CH25H 調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡對喉鱗狀細(xì)胞癌進展影響

熊華才 許雨欣 鄔振華 胡丹飛 李群 項振飛

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是最常見的類型，約占90%[1]。喉部主要生理功能是吞咽、呼吸和發(fā)音，喉癌主要通過手術(shù)切除、聯(lián)合術(shù)前或術(shù)后化療、放療等綜合治療方式治療。雖然目前臨床已對喉癌的治療做了大量研究，但喉癌發(fā)病率和死亡率依舊較高。在癌癥發(fā)展過程中癌細(xì)胞存在自噬和凋亡現(xiàn)象[2]。細(xì)胞凋亡是一種阻止癌細(xì)胞存活的程序性細(xì)胞死亡途徑，而自噬通過清除受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)以及限制細(xì)胞生長，從而抑制惡性腫瘤發(fā)展，凋亡和自噬是常見的腫瘤抑制機制[3]。

膽固醇25-羥化酶（cholesterol 25-hydroxylase，CH25H）是一種催化膽固醇氧化形成可溶性產(chǎn)物25-羥基膽固醇（25-hydroxycholesterol，25-HC）的酶，參與脂質(zhì)代謝。也有研究表明，CH25H 在炎癥和免疫應(yīng)答中發(fā)揮多種功能[4]。CH25H 在黑色素細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和膽管癌等惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。在黑色素細(xì)胞瘤患者的外周血WBC 中觀察到CH25H 丟失，這與轉(zhuǎn)移和低生存率相關(guān)[5]。但CH25H 在LSCC 中的表達(dá)模式、腫瘤相關(guān)作用及分子機制目前尚不清楚。本研究旨在探討CH25H 在LSCC中的生物學(xué)作用和調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF 級4 周齡的BALB/c 雄性裸鼠24 只，體重20～25 g，購自杭州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心[動物許可證號：SYXK（浙）2019-0011]，普通飼料喂養(yǎng)。本動物實驗方案經(jīng)浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)文號：ZJCLA-IACUC-20040153）。人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞（HOK）以及人LSCC 細(xì)胞系TU-177、AMC-HN-8 購自上海雅吉生物科技公司，F(xiàn)DLSC-1 購自南京萬木春生物科技公司，過表達(dá)慢病毒購自上海吉瑪基因生物科技公司，Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（批號：C11995500BT，規(guī)格：500 mL）和FBS（批號：10091148，規(guī)格：500 mL）均購自美國Gibco 公司，RIPA裂解液（批號：20-188，規(guī)格：100 mL）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（批號：C3117，規(guī)格：0.45 μm）購自美國Millipore 公司，二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）試劑盒（批號：P0010S，規(guī)格：200次）、Trizol 試劑盒（批號：R0016，規(guī)格：100 mL）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）預(yù)制膠（批號：PG42015-S，規(guī)格：10塊）購自北京索萊寶生物科技公司，實時熒光定量PCR 試劑盒（批號：RR820A，規(guī)格：200 次）購自日本TaKaRa 公司，蛋白抗體CH25H（批號：sc-293256，規(guī)格：100 μL）購自上海玉博生物科技有限公司，B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）（批號：3498T，規(guī)格：20 μL）、Bcl-2 關(guān)聯(lián)X 蛋白（Bax）（批號：2772T，規(guī)格：20 μL）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）（批號：9662S，規(guī)格：100 μL）、裂解的caspase-3（C-caspase-3）（批號：9664T，規(guī)格：20 μL）、β 肌動蛋白（β-actin）（批號：4970T，規(guī)格：20 μL）、微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3（LC3）Ⅰ、LC3Ⅱ（批號：3868T，規(guī)格：20 μL），Beclin-1（批號：3738S，規(guī)格：100 μL）、p62（批號：5114T，規(guī)格：20 μL）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）（批號：9271T，規(guī)格：20 μL）、磷酸化Akt（p-Akt）（批號：4060T，規(guī)格：20 μL）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）（批號：4292S，規(guī)格：100 μL）和磷酸化PI3K（p-PI3K）（批號：4228T，規(guī)格：20 μL）均購自美國CST 公司，聚凝胺（批號：BL628A，規(guī)格：500 μL）購自中國蘭杰柯科技有限公司；自動細(xì)胞計數(shù)儀（型號：TC10）購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)HOK、FD-LSC-1、TU177、AMC-HN-8 細(xì)胞，細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。通過5 μg/mL 聚凝胺介導(dǎo)慢病毒轉(zhuǎn)染LSCC 細(xì)胞株并用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)CH25H 的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株AMC-HN-8/CH25H。慢病毒空白載體AMC-HN-8/Mock 作為對照，未做轉(zhuǎn)染處理為AMC-HN-8。使用自動細(xì)胞計數(shù)儀進行細(xì)胞計數(shù)。

1.3 LSCC 移植瘤動物模型的構(gòu)建和觀察 采用隨機數(shù)字表法將裸鼠分為AMC-HN-8 組、AMC-HN-8/Mock 組、AMC-HN-8/CH25H 組，每組8 只。取AMCHN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H 組對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，重新細(xì)胞計數(shù)，使細(xì)胞懸浮液濃度調(diào)整至2.0×107個/mL，各取0.5 mL 細(xì)胞懸浮液依次接種于3 組裸鼠右側(cè)腋下，每天檢查裸鼠瘤體生長情況，瘤體長出為造模成功。每隔1 周用游標(biāo)卡尺測量裸鼠右側(cè)腋下原位腫瘤的長徑（L）與短徑（W），計算原位腫瘤的近似體積（V），V=0.5×（L×W2）。接種5 周后，斷頸處死裸鼠切取原位腫瘤，測定重量并切取部分腫瘤用于后續(xù)實驗。

1.4 CH25H mRNA 表達(dá)水平檢測 采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35 個循環(huán)。引物序列如下，CH25H-F：5'- GGCATACCAAGTGTC-CTTCTAAGC-3'；CH25H-R: 5'-AACACCCTACACCCAGATTCCTC-3'；βactin-F：5'-CAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAG-3'；βactin- R：5'- CGCAACTAAGTCATAGTCCGCCTAG- 3'。以β-actin 為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算CH25H mRNA 相對表達(dá)水平。

1.5 CH25H、Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot 法。RIPA 裂解液提取AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H組LSCC 細(xì)胞和裸鼠瘤體組織總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。取40 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶（TBST 溶解）37 ℃封閉1 h。將PVDF 膜置于CH25H、Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和β-actin 一抗溶液（1∶2 000）4 ℃過夜，PBST 洗膜（6×5 min）；將膜置于辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗溶液（1∶5 000）中37 ℃孵育1.5 h，PBST 洗膜（6×5 min）后，化學(xué)發(fā)光顯色劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，結(jié)果以相對灰度值表示。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。收集AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H組轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后的LSCC 細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書使用Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒分析細(xì)胞凋亡，1 000×g 離心后棄上清液，加入195 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 染色液，避光孵育15 min后上機檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞自噬檢測 采用免疫熒光法。將AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H 組LSCC 細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，然后用0.1%Triton X-100 4 ℃滲透細(xì)胞10 min。用含有2%FBS 白蛋白的PBS 在室溫下飽和1 h 后，用LC3Ⅱ一抗抗體進行免疫熒光處理，然后用Alexa Fluor 488 偶聯(lián)免疫球蛋白和DAPI 進行免疫熒光處理。采用Olympus Fluoview 1000共聚焦顯微鏡觀察自噬蛋白LC3Ⅱ熒光染色情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOK 與LSCC 細(xì)胞CH25H mRNA 的相對表達(dá)水平比較 相較HOK 正常細(xì)胞，F(xiàn)D-LSC-1、TU177、AMC-HN-8 3 種LSCC 細(xì)胞中CH25H 相對表達(dá)水平均明顯下調(diào)（均P＜0.05），其中AMC-HN-8 水平最低，見圖1，選取其進行后續(xù)實驗。

圖1 HOK 和LSCC 細(xì)胞系（FD-LSC-1、TU177、AMC-HN-8）中CH25H 表達(dá)水平的比較

2.2 CH25H 對喉鱗癌AMC-HN-8 細(xì)胞凋亡率和凋亡蛋白的影響 AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組CH25H表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），AMC-HN-8/CH25H組CH25H表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖2A、B。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。AMC-HN-8/CH25H組24、48、72 h 的細(xì)胞凋亡率均明顯高于AMC-HN-8/Mock 組（P＜0.05），見圖2C。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock組Bax、Bcl-2 和C-caspase-3 蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與AMC-HN-8/Mock 組比較，AMC-HN-8/CH25H組Bax、C-caspase-3蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（均P＜0.05），Bcl-2 蛋白明顯下調(diào)（P＜0.05），見圖2D、2E。

圖2 CH25H 促進喉鱗癌AMC-HN-8 細(xì)胞凋亡（A：CH25H 表達(dá)的電泳圖；B：3 組細(xì)胞CH25H 的表達(dá)水平；C：3 組細(xì)胞不同時點凋亡率的比較；D：Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3 蛋白表達(dá)的電泳圖；E：Bax、Bcl-2、C-caspase-3、caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較）

2.3 CH25H 對AMC-HN-8 細(xì)胞自噬蛋白的影響AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組LC3Ⅱ、Beclin-1 和p62 蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。相較AMC-HN-8/Mock 組，AMC-HN-8/CH25H 組LC3Ⅱ和Beclin-1 表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05），p62 明顯下調(diào)（P＜0.05），見圖3A（插頁）。免疫熒光結(jié)果顯示，與AMC-HN-8/Mock 組比較，AMC-HN-8/CH25H 組LC3Ⅱ標(biāo)記的自噬小體數(shù)量增加，見圖3B（插頁）。

圖3 過表達(dá)CH25H 促進喉鱗癌AMC-HN-8 細(xì)胞自噬（A：CH25H 對LSCC 細(xì)胞自噬蛋白影響的電泳圖及表達(dá)水平比較；B：3 組細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)的染色結(jié)果，免疫熒光染色×400）

2.4 CH25H 對AMC-HN-8 細(xì)胞PI3K/Akt 信號通路蛋白的影響 Western blot 檢測p-PI3K、PI3K、p-Akt 和Akt 信號通路蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。與AMC-HN-8/Mock組比較，AMC-HN-8/CH25H 組p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平下調(diào)，見圖4。

圖4 3 組細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較

2.5 CH25H 對裸鼠移植瘤體積和重量的影響 接種AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H細(xì)胞后第5 周處死裸鼠切取的移植瘤見圖5A（插頁）。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組裸鼠移植瘤CH25H 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，AMC-HN-8/CH25H 組CH25H 表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖5B（插頁）。AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 裸鼠瘤體體積、重量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而與AMC-HN-8/Mock 組比較，AMC-HN-8/CH25H 組裸鼠瘤體體積和重量顯著減?。ň鵓＜0.05），過表達(dá)CH25H 裸鼠移植瘤生長速度顯著減緩（P＜0.05），見圖5C、D（插頁）。

圖5 CH25H 影響喉鱗癌細(xì)胞體內(nèi)生長（A：第5 周移植瘤裸鼠及移植瘤裸鼠右側(cè)腋下原位移植瘤；B：CH25H 在AMC-HN-8、AMC-HN-8/Mock 和AMC-HN-8/CH25H 移植瘤中的表達(dá)水平；C：裸鼠移植瘤體積的變化；D：第5 周裸鼠移植瘤重量的比較）

2.6 CH25H 對裸鼠移植瘤細(xì)胞自噬蛋白、凋亡蛋白和PI3K/Akt 信號通路蛋白的影響 AMC-HN-8 和AMCHN-8/Mock 組Bax、Bcl-2、C-caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1、p62 蛋白表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。與AMC-HN-8/CH25H 組比較，AMC-HN-8/Mock 組Bax、C-caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin-1 表達(dá)上調(diào)，Bcl-2、p62 表達(dá)下調(diào)，見圖6A、B、D、E。同時檢測PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，AMC-HN-8 和AMC-HN-8/Mock 組p-PI3K 和p-Akt蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。與AMC-HN-8/Mock組比較，AMC-HN-8/CH25H 組p-PI3K 和p-Akt 表達(dá)水平下調(diào)，見圖6C、F。

圖6 CH25H 通過抑制PI3K/Akt 信號通路調(diào)控喉鱗癌細(xì)胞自噬和凋亡（A、D：凋亡蛋白表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較；B、E：自噬蛋白表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較；C、F：PI3K/Akt 信號通路蛋白表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較）

3 討論

研究報道CH25H 通過25-HC 可在不同的生物過程中發(fā)揮重要作用，對25-HC 的相關(guān)研究已確定25-HC 具有抗病毒和抗炎作用[4]。此外，CH25H 可以抑制細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的胞吞作用，促進細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞活性，即促進抗腫瘤免疫反應(yīng)，進而抑制腫瘤生長[6]。CH25H 可以作為乳腺癌患者預(yù)測因子[7]。甲基化異?；駽H25H 和其他3 個基因可以作為肺鱗癌預(yù)后風(fēng)險模型預(yù)測患者的預(yù)后[8]。而本研究發(fā)現(xiàn)CH25H 可以平衡腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡。

細(xì)胞凋亡通過清除病變細(xì)胞來維持組織穩(wěn)態(tài)，促進細(xì)胞凋亡可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤的重要手段。癌細(xì)胞表現(xiàn)出對凋亡的抵抗，以維持其不受控制的增殖。具有調(diào)節(jié)凋亡活性的分子都有可能成為一種潛在的抗癌靶標(biāo)[9]。Bcl-2 具有抗凋亡作用，Bax 誘導(dǎo)凋亡，C-caspase-3 的激活則被視為凋亡細(xì)胞死亡的標(biāo)志[10-11]。本研究中CH25H 上調(diào)后抑制了LSCC 細(xì)胞中Bcl-2 表達(dá)，同時促進了Bax 和C-caspase-3 表達(dá)，促進了腫瘤細(xì)胞凋亡。

自噬是真核細(xì)胞中一種保守的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，其生理功能是清除衰老細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)受損蛋白，維持饑餓時氨基酸庫的穩(wěn)定。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，自噬激活有助于清除腫瘤細(xì)胞[12]。然而，有研究表明自噬也會維持腫瘤細(xì)胞的生存，說明自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著抑制和促進的雙重作用，但本研究中CH25H 的表達(dá)在清除LSCC細(xì)胞中發(fā)揮著促進自噬的作用。自噬的特征包括誘導(dǎo)、成核、延伸、成熟和破壞等多個動態(tài)過程。其中，延伸對于完全自噬體的形成至關(guān)重要，而從LC3Ⅰ到LC3Ⅱ是延伸過程中的重要轉(zhuǎn)變，LC3Ⅱ和Beclin-1 是自噬通量的標(biāo)志，分別參與自噬囊泡的起始和關(guān)閉。此外，當(dāng)自噬被激活時，自噬底物p62 會被下調(diào)[13]。本研究中CH25H 上調(diào)后抑制了LSCC 細(xì)胞中p62 表達(dá)，同時促進了LC3Ⅱ和Beclin-1 表達(dá)。

PI3K/Akt 通路是一種主要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、自噬、凋亡、代謝和血管生成[14-15]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路在自噬和凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，抑制mTOR 通路可增強自噬體的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和死亡。一些抗癌藥物通過抑制PI3K/Akt 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。還有證據(jù)表明，自噬和凋亡之間的相互作用是通過PI3K/Akt 信號通路[16]。在腫瘤發(fā)生過程中PI3K/Akt 通路經(jīng)常過度激活[17]，這與本研究結(jié)果一致，在LSCC 細(xì)胞中PI3K/Akt 通路被過渡激活，CH25H 通過抑制PI3K/Akt 信號通路進而影響細(xì)胞自噬和凋亡。

綜上所述，本研究探討了CH25H 在LSCC 細(xì)胞自噬和凋亡發(fā)揮的作用，發(fā)現(xiàn)CH25H 可通過PI3K/Akt通路調(diào)控LSCC 細(xì)胞凋亡和自噬進而影響LSCC 進展，這可能為LSCC 相關(guān)治療提供極有前景的分子靶點。