雞IL-15基因的克隆及序列分析

張 鳳,田艷花,牛四坤,臺(tái)晶杰,劉文娟

山西藥科職業(yè)學(xué)院,山西 太原 030031

0 引言

細(xì)胞因子是由細(xì)胞分泌的一類具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和免疫活性的蛋白質(zhì)。其是由免疫細(xì)胞(單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等)和某些非免疫細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等)經(jīng)刺激而合成并分泌的一類生物活性分子,它們介導(dǎo)免疫細(xì)胞之間的信息交換與相互調(diào)節(jié),參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過(guò)程[1]。自1957年發(fā)現(xiàn)干擾素以來(lái),已有200余種細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞因子種類很多,命名方法也不盡統(tǒng)一。白細(xì)胞介素(interleukin,IL)是由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及其他細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。

1994年,Grabstein et al.[2]從猿猴腎上皮細(xì)胞系成功分離出IL-15,并把其描述為一個(gè)具有類似IL-2生物活性的新的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子;Burton et al.以及Davies et al.[3-4]刺激人T淋巴細(xì)胞白血病病毒-1嵌著的白血病細(xì)胞系分泌出IL-T細(xì)胞因子,后來(lái)證實(shí)是IL-15。IL-15由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、骨髓間質(zhì)、樹(shù)突狀細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞及胸腺、腎、皮膚、 腸的上皮細(xì)胞產(chǎn)生。IL-15是IL-2細(xì)胞因子家族中的一員,具有很多類似IL-2的功能,但其結(jié)構(gòu)與IL-2不相似,在先天和后天獲得性免疫系統(tǒng)中有著重要作用,與骨髓移植、腫瘤、自身免疫性疾病、感染病等相關(guān),并在其中扮演重要的角色[5],且在調(diào)控淋巴細(xì)胞的功能和穩(wěn)態(tài)中起重要作用。IL-15可作為潛在的淋巴生長(zhǎng)因子,給免疫恢復(fù)或免疫治療的優(yōu)化提供一個(gè)新的思路。

IL-15通過(guò)IL-15Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ鏈組成的IL-15R(IL-15Rα/IL-2Rβ/IL-2Rγ)發(fā)揮作用,因此具有與IL-2類似的生物學(xué)活性[5]。IL-15是NK細(xì)胞發(fā)育不可或缺的細(xì)胞因子之一,此外還能夠激活成熟的NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展,白細(xì)胞介素也得到迅速發(fā)展。IL-15是一個(gè)多效性的細(xì)胞因子,在先天和后天獲得性免疫系統(tǒng)中起著重要的作用,包括免疫性效應(yīng)細(xì)胞(特別是NK、NKT和CD8+T細(xì)胞)的發(fā)育、激活、尋靶、生存及維持各自的特異性[6-7]。 IL-15在抗炎癥、抗腫瘤、抗感染中起重要的作用[7]。因此,IL- 15在疾病的治療及疫苗佐劑的開(kāi)發(fā)方面具有很大的潛力。本研究基于基因工程技術(shù)擴(kuò)增出ChIL- 15目的基因片段,為后續(xù)動(dòng)物臨床實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株和載體

DH5α感受態(tài)菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存、pMD18-T(購(gòu)于大連寶生物有限公司)。

1.2 主要試劑、儀器

RNAisoPlus、TaKaRa TaqTM 試劑盒、 PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒、Bgl II 和 XhoI 限制性內(nèi)切酶、DNA Marker DL2000、TIANgel Midi Purification Kit試劑盒、E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I試劑盒等均購(gòu)于TIANGEN。電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)、Mastercycler? personal(PCR儀) (美國(guó)Bio-rad公司)、DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓電泳儀(北京六一生物科技有限公司)、 DYY-Ⅲ型電泳槽(北京六一生物科技有限公司)、超凈工作臺(tái)(哈東聯(lián)公司)、高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司)、漩渦混合器(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司) 、-20 ℃冷凍冰柜(海爾)、-80 ℃冷凍冰柜(海爾)、4 ℃冷藏冰箱(海爾)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

山西省忻州種雞場(chǎng)海蘭褐1日齡雛公雞,10只,體重(33±0.1)g。

2 方法

2.1 總RNA的提取

取雞的脾臟,剪成小塊并立即投入到液氮罐中。取冷凍組織60 mg,樣品按照RNA iso Plus說(shuō)明書(shū)提取操作。取RNA3 μL進(jìn)行凝膠電泳,檢測(cè)RNA的純度;取RNA 2 μL反轉(zhuǎn)錄測(cè)RNA的完整性;取RNA 2 μL進(jìn)行核酸測(cè)定儀檢測(cè)其濃度,測(cè)定260 nm和280 nm;剩余的RNA保存于液氮罐中備用。

2.2 總RNA的電泳檢測(cè)

取RNA 2.5μL與 1μL的上樣緩沖液混勻,進(jìn)行電泳,停止電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中照相。

2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank上已發(fā)表的雞IL-15基因全序列,利用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物,并在其5′端分別引入 Bgl Ⅱ,Xho Ⅰ酶切位點(diǎn),引物序列為：

p1：GAAGATCTTAACAAGATGCTGGGGATGG(Bgl Ⅱ)

p2：GCCTCGAGTTGCGTATTTTAGTTAGCGT(Xho Ⅰ)

該引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

2.4 雞IL-15基因的PCR擴(kuò)增

2.4.1 反轉(zhuǎn)錄

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

2.4.2 PCR擴(kuò)增雞IL-15基因

PCR反應(yīng)在200 μL的PCR管中進(jìn)行,反應(yīng)總體系為20 μL,包括上游特異性引物和下游特異性引物各1 μL,10×Taq Buffer 2 μL,dNTP 2 μL,模板 DNA 1 μL,Taq DNA polymerase 0.3 μL,加滅菌去離子水補(bǔ)足至20 μL,將反應(yīng)液震蕩混勻,瞬時(shí)離心后置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

2.4.3 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL與1 μL的緩沖液混勻,進(jìn)行凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中照相。

2.5 PCR產(chǎn)物的純化回收

按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.6 雞IL-15基因與pMD18-T 連接

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.7 pMD18-T-ChIL-15的轉(zhuǎn)化

將轉(zhuǎn)化后的pMD18-T-ChIL-15菌落進(jìn)行鑒定。

2.8 pMD18-T-ChIL-15菌落的PCR鑒定

直接挑取LB平板培養(yǎng)基上的白色菌落作為模板進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR反應(yīng)在200 μL的PCR管中進(jìn)行,反應(yīng)總體系為20 μL,包括上游特異性引物和下游特異性引物各1 μL,10×Taq Buffer 2 μL,dNTP 2 μL,Taq DNA polymerase 0.3 μL,加滅菌去離子水補(bǔ)足至20 μL。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè),確定陽(yáng)性克隆菌落。將陽(yáng)性單克隆菌落用接菌環(huán)接取到LB液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃,200 rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)8 h以上或過(guò)夜,取菌液送經(jīng)北京華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2.9 pMD18-T-ChIL-15質(zhì)粒DNA的提取

步驟按新質(zhì)粒提取omega EZNA plasmid mini kit I試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取操作 pMD18-T-ChIL- 15。

2.10 pMD18-T-ChIL-15質(zhì)粒的鑒定

2.10.1 pMD18-T-ChIL-15質(zhì)粒PCR鑒定

PCR反應(yīng)在200 μL的PCR管中進(jìn)行,反應(yīng)總體系為20 μL,包括上游引物和下游引物各1.5 μL,10×Taq Buffer 2 μL,dNTP 2 μL,模板(pMD18-T-ChIL- 15質(zhì)粒)1.5 μL,Taq DNA polymerase 0.3 μL,加滅菌去離子水補(bǔ)足至20 μL。

2.10.2 pMD18-T-ChIL-15質(zhì)粒雙酶切鑒定

雙酶切體系為20 μL,包括pMD18-T-ChIL- 15 10 μL,Bgl II 1 μL,Xho I 1 μL,10×H Buffer 2 μL,加滅菌去離子水補(bǔ)至20 μL。

2.10.3 pMD18-T-ChIL-15的序列測(cè)定

將陽(yáng)性克隆菌液送北京華大基因公司測(cè)序,陽(yáng)性菌液命名為 pMD18-T-ChIL- 15。

3 結(jié)果

3.1 總RNA的提取結(jié)果

取總RNA 2.5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果分別是28 s、18 s和5 s的3條帶(見(jiàn)圖1),檢測(cè)總RNA的濃度及純度合格。

圖1-4：雞脾臟總RNA樣品

3.2 PCR結(jié)果

以cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果約為580 bp,如圖2所示。

1-2：ChIL- 15 的 PCR 產(chǎn)物;3：DNA Marker

3.3 pMD18-T-ChIL-15菌落的PCR鑒定

以pMD18-T-ChIL-15菌落為模版,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果是3、4泳道與預(yù)期大小不符,棄3、4泳道菌落,使用1、2泳道的菌落進(jìn)行大量培養(yǎng)。

3.4 pMD18-T-ChIL- 15質(zhì)粒鑒定

3.4.1 pMD18-T-ChIL-15質(zhì)粒PCR鑒定

以質(zhì)粒為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果約為580 bp,見(jiàn)圖3。

1-2：質(zhì)粒 PCR 產(chǎn)物;3：DNA Marker

3.4.2 pMD18-T-ChIL-15的序列測(cè)定結(jié)果

將陽(yáng)性克隆菌液送北京華大基因公司進(jìn)行重組質(zhì)粒雙鏈DNA的雙向測(cè)序,測(cè)序后結(jié)果表明擴(kuò)增出ChIL-15的基因全長(zhǎng)為581bp。

利用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析,經(jīng)序列同源性結(jié)果表明：同源性為99.82% ,CDS區(qū)內(nèi)第150個(gè)核苷酸發(fā)生變異,T變?yōu)镃(T-C)。

利用 MEGA4.0 軟件進(jìn)行比對(duì)分析,經(jīng)氨基酸同源性結(jié)果表明：同源性為100%。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功從雞的脾臟中擴(kuò)增出ChIL-15,提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定、測(cè)序結(jié)果比對(duì)及編碼成氨基酸比對(duì)均與美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中登錄號(hào)AF139097.1基本相符合,編碼區(qū)核苷酸的同源性為99.82%,其中CDS區(qū)內(nèi)150位核苷酸發(fā)生變異,由T變?yōu)镃。進(jìn)行氨基酸的同源性比對(duì),同源性為100% ,由于密碼子的簡(jiǎn)并性,即使密碼子的第三位堿基改變但是不會(huì)影響氨基酸翻譯,所以氨基酸的同源性為100%,原因是ACC、ACT都可以編碼為Thr。