腺苷酸活化蛋白激酶在炎癥性腸病的研究進(jìn)展*

王裕倩，藍(lán)程，符永華，王新月

（1.海南醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院 消化內(nèi)科，海南 ?？?570311；3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)中心，海南 ?？?570102）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel diseases, IBD）是慢性腸道炎癥及免疫相關(guān)性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）和克羅恩?。╟rohn disease, CD）[1]。IBD的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已成為我國的常見病及多發(fā)病，并呈現(xiàn)年輕化的特點。IBD的發(fā)病機制目前尚未明確，考慮可能與環(huán)境因素、生活方式改變、遺傳易感性、腸道屏障減弱及腸道微生物失調(diào)等復(fù)雜因素相關(guān)。針對IBD的傳統(tǒng)治療方法主要包括使用氨基水楊酸制劑、激素，及免疫抑制劑[2]。近年來，新型藥物（如抗白細(xì)胞介素-12、抗白細(xì)胞介素-23、抗腫瘤因子-α等生物制劑）的出現(xiàn)在重癥IBD患者中取得了顯著的療效，但長期運用此類藥物可能會增加惡性淋巴瘤和其他難治性疾病的風(fēng)險。此外，由于新型藥物的價格高昂，使患者在就診過程中依從性普遍下降，因此尋找并開發(fā)新的治療方法迫在眉睫。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于真核細(xì)胞中，是維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的感受器。AMPK有益于腸道健康，如調(diào)節(jié)腸道屏障、減輕腸道炎癥及治療腸道疾病等。因此，本文將對AMPK在腸道健康中扮演的作用進(jìn)行綜述，并分析AMPK成為IBD潛在治療靶點的可行性。

1 AMPK結(jié)構(gòu)及功能

AMPK是一種高度保守的細(xì)胞能量保護(hù)器，普遍存在于植物、哺乳動物、果蠅等真核細(xì)胞動物中，對維持能量平衡起著十分關(guān)鍵的作用。AMPK由3個亞基組成，分別為催化亞基α、調(diào)節(jié)亞基β和調(diào)節(jié)亞基γ，每個亞基具有許多亞型（α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3）[3]，一共可以組成12種異三聚合體，并分別表達(dá)于不同的亞細(xì)胞當(dāng)中[4]。其中，α1亞型廣泛分布于細(xì)胞，而α2亞型則在心肌、肝臟和骨骼肌中高表達(dá)；β1亞型主要在肝臟中表達(dá)，而β2亞型在骨骼肌中高表達(dá)；γ1、γ2亞型廣泛分布于各種組織，而γ3亞型僅在骨骼肌中表達(dá)[5]。AMPK可在各種代謝相關(guān)的器官和組織中表達(dá)，其活性主要受腺苷一磷酸（adenosine monophosphate, AMP）/腺苷三磷酸（adenosine triphosphate, ATP）比率的調(diào)節(jié)，并被各種刺激所激活，如饑餓、缺氧和其他可能影響細(xì)胞代謝的物質(zhì)[6]。α亞基包括絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和位于N-末端區(qū)域的關(guān)鍵殘基Thr172，是調(diào)控AMPK活性至關(guān)重要的部位。Thr172可被鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2（calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase 2, CaMKK2）或肝臟激酶B1（liver kinase B1, LKB1）直接磷酸化[7]。當(dāng)體內(nèi)低能量（AMP/ATP升高）時，上游LKB1或CaMKK2磷酸化Thr172殘基，從而催化AMPKα亞基，導(dǎo)致下游AMPK磷酸化，生成大量ATP，并同時抑制ATP的能量消耗，從而保證能量守恒。γ亞基含有4個結(jié)合腺嘌呤核苷酸的半胱硫氨酸-β-合酶結(jié)構(gòu)域。AICAR（AMPK常用的藥理激活劑）及二甲雙胍是AMPK的間接激活劑，可分別產(chǎn)生ZMP（一種AMP類似物）和AMP/ATP來激活A(yù)MPK的γ亞基[8]。β亞基含有1個碳水化合物結(jié)合模塊，與絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域一起共同形成變構(gòu)藥物和代謝物的結(jié)合部位，該部位可被小分子激動劑（如化合物991和A769662）直接變構(gòu)激活[9]。

2 AMPK參與腸道屏障保護(hù)作用

腸道屏障是機體接觸外部環(huán)境的最大表面，不僅參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，更有抵制細(xì)菌及毒素對機體的侵襲作用。機械屏障和免疫屏障構(gòu)成了腸道屏障。

2.1 AMPK在腸道機械屏障中的重要作用

腸道機械屏障又被稱作為物理屏障，以黏膜上皮、固有層和黏膜肌層為基礎(chǔ)[10]。在腸上皮中，緊密連接（tight junction, TJ）緊密結(jié)合上皮細(xì)胞，從而保護(hù)腸道免受外界的影響，這對于維持腸道機械屏障非常重要。TJ家族由跨膜蛋白（包括Claudins、Occludins）、連接黏附分子和Zonula Occludins（ZO）蛋白組成[11]。這3種類型的跨膜蛋白嵌入到腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells, IECs）的細(xì)胞膜上，同一或相鄰細(xì)胞的跨膜蛋白通過ZO-1蛋白相互連接，致使上皮細(xì)胞間連接緊密，可有效阻斷細(xì)菌、病毒及內(nèi)毒素進(jìn)入。一旦機體發(fā)生了細(xì)胞旁通透性及TJ屏障功能的障礙，病原體（如毒素及細(xì)菌、過敏源）可擴散進(jìn)入機體，導(dǎo)致大量的炎癥細(xì)胞募集，釋放炎癥細(xì)胞因子[如白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）、IL-β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等]，導(dǎo)致發(fā)生全身免疫紊亂及腸道炎癥疾病，如IBD、自身免疫性疾病、肥胖、糖尿病等。

活化的AMPK通過上調(diào)TJ蛋白調(diào)控上皮屏障功能，增強腸道的屏障功能[11]。通過誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇和微生物代謝產(chǎn)物通過活化AMPK促進(jìn)CDX2的表達(dá)，從而調(diào)控TJ蛋白的生成，促進(jìn)腸道屏障作用[12]。在急性結(jié)腸損傷的實驗中，通過測定促炎細(xì)胞因子、細(xì)胞旁通透性和TJ指標(biāo)，分析腸上皮屏障的完整性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對腸上皮損傷的修復(fù)作用需通過激活A(yù)MPK才得以實現(xiàn)[13]。此外，體外研究結(jié)果表明，AMPK直接激活劑化合物991可降低TJs的分解，確保Caco 2細(xì)胞（人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和功能類似分化的小腸上皮細(xì)胞）中TJ的組裝，穩(wěn)定上皮屏障功能[14]。

另外，CDX2是參與調(diào)節(jié)IECs分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，主要在低分化的上皮細(xì)胞中表達(dá)[15]。CDX2缺乏會影響IECs分化，研究顯示AMPK主要位于成人空腸絨毛上皮的頂端，當(dāng)AMPK被敲除后會顯著降低CDX2的表達(dá)，進(jìn)而破壞腸道屏障完整性，如TJ超微結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)不同程度的損傷，且導(dǎo)致上皮細(xì)胞遷移和腸道增生發(fā)生[16]。綜上表明，AMPK可通過增強CDX2基因表達(dá)改善IECs分化和屏障功能。

2.2 AMPK對腸道免疫屏障至關(guān)重要

腸道免疫屏障又稱腸黏膜免疫屏障，功能主要依賴于腸黏膜。腸黏膜具有選擇性通透性，不僅吸收養(yǎng)分，還在內(nèi)外環(huán)境之間建立屏障。腸道免疫屏障的關(guān)鍵成分包括抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）、分泌型免疫球蛋白[10]。AMPs在抵御腸道疾病方面起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，AMPs水平隨著AMPK磷酸化的減少而下降，這表明AMPK與AMPs表達(dá)相關(guān)[17]。有研究表明，在IBD小鼠模型中，AMPK的缺失減弱了AMPs緩解腸道損傷的能力[18]。除此之外，AMPs還可通過激活LKB1-AMPK通路減輕內(nèi)毒素對宿主的攻擊[18]。因此，AMPK的激活正向調(diào)控AMPs的表達(dá)，從而增強腸道免疫屏障作用。

分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A, SIgA）是一種二聚體抗體，在黏膜分泌物中最常見，可與IECs基底外側(cè)表面的聚合免疫球蛋白受體結(jié)合，釋放到腸腔內(nèi)，并與各種腸道抗原相互作用，從而限制共生菌和可溶性抗原攻擊腸上皮的能力[19]。重要的是，SIgA從多種機制對免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，對于維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有不可替代的重要作用[19]。有報道稱，飼喂果膠的豬回腸黏膜SIgA含量顯著增加，這是因為腸道微生物群發(fā)酵，果膠產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸，可進(jìn)一步激活A(yù)MPK[20]。從以上來看，活化的AMPK可促進(jìn)SIgA在腸道中的表達(dá)，進(jìn)而增強腸道的免疫屏障功能。

2.3 AMPK與腸道微生物區(qū)系的關(guān)系

值得注意的是，腸道AMPK的激活與腸道微生物群密切相關(guān)。腸道微生物區(qū)系對腸道屏障功能（無論機械屏障還是免疫屏障）也有重要影響。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸可以激活結(jié)腸細(xì)胞中的AMPK[21]。雙歧桿菌、乳桿菌和類桿菌能改善IBD，而肝螺桿菌會加重IBD，菌群發(fā)揮不同作用的原因是其在短鏈脂肪酸方面的差異[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，口服二甲雙胍或黃連素可增加腸道微生物區(qū)系中的球狀桿菌、類桿菌、布魯氏菌、丁球菌和弧形桿菌的數(shù)量，促進(jìn)短鏈脂肪酸產(chǎn)生，被激活的AMPK信號進(jìn)一步調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系，增加有益細(xì)菌及降低有害細(xì)菌，修復(fù)腸黏膜屏障[23]。

3 AMPK在IBD中的抗炎作用

IBD是一種由腸道炎癥引起的免疫性疾病，當(dāng)腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)時，免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，觸發(fā)T細(xì)胞的激活和中性粒細(xì)胞的聚集來抵御細(xì)菌侵襲。文獻(xiàn)報道稱，腸道炎癥的進(jìn)展主要因調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不足、效應(yīng)性T細(xì)胞過多和促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生，從而加重結(jié)腸炎[22]。因此，有效阻斷促炎細(xì)胞因子為IBD的治療提供了巨大潛力[24]。

3.1 AMPK下調(diào)NF-κB信號抑制IBD的發(fā)展

NF-κB的磷酸化和核轉(zhuǎn)位可通過誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生導(dǎo)致IBD的進(jìn)展，這與ZHANG等[25]報道的IBD患者的結(jié)腸中NF-κB p65表達(dá)顯著升高一致。當(dāng)AMPK信號激活下游靶點[包括沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1, SIRT1）、kappa B激酶抑制因子、叉頭盒O（forkhead box O, FOXO）家族、P53和過氧化體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptorgamma coactivator-1alpha, PGC-1α）信號]時，NF-κB信號被下調(diào)，從而抑制促炎因子的表達(dá)。一項動物實驗發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸炎模型中，被活化的AMPK可介導(dǎo)SIRT1/NF-κB途徑來抑制產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[12]；此外，桔梗發(fā)酵液實驗證明通過激活A(yù)MPK/NF-κB/NLRP3信號通路，減輕經(jīng)葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium, DSS）誘導(dǎo)的IBD小鼠模型的炎癥反應(yīng)[26]。因此有理由相信，AMPK可通過下調(diào)NF-κB從而抑制結(jié)腸炎的發(fā)生，可作為潛在的抗炎及免疫調(diào)節(jié)劑用于治療IBD。

3.2 AMPK參與巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)

巨噬細(xì)胞可通過產(chǎn)生許多關(guān)鍵的細(xì)胞因子（如抗炎因子IL-10、人精氨酸酶1，促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等）參與IBD的發(fā)生、發(fā)展。在UC患者中，免疫失衡是因為包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞產(chǎn)生過多的促炎細(xì)胞因子[27]。由此可見，平衡巨噬細(xì)胞極化是延緩UC進(jìn)展的必要條件。研究表明AMPK參與巨噬細(xì)胞的極化，可通過激活PI3K/Akt通路使M2巨噬細(xì)胞發(fā)生極化，上調(diào)抗炎因子水平，同時其亦可通過抑制NF-κB通路使M1巨噬細(xì)胞發(fā)生極化，下調(diào)促炎因子的表達(dá)[27]。

3.3 AMPK上調(diào)PGC-1α減輕結(jié)腸炎

線粒體對于腸道干細(xì)胞正常分化和功能表達(dá)是不可或缺的。線粒體中pGC-1α是參與生物合成和呼吸的主要調(diào)節(jié)器，可調(diào)控抗氧化基因的表達(dá)。在UC患者的腸道中，線粒體氧化磷酸化和線粒體功能的相關(guān)基因表達(dá)減少。據(jù)RIUS-PéREZ等[28]報道，PGC-1α是連接代謝調(diào)節(jié)、氧化還原控制和炎癥通路的關(guān)鍵節(jié)點，PGC-1α失調(diào)后可改變細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，并加劇炎癥反應(yīng)。蘿卜素是一種蘿卜硫素的前體，具有抗炎和抗氧化作用，在通過DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠模型中已被證實，可通過補充蘿卜素使AMPK/PGC-1α通路維持結(jié)腸組織中線粒體的穩(wěn)態(tài)，減少氧化應(yīng)激，從而減輕結(jié)腸炎[29]。

3.4 AMPK抑制結(jié)腸固有層CD4+細(xì)胞改善慢性結(jié)腸炎

越來越多的證據(jù)表明，IBD是由先天性和獲得性免疫系統(tǒng)對共生微生物的不適當(dāng)反應(yīng)引起[30]。結(jié)腸固有層中炎癥細(xì)胞CD4+T的存在是IBD發(fā)病的關(guān)鍵因素。二甲雙胍是2型糖尿病一線降糖藥物，多年來一直在臨床上廣泛使用。二甲雙胍可通過抑制ATP的合成和抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體I的活性，激活真核細(xì)胞中代謝應(yīng)激感受器AMPK。體內(nèi)外實驗均證實了二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK對結(jié)腸固有層內(nèi)CD4+T細(xì)胞的抑制作用來改善慢性結(jié)腸炎的發(fā)生[31]。

3.5 AMPK下調(diào)mTOR阻止Th17/Treg細(xì)胞失衡

輔助性T細(xì)胞17（T helper 17, Th17）通過促炎細(xì)胞因子加重腸道炎癥反應(yīng)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T, Treg）可維持腸道免疫耐受和平衡，兩者在腸道微環(huán)境中參與IBD的發(fā)生、發(fā)展，因此糾正Th17與Treg細(xì)胞之間的失衡，有助于預(yù)防和治療IBD[32]。在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型的實驗研究中，從肉桂中提取的CTD1激活A(yù)MPK/mTOR途徑，一方面抑制TNF-α、IL-β、IL-6、MPO等促炎因子水平，同時阻止Th17/Treg細(xì)胞失衡，最終減輕炎癥反應(yīng)[32]，這闡明了AMPK活化可抑制Th17/Treg細(xì)胞之間的紊亂，維護(hù)腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，改善結(jié)腸炎。

4 AMPK在IBD中的抗纖維作用

UC是黏膜層及黏膜下層的炎癥病變，而CD可累及口腔至腸道的任意部位，特點是全腸層透壁性炎癥[33]，常見的并發(fā)癥為腸纖維化，可能導(dǎo)致腸腔狹窄、腸梗阻、穿孔或瘺管。通過三硝基苯磺酸誘導(dǎo)復(fù)制體外及小鼠腸纖維化模型，證實了發(fā)生纖維化的CD小鼠體內(nèi)脂聯(lián)素表達(dá)會增強。重要的是，用脂聯(lián)素處理過的纖維化模型小鼠其纖維化程度有所減輕，其原因是脂聯(lián)素通過促進(jìn)AMPK磷酸化，抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad信號通路，發(fā)揮抗纖維化的作用[34]。

5 AMPK通過增強自噬改善結(jié)腸炎

自噬是一種介導(dǎo)溶酶體將損傷及衰老的細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)異常蛋白降解的程序性死亡方式。研究表明自噬及其相關(guān)基因通過病原體清除、免疫功能、調(diào)節(jié)炎癥信號或抑制炎癥體等途徑參與IBD的免疫應(yīng)答[35]。有效的自噬可以通過多種平衡來保持腸道耐受和免疫耐受的動態(tài)平衡。因此，自噬調(diào)節(jié)在IBD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

AMPK是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的能量感受器，在均衡能量供需、協(xié)調(diào)各種細(xì)胞代謝途徑中起關(guān)鍵作用，從而協(xié)調(diào)細(xì)胞和器官生長發(fā)育[36]。哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)（mammalian target of rapamycin, mTOR）是細(xì)胞生長和增殖的中央調(diào)節(jié)因子，有mTORC1和mTORC1 2種復(fù)合體[37]。能量代謝平衡調(diào)節(jié)可通過多條相關(guān)信號通路進(jìn)行介導(dǎo)，其中，AMPK/mTOR信號通路是細(xì)胞內(nèi)合成代謝與分解代謝過程之間的焦點。AMPK的重要下游靶點之一是mTOR，其在自噬中起負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。

在結(jié)腸炎發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激會損傷腸道結(jié)構(gòu)及功能，而自噬可通過清除衰老的細(xì)胞器和受損的蛋白質(zhì)來降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激，對維持IECs的穩(wěn)定起重要作用。自噬的標(biāo)志物有輕鏈3（light chain 3,Lc3）、自噬相關(guān)蛋白5（autophagy-related protein 5,ATG5）、Beclin-1和P62。研究發(fā)現(xiàn)藥用植物薯蕷皂苷，可引起自噬的發(fā)生，表現(xiàn)在ATG5和Lc3水平升高，P62水平降低，抑制了氧化應(yīng)激，并使用化合物C（AMPK抑制劑）證明了薯蕷皂苷通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路參與自噬的調(diào)節(jié)，從而有效地緩解了結(jié)腸炎損傷程度[38]。另外，原花青素A1被發(fā)現(xiàn)可改善小鼠UC，并增加自噬標(biāo)志物的表達(dá)（自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ水平升高，P62降低），且研究證實了完成自噬的過程需要激活A(yù)MPK/mTOR/p70S6k信號通路[39]。這些實驗研究充分表明AMPK通過抑制mTOR信號促進(jìn)自噬的發(fā)生，從而延緩IBD的進(jìn)展。

6 總結(jié)

AMPK作為細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器，通過調(diào)節(jié)腸道屏障功能及多種途徑下調(diào)腸道炎癥免疫反應(yīng)，從而對腸道組織產(chǎn)生保護(hù)作用。不少關(guān)于AMPK激動劑的體內(nèi)外實驗研究也表明AMPK可能成為治療IBD的潛在靶點，且AMPK存在于多種植物化學(xué)物質(zhì)中，這為天然產(chǎn)品在IBD的治療提供了良好的前景。由于AMPK異三聚體的復(fù)雜性，現(xiàn)今大多數(shù)針對AMPK的研究多是針對其化合物的驗證。因此，探索一種植物化學(xué)物質(zhì)是否會對不同的AMPK亞型有類似的影響，這將是一個十分有挑戰(zhàn)性和有趣的課題。與此同時，目前研究對象多以AMPK和UC的實驗性研究為主，以CD作為研究對象的報道很少，并且針對AMPK的臨床試驗研究鮮有報道。因此，AMPK作為IBD的潛在治療靶點仍需進(jìn)行大量深入研究。