葫蘆巴葉綠體基因組密碼子偏好性分析

摘要： 為探究葫蘆巴（Trigonella foenum-graecum L.）葉綠體基因組密碼子的使用偏好性，利用Codon W 1.4.2和在線軟件CUSP對篩選到的50條蛋白質(zhì)編碼序列密碼子進行分析。結(jié)果表明：葫蘆巴葉綠體基因組密碼子末位堿基以A/U為主，GC含量僅為26.25%。ENC取值范圍為35.05～53.66，且ENC值＞45的有20個，說明葫蘆巴大部分基因編碼序列的密碼子偏性較強。RSCU≥1的密碼子有30個，其中16個以U結(jié)尾、13個以A結(jié)尾。中性繪圖分析、ENC-plot分析及PR2-plot偏倚分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葫蘆巴葉綠體基因組密碼子使用偏好性受到突變壓力等多種因素的影響，主要因素為自然選擇。最終篩選出GCU，AGA，CGU等21個密碼子為最優(yōu)密碼子。

關(guān)鍵詞： 葫蘆巴；葉綠體基因組；密碼子偏好性；選擇；最優(yōu)密碼子

中圖分類號S681.9 """文獻標識碼：A """"文章編號： 1007-0435（2024）02-0409-10

Analysis of Codon Bias in Chloroplast Genome of Trigonella Foenum-graecum

DU Ming-chuan1， WANG Wei2， BAO Hai-juan1， GE Cuo1， ZHANG Rui1， WANG Jiu-li1， LIU Jing1*

（1. College of Ecological Environment and Resources， Qinghai Minzu University， Qinghai Provincial Key Laboratory of Highvalue

Utilization of Characteristic Economic Plants， Kairui Graduate Workstation of Medicinal Plant Resources of Qinghai Minzu

University， Xining， Qinghai Province 810000， China; 2 Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810000， China）

Abstract： In order to explore the codon usage bias of chloroplast genome in Trigonella foenum-graecum，Codon W 1.4.2 and online software CUSP were used to analyze the codons of 50 protein coding sequences. The results showed that the base at the end of the chloroplast genome codon of Trigonella foenum-graecum was mainly A/U，and the GC content was only 26.25%. The ENC value ranged from 35.05 to 53.66，and there were 20 ENC valuesgt;45，indicating that the codon bias of most gene coding sequences of Trigonella foenum-graecum was strong. There were 30 codons with RSCU≥1，of which 16 end with U and 13 end with A.The results of neutral mapping analysis，ENC-plot analysis and PR2-plot bias analysis showed that the codon usage bias of the chloroplast genome of Trigonella foenum-graecum was affected by many factors such as mutation pressure，and the main factor was natural selection. Finally，21 codons such as GCU，AGA，CGU were selected as the optimal codons.

Key words： Fenugreek；Chloroplast genome;Codon bias;Selection;Optimal codons

葫蘆巴（Trigonella foenum-graecum L.）為豆科葫蘆巴屬一年生草本植物，又名蕓香草、香草、香苜蓿、蘆巴子等，被稱為希臘干草，是豆科最古老的藥用植物之一。葫蘆巴原產(chǎn)于西亞、南歐和地中海地區(qū)，漢朝時作為香料傳入中國，目前在我國大部分地區(qū)均有不同程度的分布［1］。葫蘆巴全株可入藥，含氨基酸、黃酮類、生物堿類、甾體皂苷類等化學成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等功效［2］。此外，葫蘆巴具有較高的飼用價值。前人研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.10 %葫蘆巴提取物對斷奶仔豬有誘食效果，能改善機體抗氧化功能、降低血糖水平和保護腎臟［3］。Begum等［4］研究表明，飼料中添加葫蘆巴籽提取物提高了斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，降低了糞便中的有毒氣體排放。飼喂葫蘆巴日糧改善了牛奶中功能性脂肪酸的分布，降低了膽固醇濃度，增加了功能性脂肪酸［5］。在熱應激山羊的飼料中添加葫蘆巴籽，可以提高山羊的產(chǎn)奶量，改善其抗氧化能力及血液學和生理指標［6］。黃羽肉雞飼料中添加葫蘆巴提取物，能夠改善雞肉風味，提升肉品質(zhì)，增強抗應激能力［7］。

葉綠體是植物重要的細胞器，為植物生命活動提供能量，同時擁有相對獨立的遺傳體系，可進行半保留復制［8-9］。上世紀60年代初，首先在煙草（Nicotiana tabacum）和地錢（Marchantia poly-morpha）中獲得葉綠體全基因組序列，目前已有超過1 000種物種的葉綠體基因組全序列被公布［10-11］。相對于核基因組，葉綠體基因組具有大小適中、結(jié)構(gòu)相對保守、簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）位點豐富、堿基變異速率適中、易于提取純化等優(yōu)勢，被廣泛應用于植物起源、物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育進化等研究［12-14］。Kim等［15］研究發(fā)現(xiàn)，rpo B-rpo A（2）和ycf 2-trn L-CAA序列可作為越桔屬（Vaccinium）的DNA條形碼。Zhao等［16］利用葉綠體基因組對蝙蝠草（Christia vespertilionis）進行比較和系統(tǒng)發(fā)育分析。Huang等［17］研究了須彌葛（Haymondia wallichii）葉綠體全基因組及其在豆科中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，表明了須彌葛與粉葛（Pueraria thomsonii）和野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的親緣關(guān)系較近。

密碼子是生命信息的基本遺傳單位，在遺傳信息表達的過程中，起到了紐帶的作用［18］。自然界共存在64種密碼子，除三種終止密碼子外，即UAG，UAA和UGA，其余61種密碼子編碼20種氨基酸，除蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）外，其余氨基酸均對應2個及以上的同義密碼子（Synonymous codon），即編碼同一氨基酸的不同密碼子［19］。在蛋白質(zhì)的編碼過程中，同義密碼子的使用存在偏好性，稱為密碼子的使用偏好性［20］。同義密碼子使用偏好性受到多種因素的影響，如自然選擇、選擇-突變-遺傳漂變模型、基因的堿基組成、tRNA的豐度等因素［21-22］。研究某物種的密碼子使用偏好性，設(shè)計外源基因表達載體時根據(jù)最優(yōu)密碼子進行優(yōu)化，可以提高外源基因在葉綠體基因組中的表達量［23］。周宗梁等［24］根據(jù)水稻密碼子使用偏好性對cry1Ah1基因進行優(yōu)化，提高了Cry1Ah蛋白平均表達量。韓嵐等［25］根據(jù)植物密碼子使用偏好性設(shè)計并人工合成了納豆激酶基因sNKi，并在不同成熟時期的番茄果實中實現(xiàn)了瞬時表達。

目前，已在蒜頭果（Malania oleifera）［26］、安龍油果樟（Syndiclis anlungensis）［21］、降香黃檀（Dalbergia odorifera）［22］、白羊草（Bothriochloa ischaemum）［27］、厚殼紅瘤果茶（Camelliarubituberculata）［28］等植物中開展了葉綠體基因組密碼子偏好性的研究。但是在葫蘆巴中的研究尚未見報道。本研究采用中性繪圖、ENC-plot繪圖及PR2-plot繪圖等方法，分析了葉綠體葫蘆巴基因組蛋白質(zhì)編碼區(qū)（Coding DNA sequence，CDS）序列的堿基組成，以確定葫蘆巴密碼子使用偏好的主要影響因素，并確定了葫蘆巴葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子，旨為葫蘆巴遺傳改良和育種等研究提供科學的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載葫蘆巴葉綠體基因組序列（Genbank登錄號為：MN736956.1；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN736956.1），共獲得到76條CDS序列。剔除重復基因、長度小于300 bp、非ATG作為起始密碼子、CDS內(nèi)部存在終止密碼子及終止密碼子異常的序列后，獲得50條蛋白編碼區(qū)序列作為研究對象用于后續(xù)分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 密碼子組成分析 ""將篩選得到的50條CDS序列作為研究對象，使用CodonW 1.4.2對葫蘆巴葉綠體基因組的50條編碼序列進行分析，獲得各CDS序列的同義密碼子相對使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）和有效密碼子數(shù)（Effective number of codons，ENC），利用在線軟件CUSP（http：//emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）分析密碼子三個位置的GC含量（GC1，GC2，GC3）及GC平均含量（GCall），并運用SPSS和EXCEL軟件對結(jié)果進行分析。

ENC常被用來評估同義密碼子使用偏好性程度，其取值范圍在20～61之間，ENC值45為分界點，值越小偏倚性越強，值越大偏倚性越弱［22］。RSCU為某個密碼子實際使用頻率與理論頻率的比值；RSCU = 1，表明該密碼子沒有使用偏好性；RSCU＞1，表明該密碼子的使用頻率高于預期，反之則表明該密碼子出現(xiàn)的頻率低于其他同義密碼子［29］。

1.2.2 中性繪圖分析 ""中性繪圖被用來分析密碼子使用偏好性的影響因素［30］?？v坐標為GC12含量（GC1與GC2平均值），GC3含量為橫坐標，圖中每一個散點代表一個基因。若回歸系數(shù)接近于1，且圖中所有散點均沿對角線分布，說明密碼子的堿基組成相似，表示密碼子偏好性主要受突變壓力的影響。反之則表示其偏好性受選擇壓力的影響較大。結(jié)合SPSS對密碼子堿基組成進行相關(guān)性分析，進一步判斷影響葫蘆巴葉綠體基因組密碼子偏好性的主要因素，當GC12與GC3無相關(guān)性時，說明密碼子前兩位在堿基組成上與第三位存在較大差異，選擇壓力為偏好性的主要影響因素；反之，則說明突變壓力對密碼子使用偏性的影響較大［26］。

1.2.3 ENC-plot繪圖分析 ""ENC-plot圖包括標準曲線及散點圖。散點圖分別以ENC和GC3為縱、橫坐標；標準曲線的公式為ENC=2+GC3+29/［GC23+（1-GC3）2］，其代表無選擇壓力存在時，基因的核酸序列決定密碼子偏好性［17］。具體判斷標準為圖中散點與標準曲線的距離，兩者距離較近則主要影響因素為堿基組成，反之主要影響因素為選擇壓力［31-32］。同時，需要結(jié)合ENC比值頻數(shù)分布情況準確區(qū)分選擇壓力和中性突變對密碼子偏好性的影響程度，以-0.05～0.05區(qū)間為界限［33］。

1.2.4 "PR2-plot繪圖分析 ""PR2-plot繪圖分析用于揭示核苷酸組成的影響因素，圖的橫、縱坐標分別為G3/（G3+C3）和A3/（A3+T3）。圖的中心點表示A=T，C=G，代表密碼子偏好性不受選擇壓力的影響，其余各點與中心點的矢量距離表示其偏倚方向和程度［34］。

1.2.5 最優(yōu)密碼子的確定 ""將葫蘆巴葉綠體基因組篩選后得到的基因序列的ENC值從高到低進行排序，并在最低值和最高值兩端各選擇10%基因，用于構(gòu)建高低表達數(shù)據(jù)庫，利用CodonW 1.4.2計算RSCU值和ΔRSCU（高低表達數(shù)據(jù)庫之間的差值），將滿足ΔRSCU≥0.08，且RSCU＞1的密碼子確定為最優(yōu)密碼子［35］。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子的堿基組成

對葫蘆巴葉綠體基因組編碼序列進行堿基組成分析（表1），GC1（密碼子第一位堿基GC含量）、GC2（密碼子第二位堿基GC含量）、GC3（密碼子第三位堿基GC含量）的分布范圍分別在28.57%～57.14%，28.52%～18.56%，28.57%～33.83%之間，GC含量在密碼子的3個位置上的分布頻率不同，且平均值為GC1 （46.31%）＞GC2（38.62%）＞GC3（26.25%）。其中，GCall（密碼子總GC含量）為37.06%，與GC2相差不大；GC3的平均值最小，選擇壓力最大，具有明顯A/U偏向性。密碼子數(shù)量主要分布在100～2 000之間，rps14數(shù)量最少，為101，ycf2數(shù)量最多，為2 140。由表1可知，表示偏倚性強弱的ENC值的范圍在33.02～53.66之間，平均值為44.12，有20個基因的ENC值大于45，表明葫蘆巴葉綠體基因組密碼子偏性較強。

葫蘆巴葉綠體基因組密碼子各位置GC含量、密碼子數(shù)（N）、ENC值相關(guān)性分析（表2）。結(jié)果表明GCall和GC1、GC2、GC3極顯著相關(guān)，GC1和GC2呈極顯著相關(guān)，但GC3與GC1、GC2顯著性較差，說明葫蘆巴密碼子前兩位的堿基組成相似，且與第3位存在較大差異。ENC與GC1相關(guān)性顯著，與GC2無相關(guān)性，與GC3達極顯著相關(guān)，表明ENC受密碼子第1位和第3位堿基組成的影響。密碼子數(shù)（N）與ENC相關(guān)系數(shù)為0.292，呈顯著相關(guān)，說明密碼子使用偏好性在一定程度上受基因編碼序列長度影響。

對葫蘆巴葉綠體基因組整體的同義密碼子相對使用度（RSCU）進行分析（圖1），結(jié)果顯示葫蘆巴編碼序列包含64種密碼子。其中，編碼Ile的密碼子AUU數(shù)量最多，為919個，編碼Ter的密碼子UAG數(shù)量最少，僅有6個。葫蘆巴葉綠體基因組密碼子中有30個RSCU≥1，其中有29個以A/U結(jié)尾，占比97%，具有明顯的A/U偏向性。

2.2 中性繪圖分析

中性圖分析是用來解釋自然選擇和突變壓力對密碼子偏好性的影響程度。當回歸系數(shù)接近1時，突變壓力為主要影響因素，當回歸系數(shù)接近0時，選擇壓力起到主要作用［36-37］。由圖2可知，GC12與GC3回歸系數(shù)為0.358，相關(guān)系數(shù)為0.1761，說明GC12 和GC3之間的相關(guān)性很弱，表明葫蘆巴葉綠體基因組密碼子的前兩位堿基與第3位在進化方式、堿基組成等方面存在差異，基因組中的GC含量高度保守，第3位的GC含量較低。葫蘆巴葉綠體編碼序列的基因，全部位于對角線上方，且大部分基因與對角線距離較遠，僅有2個基因離對角線較近，涉及保守假設(shè)性葉綠體ORF和包膜膜蛋白兩種功能。表明葫蘆巴葉綠體基因組密碼子偏好性以受自然選擇的影響為主。

2.3 ENC-plot繪圖分析

ENC-plot繪圖分析（圖3）表明GC3值分布較為集中，僅有2個NADH脫氫酶亞基基因位于標準曲線上，涉及ATP合成酶亞基、細胞色素c基因、核糖體大亞基蛋白三種功能中的3個基因與標準曲線距離較近，大部分基因落在曲線下方較遠的位置上。說明葫蘆巴密碼子偏好性的主要影響因素為選擇壓力。為進一步檢驗基因與標準曲線的距離，統(tǒng)計了葫蘆巴葉綠體基因ENC比值頻數(shù)分布情況（表3），僅有9個基因分布在-0.05～0.05區(qū)間內(nèi)；其余41個基因均分布在-0.05～0.05區(qū)間之外，占基因總數(shù)的82%，這部分基因距離標準曲線較遠。進一步表明選擇壓力為葫蘆巴密碼子使用偏好性的主要影響因素，而突變壓力的影響較弱。

2.4 PR2-plot繪圖分析

葫蘆巴葉綠體基因組密碼子偏倚分析如圖4所示。PR2平面圖中4個區(qū)域的散點并非均勻分布，表明突變不是唯一影響因素。圖中涉及RNA聚合酶亞基和NADH脫氫酶亞基兩種功能中的2個基因距離PR2平面圖的中心部位最近，表明其偏向程度較小，主要受到突變的影響。RuBisCO酶大亞基全部基因均落于PR2平面圖的右下方（即G3＞C3，T3＞A3）。而大部分基因，包括：乙酰輔酶A羧化酶、光合系統(tǒng)I亞基、細胞色素c基因、包膜膜蛋白、成熟酶全部基因以及保守假設(shè)性葉綠體ORF、核糖體小亞基蛋白、ATP合成酶亞基、細胞色素b/f復合體亞基、NADH脫氫酶亞基、光合系統(tǒng)II亞基、RNA聚合酶亞基的部分基因均落于PR2平面圖的右下方，說明在堿基的使用頻率方面G3＞C3、T3＞A3，且4個堿基的使用頻率存在差異。綜上，葫蘆巴葉綠體基因組密碼子偏好性除了受到選擇壓力的影響，同時還會受到突變壓力的影響。

2.5 最優(yōu)密碼子的確定

運用Codon W 1.4.2軟件，構(gòu)建葫蘆巴葉綠體基因組的高低表達基因庫，并計算兩個基因庫的RSCU值，結(jié)果表明（表4），有GCU，AGA等21個密碼子ΔRSCU≥0.08，且均為高表達優(yōu)越密碼子（表4中用*表示），其中8個以A結(jié)尾，13個以U結(jié)尾。將RSCU值≥1的密碼子作為高頻密碼子，共32個。將同時滿足RSCU≥1和ΔRSCU≥0.08的密碼子作為最優(yōu)密碼子，最終確定了葫蘆巴葉綠體基因組的21個最優(yōu)密碼子（GCU，AGA，CGU，AAU，GAU，UGU，CAA，GAA，GGU，CAU，AUA，UUA，AAA，UUU，CCU，AGU，UCU，ACA，ACU，GUA，GUU），其中8個以A結(jié)尾，13個以U結(jié)尾。表明葫蘆巴葉綠體基因組偏好使用A/U結(jié)尾的密碼子，這與GC3和RSCU分析結(jié)果一致。因此，在利用葫蘆巴葉綠體基因工程設(shè)計外源基因載體時，選用以A/U結(jié)尾的密碼子可以提高外源基因的表達轉(zhuǎn)化效率。

3 討論

3.1 葫蘆巴葉綠體基因密碼子的特征

密碼子偏好性是指同義密碼子的使用頻率不同，這種現(xiàn)象普遍存在于植物體中，引起這種現(xiàn)象的原因有很多，其中堿基組成是最常見的因素［38］。中性進化理論認為堿基的第1位和第2位發(fā)生變化會引起編碼氨基酸的改變，而第3位發(fā)生變化則不會使所編碼的氨基酸發(fā)生改變，同時選擇壓力對密碼子第3位堿基的影響較小，所以GC3可作為密碼子偏好性分析的重要依據(jù)［39］。本研究中葫蘆巴葉綠體基因組密碼子的平均GC含量為37.06%，表明葫蘆巴葉綠體更傾向于使用A/U密碼子，這與高守輿等［27］對白羊草葉綠體基因組的研究結(jié)果一致。葫蘆巴葉綠體基因組密碼子第3位堿基GC含量較低，這一特征與紫花苜蓿（Medicago sativa L.）［40］、秋茄（Kandelia obovata Sheue）［20］、厚殼紅瘤果茶［28］等相同，符合“高等植物密碼子傾向于使用A/U結(jié)尾”的假設(shè)［41］。

3.2 葫蘆巴葉綠體基因密碼子偏好性的主要影響因素

本研究中PR2-plot繪圖分析結(jié)果表明突變壓力不是影響葫蘆巴葉綠體基因組密碼子偏好性的唯一因素；中性繪圖、ENC-plot分析表明在葫蘆巴在進化過程中，葫蘆巴密碼子偏好性主要受自然選擇的影響，受突變的影響較小，這主要是因為葉綠體是葫蘆巴進行光合作用最重要細胞器，它可以將太陽能轉(zhuǎn)化為化學能來維持葫蘆巴正常生長所需要的物質(zhì)［42］，因此其基因演化主要會受到自然選擇影響。這一結(jié)論與沙棗（Elaeagnus angustifolia）［43］、睡蓮（Nymphaea tetragona）［44］、籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus）［45］等植物的密碼子偏好性一致。而楊國鋒等［34］對蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的研究表明其密碼子偏好性主要受到突變的影響，在續(xù)晨等［46］的研究中，蝴蝶蘭（Phalaenopsis）密碼子使用偏好性受自然選擇和堿基差異的共同影響。由此可以看出，植物密碼子使用偏好性受多種因素影響，不同植物其影響因素有所差異。

3.3 葫蘆巴葉綠體基因密碼子偏好性的模式

RSCU分析是一種根據(jù)相對密碼子偏好性來分析基因表達水平的方法［47］。本研究采用高表達優(yōu)越密碼子方法確定葫蘆巴葉綠體基因組最優(yōu)密碼子，共選出了21個最優(yōu)密碼子，8個以A結(jié)尾，13個以U結(jié)尾，由此可見葫蘆巴葉綠體基因組中密碼子偏好NNA、NNU型。這與前人在扁蓿豆（Medicago ruthenica）［48］的研究結(jié)果一致，說明不同種屬的植物，其密碼子偏好性存在著一定的相似性。

4 結(jié)論

自然選擇是葫蘆巴葉綠體基因組密碼子偏好性主要的影響因素，但其他因素在一定程度上對其密碼子偏性造成影響。同時，本研究確定了葫蘆巴葉綠體基因組的21個最優(yōu)密碼子，研究結(jié)果為科學制定葫蘆巴種質(zhì)保存和更新策略提供理論依據(jù)和實踐指導。

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（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-08-14；修回時間：2023-12-08

基金項目： "國家重點研發(fā)計劃課題（2022YFD1602304）資助

作者簡介：

杜明川（1996-），女，穿青人，貴州六盤水人，碩士研究生，主要從事藥用植物種質(zhì)資源開發(fā)與利用研究， E-mail：1321575830@qq.com；*通信作者 Author for correspondence，E-mail：654138133@qq.com