綠茶、黑茶）、15個(gè)菊花及189個(gè)當(dāng)?shù)夭鑸@的雜草樣品進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，15.51%的茶葉樣品中檢測(cè)到1種或多種PAs，含量最高為151.33 μg/kg；20.63%的雜草樣品檢測(cè)到PAs，含量最高達(dá)到5 017.06 μg/kg。該研究分析認(rèn)為，雜草很可能是茶葉中PAs的污染來(lái)源。Jiao等^[36]的研究同樣證實(shí)了茶葉中的PAs可能來(lái)自茶園中的雜草。通過(guò)對(duì)雜草、茶葉和土壤這3種基質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)從雜草中檢測(cè)到了13種PAs，而茶葉和土壤中分別只檢測(cè)到了3種和4種。黃旦益等^[37]分析茶葉中PAs來(lái)源，發(fā)現(xiàn)我國(guó)茶園的主要雜草中含有 PAs 植物，如 一點(diǎn)紅、勝紅薊、千里光、豬屎豆等。茶葉 PAs 污染風(fēng)險(xiǎn)主要來(lái)自于茶園雜草， 人工采摘加工的茶葉不存在 PAs 污染。Nikola等^[38]研究了PAs在不同茶園土壤中的吸附和解吸行為，PAs的吸附和解吸行為受到多種因素的影響，包括化合物的疏水性和土壤的特性。研究發(fā)現(xiàn)PAs在茶園土壤中具有高度流動(dòng)性，這凸顯了采取有效管理策略的必要性，以盡量減少它們從土壤到茶樹的轉(zhuǎn)移。

由于我國(guó)對(duì)PAs的研究起步較晚，因此對(duì)茶葉中PAs的暴露水平研究非常有限。許秀麗等^[32]對(duì)20例市售茶葉樣品中PAs進(jìn)行了研究，其中只有1例樣品中檢出千里光堿，其余樣品PAs含量都沒(méi)有超過(guò)方法檢測(cè)低限。朱雷^[39]通過(guò)對(duì)安徽省六大茶葉主產(chǎn)區(qū)茶園體系中PAs的測(cè)定分析，88份綠茶樣品有59份檢出PAs，檢出率為67.05%，共檢出10種PAs，總PAs含量最高的是主產(chǎn)區(qū)5的12號(hào)綠茶樣品，為90.50 μg/kg。37份雜草樣品有35份檢出PAs，檢出率為94.59%，15種PAs均有檢出，總PAs含量最高的是主產(chǎn)區(qū)4的藿香薊，為74 707.75 μg/kg。采用暴露限值法對(duì)茶葉中PAs污染進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，茶葉中PAs的不同分位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的MOE值均大于10 000，說(shuō)明安徽省茶葉污染風(fēng)險(xiǎn)較低。夏珍珍等^[40]研究了湖北省茶葉中PAs污染概況，同時(shí)對(duì)其健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估，對(duì)湖北省主要的茶葉及茶園中的雜草進(jìn)行了15種PAs的檢測(cè)，對(duì)不同茶類、不同季節(jié)中的污染情況進(jìn)行對(duì)比分析，并對(duì)茶園雜草種類及其PAs含量進(jìn)行研究分析，確定茶葉中PAs的可能來(lái)源。結(jié)果顯示，雜草和茶葉中PAs的檢出率分別為79.2%和20.2%，PAs總含量分別為1.86×10⁴～2.67×10⁴ μg/kg和1.15～34.45 μg/kg。根據(jù)茶類分，PAs的檢出率從低到高依次為綠茶、黑茶、紅茶；對(duì)5個(gè)茶葉主產(chǎn)區(qū)的PAs檢出率進(jìn)行比較，大悟最低（恩施和英山地區(qū)的茶葉未檢出PAs）、咸寧次之、宜昌最高；對(duì)不同季節(jié)茶葉的PAs檢出率進(jìn)行比較，由低到高排序?yàn)榍锊?、春茶、夏茶。?duì)18種茶園雜草進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自野茼蒿和烏蘞莓中的千里光堿-N-氧化物（JbNO）和倒千里光堿-N-氧化物（ReNO）含量較高；通過(guò)暴露邊際（Margin of exposure，MOE）法，對(duì)湖北省茶葉的健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，湖北省茶葉中的PAs健康風(fēng)險(xiǎn)較低。不同類型茶葉中PA/PANO的污染水平和形態(tài)差異顯著。紅茶的PA/PANO污染比綠茶更嚴(yán)重，這種現(xiàn)象可以歸因于茶葉生產(chǎn)過(guò)程中PA/PANO的各種污染源和消散模式。Han等^[41]研究了茶加工和沖泡過(guò)程中PAs/PANOs的耗散模式和轉(zhuǎn)化行為。與Pas的加工因子（PF）在0.73～1.15之間相比，PANOs在制茶過(guò)程中具有更高的降解率，PF在0.21～0.56之間，其中干燥在PANOs降解中起最重要的作用。此外，在泡茶過(guò)程中，PANO的傳輸率（≥75.84%）比PAs（≤56.53%）更高。

3.2" 國(guó)外茶葉中PAs殘留研究狀況

目前，對(duì)茶葉中PAs的污染來(lái)源及水平研究較為系統(tǒng)的國(guó)家有奧地利、德國(guó)、意大利等歐洲國(guó)家。Martins等^[42]通過(guò)對(duì)茶葉、蜂蜜和牛奶等樣品中PAs含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示茶葉樣品中PAs的最大含量為215 μg/kg。德國(guó)聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所檢測(cè)了茶葉、花草茶、藥茶中的PAs，結(jié)果表明部分茶葉、花草茶產(chǎn)品中的PAs含量比較高^[43]，這一結(jié)果引起了各國(guó)政府及研究人員的廣泛關(guān)注。2023年5月，歐盟正式規(guī)定了茶葉和代用茶中PAs的含量不得超過(guò)150 μg/kg^[44]，此限量要求是對(duì)21種吡咯里西啶類生物堿的總和進(jìn)行計(jì)算，但沒(méi)有公布對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法。Bodi等^[45]對(duì)德國(guó)市場(chǎng)上6個(gè)茶類及花草茶共274種樣品中的PAs含量進(jìn)行了分析，其中污染最為嚴(yán)重的為博士茶，其PAs平均含量為1 856.4 μg/kg，最高含量達(dá)到5 647.2 μg/kg，通過(guò)鑒定認(rèn)為茶園中的雜草PAs植物千里光可能是博士茶PAs的污染源。Marianna^[24]監(jiān)測(cè)了2019年3月至2020年9月在意大利出售的33份茶及花草茶樣品中的20種PAs，其中三分之一的樣品檢出PAs，平均含量為64 μg/kg；最大含量為311 μg/kg；1份馬郁蘭、薄荷、鼠尾草和茴香種子的混合花草茶中PAs含量超過(guò)了歐盟規(guī)定的PAs最大限量。

4" 茶葉中PAs健康風(fēng)險(xiǎn)

4.1" 茶葉中PAs的毒性作用

茶葉中PAs及其N-氧化物具有肝毒性、肺毒性、腎臟毒性、致癌性、發(fā)育毒性等一系列毒性作用。其中，肝臟作為哺乳動(dòng)物最大的解毒器官，是PA和PA N-氧化物的主要靶器官，長(zhǎng)期攝入PAs可誘導(dǎo)引發(fā)肝竇阻塞綜合征（HSOS），臨床癥狀表現(xiàn)為肝臟充血和腫脹、肝血管阻塞竇內(nèi)皮細(xì)胞脫離及導(dǎo)致肝功能不全。歐盟規(guī)定限量的促黑激素、石松胺、倒千里光堿、天芥菜堿、千里光非靈堿、千里光堿、克氏千里光寧堿均有肝毒性作用^[46-47]，克氏千里光寧堿、毛果天芥菜堿具有致突變毒性^[48]。

不同種類的PAs在肝毒性上表現(xiàn)出不同的強(qiáng)度，Wang等^[49]發(fā)現(xiàn)千里光堿（倒千里光堿型）、藍(lán)薊定（倒千里光堿型）、天芥菜堿（天芥菜堿型）和克氏千里光寧堿（奧索千里光裂堿型）對(duì)HepaRG細(xì)胞均表現(xiàn)出毒性作用，毒性大小表現(xiàn)為：千里光堿gt;藍(lán)薊定/天芥菜堿gt;克氏千里光寧堿。

一種PAs還可表現(xiàn)出多種毒理特性。Benamar等^[50]報(bào)道，藍(lán)薊定抑制了乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，半數(shù)最大抑制濃度（IC₅₀）為（0.397±0.006） mmol/L。另有研究表明，接觸藍(lán)薊定導(dǎo)致肝細(xì)胞存活抑制，IC₅₀值為13.79 μg/mL^[51]，單次暴露24 h后，可誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞凋亡^[52]。Lin等^[53]報(bào)道，斑馬魚胚胎接觸到藍(lán)薊定會(huì)導(dǎo)致發(fā)育毒性，具體表現(xiàn)為延遲孵化和體長(zhǎng)縮短。

PAs還具有聯(lián)合毒性作用，研究發(fā)現(xiàn)混合PAs的肝細(xì)胞毒性大于任何單一PA的肝細(xì)胞毒性。Wang等^[5]發(fā)現(xiàn)促黑激素、促黑激素氮氧化物、石松胺、石松胺氮氧化物、倒千里光堿、倒千里光堿氮氧化物、千里光寧堿和千里光寧堿氮氧化物混合物在低含量（5 μg/mL）下即可對(duì)Hep D細(xì)胞活力產(chǎn)生顯著抑制作用，而促黑激素單一作用時(shí)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)100 μg/mL時(shí)才可以誘導(dǎo)Hep D細(xì)胞凋亡。

4.2" PAs的限量標(biāo)準(zhǔn)

PAs廣泛存在于日常食品中，長(zhǎng)期膳食暴露低劑量PAs伴隨慢性肝損傷風(fēng)險(xiǎn)，已被世界衛(wèi)生組織列為二類致癌物。鑒于PAs對(duì)人體健康具有潛在危險(xiǎn)性，食品中PAs的安全性已經(jīng)成為許多國(guó)家和國(guó)際組織監(jiān)管部門關(guān)注的焦點(diǎn)，訂立了食品中PAs最大允許量或每日攝入量。《IPCS健康與安全指南第26號(hào)：吡咯里西啶類生物堿的健康和安全指南》于1989年由世界衛(wèi)生組織（WTO）頒布，其建議PAs的攝入量每日不大于15 μg/kg。2011年，歐盟建議不飽和PAs的日攝入量不超過(guò)0.007 μg/kg。2016年，歐洲食品安全局發(fā)布的PAs膳食暴露的評(píng)估報(bào)告中指出，歐洲人攝入PAs的主要來(lái)源是草藥和茶^[54]。在對(duì)食品中PAs含量及其對(duì)消費(fèi)者健康潛在風(fēng)險(xiǎn)的大量研究之后，歐盟委員會(huì)發(fā)布了法規(guī)（EU）2023/915，于2023年5月實(shí)施，該法規(guī)規(guī)定了茶葉中PAs的最大殘留限量為150 μg/kg，該限量為21種PAs的總和。目前我國(guó)尚未對(duì)食品中PAs含量作出明確的規(guī)定，僅在《中國(guó)藥典》2020年版“千里光”項(xiàng)中對(duì)阿多尼弗林堿的含量作出了規(guī)定，要求每克藥材中含量不超過(guò)40 μg^[55]。

5" 結(jié)語(yǔ)

PAs廣泛存在于食品中，PA及其氧化物具備多種毒性作用，其毒性大小與結(jié)構(gòu)相關(guān)。當(dāng)前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用廣泛，也是痕量分析茶葉中PAs的主要手段，而液相和高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可應(yīng)用于有效篩查和鑒定茶葉中未知PAs。長(zhǎng)期低劑量暴露PAs將嚴(yán)重危及人體健康，為此，歐盟規(guī)定了茶葉中PAs的最大殘留限量，對(duì)我國(guó)茶葉出口造成重大影響。目前我國(guó)缺乏茶葉中PAs的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，因此建議制定茶葉中PAs相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，建立一套茶葉中不少于歐盟規(guī)定的21種PAs測(cè)定的LC-MS/MS檢測(cè)方法及茶葉中PAs篩查與鑒定的LC-HRMS方法，篩查與鑒定我國(guó)茶葉中的未知PAs，同時(shí)對(duì)我國(guó)出口歐盟的茶葉及進(jìn)口茶葉進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)其污染特征、含量水平進(jìn)行本底調(diào)查，開(kāi)展?jié)撛诘馁|(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為確保我國(guó)茶葉質(zhì)量安全、積極應(yīng)對(duì)歐盟貿(mào)易壁壘提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

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作者簡(jiǎn)介：焦艷娜，女，高級(jí)工程師，主要從事茶葉質(zhì)量安全研究。*通信作者，E-mail：zhonghua-liu@hunau.edu