大豆疫霉根腐病的防治及研究進展

周 揚 韓昕君 傅豪 李志輝

（漯河市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南漯河 462000）

大豆［Glycine max（L.）Merr.］不僅是一種重要的農(nóng)作物， 也是重要的工業(yè)和飼料原料。 在大豆受侵發(fā)生的主要30 多種病害中[1]，大豆疫霉根腐?。≒hytophthora root rot,PRR）是其中危害嚴(yán)重的病害之一。該病害發(fā)生于大豆的整個生育期， 其病原菌侵染植物的根、莖、葉和豆莢，引起莖部腐爛、植株矮化枯萎甚至死亡。 大豆疫霉根腐病能造成25%～50%的產(chǎn)量損失，在低溫和高降雨年份為50%～80%，嚴(yán)重的地塊甚至絕產(chǎn)[2-3]。 目前對于PRR 的抗性研究主要是利用新發(fā)掘的抗病基因和已知抗病基因培育抗病品種，但病原菌的致病機制、田間抗性機制與抗病機制之間的關(guān)系這些問題仍需解決。 因此，了解大豆疫霉根腐病的發(fā)生危害、抗源篩選、抗性機制等尤為重要。

1 PRR 研究概述

1.1 PRR 的發(fā)生與危害

PRR 由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起，于1989 年在我國黑龍江省地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[4-5]，1991 年我國科學(xué)家沈崇堯首次分離出大豆疫霉菌[6]。 大豆疫霉根腐病在排水不佳、 地表易積水的黏性土壤中發(fā)生最為嚴(yán)重[7]，大豆疫霉菌使幼苗猝倒、 根腐與莖腐， 最后造成植株枯萎死亡， 疫霉菌的侵染還大大降低植株對其他病原菌的抵抗性[8]。 該病害對大豆產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響， 在美國1996-2010 年共造成（0.68～1.55）×109kg 的損失[9]。 我國黑龍江每年受疫霉菌侵染的面積高達150 000 hm2[9]，PRR 在全國呈蔓延趨勢[10]。

1.2 PRR 病原特征

大豆疫霉菌屬于卵菌綱疫霉屬，有至少59 個生理小種，還存在其他致病型[11]。 大豆疫霉菌菌落呈白色，形態(tài)均勻，主要以氣生菌絲的形式存在，幼齡期菌絲無隔多核，隨著生長變成分隔，菌絲體為多核[12]，老齡期形成結(jié)節(jié)狀或不規(guī)則的菌絲膨大體， 呈大小不等的橢圓形或球形。 大豆疫霉菌既可以通過產(chǎn)生孢子囊、游動孢子和厚垣孢子的形式進行無性生殖，又可以通過分化出卵原細胞和雄器進行有性生殖。卵孢子在適宜的條件下萌芽產(chǎn)生芽管， 并進一步發(fā)展成為菌絲、 孢子囊。 菌絲生長的最適溫度為25～28℃，最低5℃，最高35℃，因此PRR 在10℃時發(fā)病率最低，在25℃發(fā)病率最高[13]。 大豆疫霉菌在馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）上生長緩慢，在LBA、CA 和含有復(fù)雜營養(yǎng)元素的V8 培養(yǎng)基上生長較快[14]。

2 PRR 的發(fā)病特征

PRR 是典型的土傳性真菌病害， 在整個生育期均可發(fā)生， 并能為害大豆的任何部位， 引起種子腐爛、出苗前死亡和出苗后鉤壯期死亡[15]。 在種子萌發(fā)前，引起種子變褐腐爛；種子萌發(fā)后，引起大豆下胚軸系統(tǒng)性變褐腐爛；出苗后，近地根莖部出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，葉片變黃萎蔫，根莖變褐軟化，引起幼苗萎蔫或死亡，此時期是幼苗最易受侵染的時期；成株期受侵染植株表現(xiàn)為葉片由下部到上部逐漸變黃并萎蔫， 分枝基部發(fā)病出現(xiàn)黑褐色病斑， 莖中空易折斷，豆莢基部初期也會出現(xiàn)水漬狀病斑，最后種子失水干癟，籽粒萎縮，完全失去使用價值。

3 PRR 的防治

疫霉菌是一種能對大豆造成循環(huán)侵染的病害，其能在土壤中越冬， 待溫度濕度適宜時釋放孢子進行侵染[16]。 因此探索長期有效的防治方法尤為重要，目前主要有以下幾種防治措施。

3.1 栽培防治

防治PRR 最主要的栽培措施是控制土壤濕度[17]，對于低洼地塊可采用及時排水或高壟栽培進行管理[18]。 另外，由于大豆疫霉菌的游動孢子易通過水分進行傳播，尤其在土壤通透性和排水性降低時大豆疫霉病更易發(fā)生，因此可以通過更改耕作方式、疏松土壤、建立高效的排水系統(tǒng)來減輕根腐病的發(fā)生[19]。

3.2 化學(xué)防治

PRR 可為害大豆任何生育階段， 藥劑防治比較困難，但利用高效、低毒、低殘留的殺菌劑能達到短期防治效果[20]，常用的包括甲霜靈、精甲霜靈和惡霜靈，一般通過藥劑拌種的方法操作[21]，方法為在種子中加入種子質(zhì)量0.3%～25.0%的甲霜靈粉劑拌種。 由于甲霜靈能夠通過抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成從而對卵菌綱產(chǎn)生影響，因此是一種常用的高效殺菌劑。 藥劑噴霧處理也可有效控制病情，植株生長發(fā)育后期感病時可采用噴藥或澆灌的方式，可選用58%甲霜·錳鋅濕性粉劑600 倍液、69%安克·錳鋅可濕性粉劑900 倍液等[22]。 此外，將甲霜靈、烯酰嗎啉、霜脲氰和嘧菌酯兩兩復(fù)配形成的配比混合物， 也能顯著增強其對大豆疫霉的抑制[23]。

3.3 生物防治

生物防治與化學(xué)防治相比更加安全， 對環(huán)境污染小， 目前發(fā)掘的能有效防治PRR 的生物藥劑有“818”發(fā)酵液、45 mg/L 的Harpins 蛋白、恩益碧種衣劑[24]、嗜線蟲桿菌、亮盾種衣劑等，其中Harpins 蛋白[25]、嗜線蟲桿菌[26]、亮盾種衣劑[27]的防治效果最好。然而生物制劑控制病害見效較慢， 并且不易批量生產(chǎn)，因此不能作為主要防治措施。

3.4 培育抗耐病品種

由于殺菌劑、 田間排水等措施不能有效控制PRR，抗耐病的大豆不僅成本低廉，還有較強的控制作用， 因此培育和種植抗病品種是最為經(jīng)濟有效的方法[28-30]。 大豆與大豆疫霉菌的相互作用符合基因?qū)蚣僬f，疫霉具有高度遺傳變異的特點，抗病基因可完全抵抗病害， 但新的毒力小種的出現(xiàn)會導(dǎo)致抗病品種的抗性喪失[31-33]。 在我國，不同疫霉菌群體多樣性是復(fù)雜的，生產(chǎn)上為了延長品種的抗性年限，最為理想的是利用擁有多個抗性的單基因系品種。 目前研究表明， 河南大豆品種是優(yōu)質(zhì)的對PRR 具有抗性的種質(zhì)資源[34-35]，許多品種具有廣譜抗病性，其中大豆品種鄭97196 是國內(nèi)篩選到的優(yōu)異抗源之一，其對大豆疫霉菌株HeN35 表現(xiàn)為完全抗性[36-38]。

從以上幾種防治措施來看， 單一的方式都具有一定的缺點，比如田間管理成本較高，栽培措施不能從根本上控制病害； 化學(xué)防治中長期使用藥劑可能使大豆疫霉對其產(chǎn)生抗病性； 由于大豆疫霉的病原變異性高，品種的抗性不能一直持續(xù)。 因此，結(jié)合單一防控措施，多方位綜合治理，能夠有效控制PRR 的發(fā)生及蔓延。

3.4.1 PRR 抗性類型 大豆對PRR 的抗性有2 種，一種是受抗性基因（Rps）控制的小種?；剐裕址Q為質(zhì)量抗性，符合“基因?qū)颉奔僬f原理，大豆疫霉抗性基因（R）與無毒基因（Av）非親和互作，介導(dǎo)侵染部位的過敏性壞死反應(yīng) （Hypersensitive Response,HR） 和細胞程序性死亡 （Programmed Cell Death，PCD），從而阻止病原菌的定殖和擴展[3]；另一種是由多個基因（Quantitative Trait Loci,QTL） 控制的數(shù)量抗性，屬于非小種?；?，并且無法介導(dǎo)HR 反應(yīng)，該類型對疫霉菌病原體具有廣譜抗性， 但抗性較弱。 目前，質(zhì)量抗性為研究的重點[8]。

3.4.2 PRR 抗源篩選 抗性資源的篩選是防治PRR 的基礎(chǔ)，也是抗性研究的關(guān)鍵。 我國擁有豐富的大豆種質(zhì)資源，安徽、四川、湖北、江蘇存在的抗性資源較多[39]。 南方的大豆種質(zhì)抗性優(yōu)于北方，江蘇、河南、安徽的抗病資源更為豐富，黃淮海地區(qū)的抗性種質(zhì)資源最多[40-42]。 李永剛等用游動孢子接種法，利用7 個菌株對生產(chǎn)上常用的51 個大豆品種進行鑒定，對所有7 種供試毒性型均具有抗性的有9 個，占17.6%，均感病的有2 個，占3.9%[43]。任海龍等采用下胚軸傷口接種法用大豆疫霉菌株P(guān)m14 對南方部分地區(qū)江西、 湖南和廣西的273 份野生大豆資源進行篩選， 其中3.30%表現(xiàn)為抗病，16.48%表現(xiàn)為中間反應(yīng)類型[44]。 程艷波等采用下胚軸創(chuàng)傷接種法，利用大豆疫霉菌PGD1 菌株鑒定華南省份631 份大豆種質(zhì)資源對PRR 的抗性， 分析出能夠同時抗7 個不同毒力的大豆疫霉菌株的4 份種質(zhì)[45]。 黃婧通過224 份大豆微核心種質(zhì)對14 個菌株的抗性研究發(fā)現(xiàn)，有18 份種質(zhì)擁有最廣抗譜，能抗8～11 個不同的菌株[46]。楊曉賀等通過對13 個主栽品種進行大豆疫霉菌1 號小種的盆栽接種和大田接種抗性分析試驗， 發(fā)現(xiàn)合豐55 和墾豐16 具有良好的抗性，是適合三江平原地區(qū)種植的抗PRR 的優(yōu)良品種[47]。 劉淼等利用離體葉片接種法對黑龍江省的620 份野生大豆資源進行大豆疫霉菌1 號、3 號和4 號生理小種的抗病性鑒定，獲得雙抗資源23 份、三抗資源4 份[48]。

3.4.3 PRR 抗性基因發(fā)掘 目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)分別定位在9 條染色體上的30 個抗病基因：Rps1、Rps7、Rps9、the WaseshirogeRps gene、RpsYD25、RpsYD29、RpsUN1、RpsWY和RpsQ定位于3 號染色體；Rps2和RpsUN2定位于16 號染色體；Rps3、Rps8和RpsSN10定位于13 號染色體；Rps4、Rps5、Rps6、Rps12和RpsJS定位于18 號染色體；Rps10定位于17 號染色體；Rps11定位于7 號染色體；RpsYB30定位于19 號染色體；RpsZS18定位于2 號染色體；RpsSu定位于10 號染色體[49]。

R 蛋白、轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factors,TF）和小RNA 都能介導(dǎo)疫霉的抗性， 其中R 蛋白中的NBSLRR 基因基本上都聚集在Rps 位點上， 因此推測NBS-LRR 基因可能與抗PRR 有關(guān)。 Rps2 位點富含9 個NBS-LRR基因，從Rps1k 位點分離出4 個CCNBS-LRR型同源基因，Rps1k-1和Rps1k-2轉(zhuǎn)基因大豆植株能介導(dǎo)對大豆疫霉菌的抗性[50-51]。 與抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有WRKY 家族、MYB 家族、HSP 蛋白等， 其中WRKY 家族是主要的轉(zhuǎn)錄因子。 在高抗PRR 品種綏農(nóng)10 中，GmWRKY31 能與GmHDL56 共同作用調(diào)控抗病基因GmNPR1 的表達從而提高抗性[52]。 將一個新的乙烯響應(yīng)因子GmERF5 過表達，能夠增強轉(zhuǎn)基因大豆對疫霉菌的抗性[53]。 小RNA 包括miRNAs 和siRNAs，miRNA 參與大豆對大豆疫霉菌所有的抗病類型[54]，在大豆被侵染的根中由于熱失活誘導(dǎo)產(chǎn)生的miR393 和miR166 共同參與大豆的基礎(chǔ)防御反應(yīng)[55]。 另外gma-miR1507a 能通過調(diào)節(jié)靶基因GmRGA4的表達來調(diào)控大豆對大豆疫霉菌的抗性[56]。小RNA 在大豆抗疫霉根腐病中也起著重要的作用，為大豆抗性育種提供了新的方向。

4 展望

PRR 對大豆生產(chǎn)危害性極大， 雖然目前對病癥的研究愈加重視，但仍有許多問題需要解決。 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面的防治工作主要是加強田間管理和利用一些殺菌劑，但生產(chǎn)上工作量繁重，殺菌劑藥效期有限，并且傳統(tǒng)育種上的常規(guī)方式防治病害缺陷較大。 因此近些年越來越多的研究傾斜于基因育種。 栽培抗性大豆是其中一種防治措施， 通過遺傳學(xué)分析已定位、鑒定出30 個抗性位點基因，并且對于抗性的基因組學(xué)、小RNA 及蛋白質(zhì)組學(xué)方面也進行了深入的研究。 還有一個重要的工作是基因功能驗證，由于大豆遺傳轉(zhuǎn)化較難，主要是利用大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化、VIGS和CRISPR/Cas9 體系進行基因功能鑒定， 遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)需要更加穩(wěn)定、高效。目前PRR 抗性研究的瓶頸主要是關(guān)于基因組學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、小RNA 及表觀遺傳組學(xué)等方面共同串聯(lián)， 植物激素傳導(dǎo)及代謝通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也很復(fù)雜，需要進一步深入研究。