補(bǔ)腎降濁方在糖尿病腎病中的作用及其機(jī)制研究*

李萍，胡劍卓，周珂

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 腎病內(nèi)分泌科，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病的主要原因[1]。糖尿病的典型病理特征是腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張和基質(zhì)積聚，最終進(jìn)展為腎小球和腎小管纖維化[2-3]。其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及晚期糖基化終產(chǎn)物、炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、自噬和導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積和腎間質(zhì)纖維化的各種信號(hào)傳導(dǎo)[4]，最后導(dǎo)致蛋白尿和腎小球?yàn)V過(guò)率的逐漸降低[5]。盡管DN研究取得了進(jìn)展，但在開(kāi)發(fā)可靠的早期診斷標(biāo)志物或針對(duì)這種疾病的有效治療方法方面尚未取得突破[6-7]。目前，DN的主要西醫(yī)治療方法是通過(guò)胰島素和腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑調(diào)節(jié)血糖和血壓[8]。然而，這些方法只能延緩DN的進(jìn)展，并不能預(yù)防或治愈。最近，中藥配方因治療DN療效突出、副作用小、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等特點(diǎn)越來(lái)越受到關(guān)注[9]。因此，探尋治療DN的中藥配方，探究其分子機(jī)制對(duì)于DN的預(yù)防和治療具有重要的意義。

中醫(yī)典籍記載糖尿病多責(zé)之于腎，病機(jī)多為消渴日久，腎氣虛損，精氣不固而泄于下。氣虛則帥血無(wú)力，陰虛則脈道失于潤(rùn)澤，陽(yáng)虛則血脈失于溫煦[10]。因此，DN的治療應(yīng)以補(bǔ)腎氣固腎精為主，佐以活血通絡(luò)。補(bǔ)腎降濁方具有益氣滋陰固腎，活血通絡(luò)降濁之功效，對(duì)DN有很好的療效。有研究證實(shí)補(bǔ)腎降濁方多種主要成分在腎功能損傷中具有保護(hù)作用[11]。既往研究表明，補(bǔ)腎降濁方中的六味地黃丸能夠顯著改善腎陰虧虛型糖尿病患者腎功能障礙[12]。臨床上使用補(bǔ)腎降濁方治療DN患者對(duì)改善其腎功能不全具有良好的療效，并對(duì)患者的腎臟、脾胃具有積極的保護(hù)作用[13]。然而，對(duì)于補(bǔ)腎降濁方的具體作用機(jī)制尚不清晰，需深入探究。

NAD+依賴性脫乙酰酶沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silence information regulator 1, SIRT1）作為Sirtuin家族的成員之一，在多種疾病中都具有保護(hù)作用[14]。在正常腎臟中可檢測(cè)到SIRT1蛋白表達(dá)，但在糖尿病腎臟中其表達(dá)水平降低[15]。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎降濁方主要的成分在多種疾病中都可以參與SIRT1的表達(dá)調(diào)控。熟地黃主要活性物質(zhì)梓醇可以通過(guò)誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎臟疾病發(fā)揮很強(qiáng)的保護(hù)作用[16]。然而，補(bǔ)腎降濁方是否通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)，而改善DN腎組織損傷，尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

18只SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自北京維通利華有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2022-0052；血尿素氮檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC1535）、血肌酐檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC4915）、HE染色試劑盒（貨號(hào)：G1120）和Masson染色試劑盒（貨號(hào)：G1340）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Prime Script? RT試劑盒（貨號(hào)：RR047A）和SYBR?Premix Ex Tap? Ⅱ試劑盒（貨號(hào)：DRR820A）均購(gòu)自日本TaKaRa公司，RIPA裂解液（貨號(hào)：P0013B）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，SIRT1（貨號(hào)：#8469）、p-p38（貨號(hào)：#8690）、p38（貨號(hào)：#4511）、p-NF-κB p65（貨號(hào)：#3033）和NF-κB p65（貨號(hào)：#8242）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，GAPDH（貨號(hào)：ab181602）、山羊抗兔二抗（貨號(hào)：ab205718）和ECL Western Blotting底物試劑盒（貨號(hào)：ab65623）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

大鼠代謝籠尿液收集冷卻裝置（DXL-DJMC型，北京德耳斯儀器有限公司），酶標(biāo)儀（ELx808型，美國(guó)Biotek公司），高速冷凍型微量臺(tái)式離心機(jī)（D1524R型，北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司），紫外分光光度儀（NP80型，德國(guó)Implen公司），ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（4377354型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），蛋白垂直電泳儀（1658033型，美國(guó)Bio-rad公司），明美生物顯微鏡（ML31-M型，濟(jì)南愛(ài)來(lái)寶儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 復(fù)制模型

大鼠體重（220±10）g，在（23±1）℃、12 h光照/黑暗循環(huán)中自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)食物飼養(yǎng)。1周后，隨機(jī)選取6只大鼠作為Control組，正常喂食。余12只大鼠食用高脂飼料（包括基礎(chǔ)飼料71.5%、豬油10%、蛋黃10%、葡萄糖5%、奶粉2.5%、膽固醇1%）4周，參照參考文獻(xiàn)[17]并根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況調(diào)整復(fù)制DN大鼠模型。大鼠禁食12 h后將新鮮制備的65 mg/kg鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）加入檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5），進(jìn)行腹腔內(nèi)一次性注射以誘導(dǎo)DN模型。STZ注射72 h后，連續(xù)3 d血糖水平＞16.7 mmol/L大鼠被認(rèn)定患有糖尿病。隨后連續(xù)飼喂脂肪飲食3周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天用代謝籠收集24 h尿，大鼠尿白蛋白≥ 30 mg/24 h表明DN模型復(fù)制成功。隨機(jī)分為DN組、DN + 補(bǔ)腎降濁方組[含生藥11.04 g/（kg·d），相當(dāng)于成人劑量的6.3倍]，每組6只。

1.4 補(bǔ)腎降濁方制作

補(bǔ)腎降濁方：熟地黃24 g，黃芪、丹參各30 g，山茱萸、山藥各12 g，黨參、桑寄生、當(dāng)歸、菟絲子各20 g，茯苓、牡丹皮、澤瀉各9 g，芡實(shí)、金櫻子、淫羊蕾、大黃各10 g，生藥共255 g。以上藥物于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房購(gòu)買并熬制成煎劑，使用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。DN + 補(bǔ)腎降濁方組按1 mL/100 g容積給藥，1次/d，共12周。

1.5 血清和尿液生化檢測(cè)

給藥干預(yù)12周后，使用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，記錄尿量后留取5 mL尿液標(biāo)本，以3 000 r/min離心20 min，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，使用生化分析儀測(cè)定尿中的尿蛋白水平。而后采用10%水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉處死大鼠，收集大鼠腹主動(dòng)脈血液后靜置1 h，離心取血清并置于-80 ℃冰箱冷凍保存。血尿素氮和血肌酐用檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。對(duì)處死大鼠迅速摘取右腎，置于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 腎組織的病理分析

將大鼠右腎進(jìn)行脫水處理，然后放入58 ℃石蠟包浸機(jī)中，浸蠟，凝固后制成4 cm × 2 cm的石蠟塊。將石蠟包埋塊置于切片機(jī)切片，每個(gè)腎標(biāo)本切3片，厚度3 μm。對(duì)切片進(jìn)行HE染色、Masson染色。在400倍顯微鏡下采用盲法觀察每個(gè)染色切片，評(píng)估組織病理學(xué)損傷。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)SIRT1 mRNA表達(dá)

使用TRIzol試劑從腎組織中提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將濃度和純度符合要求的RNA樣品，稀釋到合適的濃度，利用Prime Script ? RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，使用SYBR?Premix Ex TapTMⅡ試劑盒，運(yùn)用Applied Biosystems 7500HT系統(tǒng)進(jìn)行PCR。SIRT1正向引物：5'-AGTTGATCAAG GTAGTGCTGGTA-3'，反向引物：5'-TGCCACCTAGAA CATGGCTC-3'，分別為23和20 bp；GAPDH正向引物：5'-ACCCCTCCTGGGTTTGTAGT-3'，反向引物：5'-CATCCAAGCATTCAACCGGC-3'，均為20 bp。擴(kuò)增步驟：95℃預(yù)變性30 s、1個(gè)循環(huán)，59℃退火20 s，72℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)。并通過(guò)2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，計(jì)算均值。

1.8 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解緩沖液在冰上提取蛋白質(zhì)，使用增強(qiáng)的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒來(lái)確定每種裂解物中的總蛋白濃度。將等量的蛋白質(zhì)上樣到10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，通過(guò)電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在室溫下于5%脫脂牛奶中封閉2 h，并在4 ℃下與一抗SIRT1（1∶1 000）、p-p38（1∶1 000）、p38（1∶2 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）和NF-κB p65（1∶2 000）孵育過(guò)夜，以GAPDH（1∶10 000）作為對(duì)照。隨后，將膜用山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶2 000）進(jìn)行探測(cè)。使用ECL Western blotting底物試劑盒檢查蛋白條帶，顯影，分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血尿素氮、血肌酐、尿白蛋白水平比較

各組大鼠血尿素氮、血肌酐、尿白蛋白水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DN組較Control組升高（P＜0.05），補(bǔ)腎降濁方組較DN組降低（P＜0.05）。表明補(bǔ)腎降濁方治療可顯著緩解DN大鼠腎功能損傷程度。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血尿素氮、血肌酐、尿白蛋白水平比較（n=6，±s）

表1 各組大鼠血尿素氮、血肌酐、尿白蛋白水平比較（n=6，±s）

組別Control組DN組DN + 補(bǔ)腎降濁方組F 值P 值血尿素氮/（mmol/L）6.18±0.85 21.54±1.98 12.59±1.52 90.645 0.000血肌酐/（μmol/L）7.25±0.94 23.61±2.45 13.07±1.43 7.364 0.000尿白蛋白/（μg/mL）22.36±2.47 46.73±5.31 29.34±2.72 10.816 0.000

2.2 各組大鼠腎組織SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

Control組、DN組、DN+補(bǔ)腎降濁方組腎組織中SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.08）、（0.38±0.05）、（0.89±0.07），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=82.255，P=0.000），DN組較Control組降低（P＜0.05），DN + 補(bǔ)腎降濁方組較DN組升高（P＜0.05）。說(shuō)明補(bǔ)腎降濁方可促進(jìn)DN大鼠腎組織SIRT1的表達(dá)。

2.3 補(bǔ)腎降濁方對(duì)DN大鼠腎組織病理?yè)p傷的影響

Control組腎小球和腎小管形態(tài)完整，而DN組腎小管基底膜增厚，腎小球肥大，表明DN組大鼠腎功能受到嚴(yán)重?fù)p害。與DN組相比，DN + 補(bǔ)腎降濁方組大鼠腎小管基底膜增厚和腎小球肥大情況明顯減少。表明經(jīng)補(bǔ)腎降濁方治療后，DN大鼠腎組織病理?yè)p傷得到明顯緩解。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理?yè)p傷評(píng)估 （HE染色×400）

2.4 補(bǔ)腎降濁方對(duì)糖尿病大鼠腎組織纖維化的影響

與Control組比較，DN組腎小球和腎小管腔中膠原蛋白的沉積量明顯增加。與DN組比較，DN +補(bǔ)腎降濁方組大鼠腎小球和腎小管腔中膠原蛋白的沉積量明顯減少。表明補(bǔ)腎降濁方治療后，DN大鼠腎組織纖維化得到明顯緩解。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腎組織纖維化情況評(píng)估 （Masson染色×400）

2.5 各組大鼠腎組織SIRT1蛋白、p-p38/p38和p-NF-κB p65/NF-κB p65比較

各組大鼠腎組織SIRT1蛋白、p-p38/p38和p-NF-κB p65/NF-κB p65比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DN組SIRT1蛋白較Control組降低（P＜0.05），p-p38/p38、p-NF-κB p65/NF-κB p65較Control組升高（P＜0.05）；DN +補(bǔ)腎降濁方組SIRT1蛋白較DN組升高（P＜0.05），p-p38/p38、p-NF-κB p65/NFκB p65較DN組降低（P＜0.05）。說(shuō)明補(bǔ)腎降濁方對(duì)DN大鼠腎組織的保護(hù)作用可能與其抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。見(jiàn)表2和圖3。

圖3 各組大鼠腎組織SIRT1和MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白條帶圖

表2 各組大鼠腎組織中SIRT1蛋白、p-p38/p38和p-NF-κB p65/ NF-κB p65比較 （n=6，±s）

表2 各組大鼠腎組織中SIRT1蛋白、p-p38/p38和p-NF-κB p65/ NF-κB p65比較 （n=6，±s）

組別Control組DN組DN + 補(bǔ)腎降濁方組F 值P 值SIRT1蛋白0.42±0.03 0.14±0.04 0.19±0.02 138.423 0.000 p-p38/p38 0.11±0.03 0.89±0.11 0.43±0.06 166.782 0.000 p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.08±0.02 0.33±0.05 0.14±0.04 68.130 0.000

3 討論

DN主要由腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變所致[18]。其中20%～40%糖尿病患者會(huì)進(jìn)展為DN[19]。隨著頑固的病理進(jìn)展，DN往往會(huì)發(fā)展為慢性腎病，甚至腎衰竭尿毒癥，不僅給患者增加痛苦，而且也加重公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DN大鼠模型中，腎組織SIRT1表達(dá)顯著降低，腎小管基底膜增厚，腎小球肥大，腎小球和腎小管腔中膠原蛋白的沉積量明顯增加。補(bǔ)腎降濁方可促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路，膠原蛋白的沉積量明顯減少，腎組織病理?yè)p傷得到明顯改善。從機(jī)制上講，補(bǔ)腎降濁方能促進(jìn)SIRT1的表達(dá)，抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路，改善DN腎組織損傷。表明補(bǔ)腎降濁方對(duì)治療DN具有良好效果。

DN在中醫(yī)典籍記載中沒(méi)有具體的病名，但從其癥狀表現(xiàn)來(lái)看是繼發(fā)于中醫(yī)之消渴病，同時(shí)也屬于水腫、關(guān)格、腎勞及腎消等范疇[21]。本院經(jīng)方補(bǔ)腎降濁方以六味地黃丸為底方加味，主要由黃芪、山藥、黨參、熟地黃、當(dāng)歸、茯苓、澤瀉、丹參、牡丹皮、大黃、淫羊藿、芡實(shí)、金櫻子等中藥材組成。有報(bào)道顯示黃芪-當(dāng)歸復(fù)合物可顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖水平，提高胰島素水平，改善腎功能，降低尿蛋白，抑制DN的進(jìn)展[22]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DN和丹參具有共同作用靶點(diǎn)，并且主要涉及晚期糖基化終產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)[23]。趙錦等[24]證實(shí)淫羊藿苷可減少細(xì)胞外基質(zhì)的增生并抑制腎組織細(xì)胞凋亡，減輕DN大鼠腎組織損傷。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎降濁方可以抑制腎小管基底膜增厚和腎小球肥大，減少腎小球和腎小管腔中膠原蛋白的沉積，明顯改善腎組織病理?yè)p傷。

越來(lái)越多的研究表明，SIRT1在DN中發(fā)揮重要作用。HONG等[25]研究發(fā)現(xiàn)在人類糖尿病腎臟的足細(xì)胞和腎小球細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)降低，并且使用EX527（SIRT1抑制劑）誘導(dǎo)了SIRT1的整體降低，加速了鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎病的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎降濁方中的主要成分可以調(diào)控SIRT1的表達(dá)。在缺血性腦損傷中，黃芪可以通過(guò)上調(diào)SIRT1的表達(dá)抑制促炎細(xì)胞因子的水平[26]。然而，SIRT1治療DN的下游調(diào)控通路未知。有文獻(xiàn)報(bào)道，SIRT1表達(dá)能夠抑制p65 NF-κB的磷酸化來(lái)預(yù)防DN[27]。并且通過(guò)下調(diào)p38 MAPK和NF-κB p65的表達(dá)能夠抑制炎癥反應(yīng)，延緩腎損傷，保護(hù)糖尿病大鼠的腎臟[28]。本研究結(jié)果證實(shí)，補(bǔ)腎降濁方可以促進(jìn)SIRT1的表達(dá)，抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路的激活。

綜上所述，本研究結(jié)果表明補(bǔ)腎降濁方促進(jìn)SIRT1的表達(dá)，抑制MAPK/NF-κB信號(hào)通路，改善DN腎組織損傷。提示補(bǔ)腎降濁方對(duì)治療DN具有良好效果。并為治療DN提供新的研究思路。