基于“肝主疏泄”調(diào)控RPE細(xì)胞自噬探討從虛瘀同治角度論治干性黃斑變性的機制*

張昭,董洋,王莉,梁鳳鳴

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/國家中醫(yī)針灸臨床研究中心,天津 300193; 2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院濟南醫(yī)院,山東 濟南 250002

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是55歲以上人群中心視力喪失的主要原因,常累及患者黃斑結(jié)構(gòu)和功能,其典型病理特征為細(xì)胞外沉積物(玻璃膜疣、基底線/板狀沉積),可顯現(xiàn)新生血管或萎縮。流行病學(xué)報告,我國AMD患者總數(shù)已超過500萬,本病已成為我國防盲治盲和公共衛(wèi)生工作的重點[1-2]。AMD分為早、中、晚三期,晚期又分為滲出性(濕性)和萎縮性(干性)兩類,最終分別演變?yōu)楸P狀瘢痕及地圖樣萎縮[3]。目前,抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為濕性AMD的一線治療藥物已得到廣泛認(rèn)可,但對干性AMD病變進(jìn)展仍無行之有效的干預(yù)療法。研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞自噬不足在AMD發(fā)病中起到至關(guān)重要作用,提出干性AMD自噬靶向治療研究[4]。中醫(yī)認(rèn)為,“肝主疏泄”推動全身氣血津液運行,促進(jìn)瘀積產(chǎn)物排泄的過程與RPE細(xì)胞自噬過程一致,是人體維持正常代謝的關(guān)鍵一步。所以,基于“肝主疏泄”理論分析RPE細(xì)胞自噬功能或為中醫(yī)藥治療干性AMD提供新思路和新靶點。

1 “肝主疏泄”是干性AMD發(fā)生發(fā)展的理論基礎(chǔ)

肝主疏泄功能正常對其他臟腑至關(guān)重要,如《雜病源流犀燭·肝病源流》所述:“肝和則生氣,發(fā)育萬物,為諸臟之生化?！备螝馍l(fā),諸臟之氣生升有由,則氣血沖和,五臟安定,生機不息。從生理方面分析,“發(fā)生之紀(jì),是謂啟陳,土疏泄,蒼氣達(dá),陽和布化,陰氣乃隨,生氣淳化,萬物以榮”(《素問·五常政大論》)。從病理方面分析,“人之五臟,惟肝易動難靜。其他臟有病,不過自病……惟肝一病,即延及他臟”(《知醫(yī)必辨》)。筆者認(rèn)為,肝疏通暢達(dá),宣泄升發(fā)才能使氣血津液運行通暢,代謝產(chǎn)物而不致瘀積;若肝失疏泄則百病由生。

1.1 “肝主疏泄”釋義“疏泄”一詞最早見于《素問·五常政大論》,朱丹溪《格致余論》提出:“主閉藏者腎也,司疏泄者肝也?！备沃魇栊沟闹行沫h(huán)節(jié)是調(diào)暢氣機,具體包括維持氣血津液輸布、協(xié)調(diào)脾升胃降、調(diào)暢氣機、促進(jìn)膽汁分泌等[5]。肝主疏泄是人一身之氣正常運行的重要調(diào)控環(huán)節(jié),亦是人體一切生命活動的基礎(chǔ)。肝失疏泄則導(dǎo)致氣血津液運行失常等各種生理機能障礙。從微觀看,細(xì)胞是最基本的功能單位,人體所有生理機能障礙皆與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)能量代謝失常有關(guān)。自噬作為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)代謝的重要環(huán)節(jié),該功能過度激活或抑制會影響細(xì)胞生理功能。因此,“肝主疏泄”與細(xì)胞自噬具有很大相似性,肝失疏泄的病機變化勢必會在細(xì)胞層面得以體現(xiàn)[6]。由此可見,自噬是肝主疏泄在微觀層面的具體體現(xiàn),肝主疏泄又是人體能量代謝平衡的先決條件。

1.2 “肝失疏泄”是干性AMD發(fā)生的重要原因中醫(yī)并無“AMD”這一病名,根據(jù)癥狀體征,將其歸為“視瞻昏渺”范疇。視瞻昏渺是因虛致病,本虛標(biāo)實,虛實錯雜的疾患,按病因可分為虛實兩類:虛證者多因勞思竭視,耗傷氣血,或肝腎虧虛,目失濡養(yǎng),或陰虛火炎,灼爍津液以致神光暗淡。實證者多為內(nèi)生痰瘀遮蔽神光致使目昏不明?！端貑枴そ饏T真言論》曰:“目受血而能視?！庇帧案螝馔ㄓ谀?肝和則目能辨五色”(《靈樞·脈度》)?！稄埵厢t(yī)通》則云:“氣不耗,歸精于腎而為精,精不泄,歸精藏于肝而化清血?！北静〔∥辉谝曇?與肝腎二臟密切相關(guān)。玻璃膜疣為干性AMD的特征性表現(xiàn),RPE細(xì)胞老化,自噬功能下降,補體系統(tǒng)被激活,脂褐質(zhì)、補體膜攻擊復(fù)合物和炎癥物質(zhì)沉積于RPE細(xì)胞基底層,玻璃膜疣形成,AMD病情進(jìn)一步加重[7]。中醫(yī)認(rèn)為,玻璃膜疣為氣血虛弱,肝腎虧虛,機體功能衰老的病理產(chǎn)物,屬于“瘀結(jié)”,治療時應(yīng)采用補虛兼化瘀之法[8]。肝主疏泄功能正常,血行通暢目竅才能視物,瘀積清除神光方可發(fā)越。由此可見,從“虛瘀同治”論治視瞻昏渺,或可成為中醫(yī)治療干性AMD的關(guān)鍵所在。

2 “肝失疏泄”是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞自噬不足的重要前提

中醫(yī)藏象學(xué)說對眼科臨床具有指導(dǎo)意義。眾所周知,“五藏”絕非等同于西醫(yī)實體器官的“五臟”,中醫(yī)的藏象學(xué)說與細(xì)胞結(jié)構(gòu)實質(zhì)上是一種“微觀”與“宏觀”相結(jié)合的學(xué)說。隨著中醫(yī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)前沿的細(xì)胞生物學(xué)相結(jié)合,中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論實現(xiàn)真正意義上的融合,如藏象之肝、腎、脾、分別與配體-受體-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、染色體、線粒體對應(yīng)[9-11]。研究發(fā)現(xiàn),“肝”在宏觀層面是神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng),在細(xì)胞層次即為配體-受體-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[12]。神經(jīng)末梢釋放的遞質(zhì)和內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的激素,從根本上說都屬于細(xì)胞信號,它作用于靶細(xì)胞受體,激活細(xì)胞內(nèi)的第二信號系統(tǒng),進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)一系列特異性生理應(yīng)激改變,集體應(yīng)激改變則形成宏觀的生理進(jìn)程。肝體陰而用陽,司疏泄,具有啟迪諸臟,調(diào)暢氣機的作用。這與在細(xì)胞間傳遞信息的神經(jīng)遞質(zhì)、激素作用特點相似,起著激發(fā)和調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生理功能的作用?？梢?無論從細(xì)胞生物學(xué)還是中醫(yī)理論分析,視網(wǎng)膜作為神經(jīng)系統(tǒng)一部分自然受“肝主疏泄”調(diào)控。

龐贊襄老先生認(rèn)為:“人之臟腑……五官九竅皆非實體,而內(nèi)涵脈道孔竅,氣血循環(huán)往來其中。”“目乃九竅之一,皆賴氣血以滋養(yǎng),然氣血以和暢為順,少有怫郁,則目病叢生?！闭Ｇ闆r下,氣機運行,氣載津血,津血因氣而運,三者相互維系,循環(huán)不已。肝經(jīng)的玄府暢通,肝氣即可上升,目中即有主宰,五臟之精,各展其用,終能分辨五色。若肝失疏泄,厥陰經(jīng)絡(luò)玄府瘀閉,一方面,導(dǎo)致機體生成的營養(yǎng)物質(zhì)無以充養(yǎng)目竅,視衣功能活動減退;另一方面,網(wǎng)膜水液輸布異常使得痰濁、血瘀等病理產(chǎn)物沉積而形成玻璃膜疣。痰濁血瘀等病理產(chǎn)物的存在,進(jìn)一步阻礙氣血津液的正常運行,繼續(xù)加重細(xì)胞自噬不足狀態(tài),形成疾病虛實夾雜的惡性循環(huán)。

3 自噬不足是干性AMD發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志

自噬指溶酶體對細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)以及受損細(xì)胞器進(jìn)行降解、重新利用的過程。自噬分小自噬、大自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬,其中大自噬是RPE細(xì)胞自噬的主流。自噬通過清除細(xì)胞質(zhì)內(nèi)已經(jīng)受損的細(xì)胞器以及代謝產(chǎn)物,重構(gòu)亞細(xì)胞水平,使細(xì)胞處于健康狀態(tài),并對受損的細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)[13]。RPE細(xì)胞有典型的自噬能力,起到“清道夫”作用,其自噬活性降低可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜異常蛋白及脂褐素的積累,引發(fā)活性氧產(chǎn)生和蛋白質(zhì)聚集。這些物質(zhì)不僅導(dǎo)致脂褐素形成,同時激活炎癥反應(yīng),加速細(xì)胞衰老,進(jìn)一步加快AMD進(jìn)程[14]。自噬與干性AMD的關(guān)系具體歸納如下。

3.1 自噬、免疫炎癥反應(yīng)與干性AMD研究表明,諸如炎癥小體生成,補體途徑等免疫炎癥反應(yīng)參與了干性AMD的病理進(jìn)程[15]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor containing pyrin domain 3,NLRP3)是由凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD domain,ASC)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific protease-1,Caspase-1)共同組成的多蛋白復(fù)合物。生理條件下,當(dāng)RPE細(xì)胞受危險信號刺激時,NLRP3可通過ASC招募Caspase-1,并使其成熟,最后誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18分泌,促進(jìn)炎癥的發(fā)生,造成細(xì)胞凋亡。玻璃膜疣本質(zhì)上是細(xì)胞外的顆粒蛋白質(zhì)聚集體,亦是NLRP3介導(dǎo)的無菌炎癥反應(yīng)的激活劑。自噬作為一種免疫機制能調(diào)節(jié)免疫炎癥首先體現(xiàn)在去除NLRP3激活因子,減輕炎癥小體激活和炎性反應(yīng)[16]。自噬也可以通過保護(hù)線粒體完整性,減少線粒體DNA向胞漿釋放,進(jìn)而抑制NLRP3激活[17]。

3.2 自噬、氧化應(yīng)激與干性AMD自噬可以通過調(diào)控脂褐素沉積等病理改變減輕RPE細(xì)胞損傷,進(jìn)而延緩疾病進(jìn)程。正常生理條件下,RPE細(xì)胞需要大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)滿足代謝及信號通路需求,抗氧化酶如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等維持細(xì)胞內(nèi)ROS的生成與清除平衡。而黃斑區(qū)匯集網(wǎng)膜最高血流量,這使該區(qū)RPE細(xì)胞始終處于高危環(huán)境中,一旦氧化應(yīng)激失衡,ROS產(chǎn)生過多或抗氧化酶活性下降即會造成RPE細(xì)胞損傷,進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)病理改變。Baek等[18]研究發(fā)現(xiàn),自噬和氧化應(yīng)激相互影響與暴露時間相關(guān),如短期暴露在低劑量氧化應(yīng)激條件下,RPE自噬水平顯著提升以清除氧化損傷的細(xì)胞器;相反,慢性氧化應(yīng)激會使自噬水平下降,穩(wěn)態(tài)無法維持,同時自噬的下調(diào)使RPE細(xì)胞更易受氧化應(yīng)激影響而凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致AMD發(fā)生。此外,氧化應(yīng)激能產(chǎn)生脂褐素,其主要成分為N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(N-retinyliden-N-retinylethanolamine,A2E)。張晶晶等[19]發(fā)現(xiàn),A2E會刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19細(xì)胞)分泌多種AMD相關(guān)炎癥因子和新生血管因子,誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的自噬?？梢?在氧化應(yīng)激的過程中,自噬能通過抑制ROS的產(chǎn)生延緩本病發(fā)生。

雷帕霉素靶向蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路是RPE細(xì)胞自噬調(diào)控的重要信號通路。生理條件下,活化的mTORC1抑制自噬的發(fā)生,當(dāng)細(xì)胞受到營養(yǎng)不足、缺氧、氧化應(yīng)激等不利因素刺激下,mTORC1就會啟動自噬發(fā)生。PI3K/ AKT信號是自噬負(fù)調(diào)控因子,位于mTOR分子的上游,當(dāng)自噬啟動后,早期自噬小體膜形成。而自噬體膜封存依賴于微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3),LC3-Ⅱ 則為自噬活性的重要標(biāo)志分子[20]。LC3-Ⅱ特異性招募p62參與對自噬底物的選擇,泛素結(jié)合蛋白p62有一個特殊的區(qū)域命名為LC3識別序列。p62作為自噬特異性下游底物被自噬-溶酶體通路降解,降解過程通過與LC3相互作用實現(xiàn)[21]。p62又通過信號傳導(dǎo)選擇自噬受體,對自噬效應(yīng)調(diào)控。本課題組正以RPE細(xì)胞自噬為切入點,對RPE細(xì)胞活力、信號通路蛋白mTOR、自噬標(biāo)志性蛋白LC3、上游因子PI3K/Akt、下游底物p62等相關(guān)因子表達(dá)進(jìn)行對照研究,觀察對RPE細(xì)胞自噬功能的靶向保護(hù)作用,以期探明杞黃顆粒治療干性AMD的理論依據(jù)。

4 中醫(yī)藥調(diào)節(jié)自噬功能治療干性AMD

《證治準(zhǔn)繩》認(rèn)為:“若年過五十意外而昏者……天真日衰,自然目光漸謝?！贝颂幪煺婕礊槟I之精氣。而肝腎同處下焦,腎藏精,肝藏血,血從精化,是謂“乙癸同源”。若肝腎之精日漸衰微,視衣失其所養(yǎng),則視瞻功能減退。西醫(yī)認(rèn)為,RPE細(xì)胞代謝和衰老與AMD密切相關(guān),而RPE生理功能正常依賴視網(wǎng)膜血供維持營養(yǎng)所需?！皟?nèi)五輪學(xué)說”認(rèn)為,RPE屬于腎[22],同時“肝主藏血,肝受血而能視”,故治療本病應(yīng)注意“補虛化瘀”。筆者認(rèn)為,肝體陰而用陽主動,腎主陰水而主靜,肝陰腎水即為一體,而“肝主疏泄”,氣血上注于目,因而明目必先養(yǎng)血柔肝。而肝疏泄條達(dá)依賴于腎水的滋養(yǎng)[23],木得水養(yǎng),則疏泄有度,氣機暢達(dá),目中玄府通利,氣血津液上承目竅,神光方可發(fā)越無阻,實現(xiàn)“肝氣和則目能辨五色”。

杞黃顆粒是梁鳳鳴教授治療AMD的經(jīng)驗復(fù)方,主要成分為枸杞子、楮實子、茺蔚子、丹參等,具有補益肝腎、化瘀祛痰之功。本課題組分別于2000年制成口服液“枸杞明目液”,2005年制備成“枸杞明目方”免煎劑院內(nèi)協(xié)定處方,之后進(jìn)一步改變劑型為杞黃顆粒,處方藥物組成保持不變;并從臨床療效、視網(wǎng)膜光損傷病理、CFH基因多態(tài)性及VEGF上下游調(diào)控因子等多方面進(jìn)行研究[24-28],顯示該藥對于干性AMD治療效果明顯優(yōu)于濕性AMD。全方配伍精當(dāng),標(biāo)本兼治,切中視瞻昏渺虛實夾雜之特點,或可成為治療本病發(fā)生發(fā)展、提高患者視力水平的選擇。

5 結(jié)語

干性AMD發(fā)病率高,因其表現(xiàn)為中心視力進(jìn)行性損害,不易引起人們重視。若病情進(jìn)展至晚期會對患者的視力健康和生活質(zhì)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前,臨床并無公認(rèn)的治療干性AMD的藥物,臨床普遍推薦使用抗氧化維生素和礦物質(zhì)等,但療效欠佳。RPE細(xì)胞自噬不足與AMD發(fā)病關(guān)系密切,自噬機制及其靶向干預(yù)成為治療干性AMD研究的前沿?zé)狳c?；谛枨髮?dǎo)向及中醫(yī)藥治療干性AMD的臨床優(yōu)勢,筆者總結(jié)幾代師承經(jīng)驗,應(yīng)用杞黃顆粒方(駐景丸加減方化裁)積累了比較扎實的臨床基礎(chǔ)和良好的研究基礎(chǔ)。在未來,課題組結(jié)合“肝主疏泄”的中醫(yī)理論基礎(chǔ),切中本病“虛中夾瘀”之病機,擬通過藍(lán)光誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜損傷及RPE細(xì)胞自噬功能損傷,觀察中藥復(fù)方對RPE細(xì)胞mTOR自噬通路的干預(yù)機制,進(jìn)一步闡明杞黃顆粒治療干性AMD的科學(xué)理論,以期更好地服務(wù)于臨床。