有機物存在時全程自養(yǎng)脫氮工藝啟動及微生物群落結構演變

文章編號：1671-3559（2024）02-0156-06DOI：10.13349/j.cnki.jdxbn.20240005.003

摘要： 為了實現(xiàn)全程自養(yǎng)脫氮工藝在處理含有機物廢水中的應用， 考察有機物存在時全程自養(yǎng)脫氮工藝的啟動、 運行工況與微生物群落結構演變， 通過低溶解氧和生物膜菌種富集的控制策略， 緩解有機物對厭氧氨氧化菌的抑制， 實現(xiàn)全程自養(yǎng)脫氮工藝啟動和功能微生物的富集。 結果表明， 當進水化學需氧量質量濃度為600 mg/L時， 全程自養(yǎng)脫氮工藝啟動， 在反應器穩(wěn)定運行期間總無機氮去除率最高達到79.46%； 三維熒光光譜顯示腐殖酸類和富里酸類物質是主要的微生物代謝產物； 微生物高通量測序顯示厭氧氨氧化菌的優(yōu)勢屬Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia的相對豐度分別從0.02%和0.01%增加到10.47%和4.45%， 成功實現(xiàn)厭氧氨氧化菌的富集。

關鍵詞： 全程自養(yǎng)脫氮工藝； 有機物； 微生物； 三維熒光光譜； 高通量測序

中圖分類號： X703

文獻標志碼： A

開放科學識別碼（OSID碼）：

Starting of Completely Autotrophic Nitrogen Removal over

Nitrite Process and Evolution of Microbial Community

Structure in the Presence of Organic Matter

ZHAI Fangshuai1， SUN Yaping1， SI Guangchao1， ZHANG Xinwen1， QIAO Zhuangming2， WEI Dong1

（1. School of Water Conservancy and Environment， University of Jinan， Jinan 250022， Shandong， China;

2. Shandong Meiquan Environmental Project Co.， LTD.， Jinan 250101， Shandong， China）

Abstract： To promote the practical application of the completely autotrophic nitrogen removal over nitrite （CANON） process in treatment of organic-containing wastewater， starting， operating conditions and microbial community structure of CANON process in the presence of organic matter were investigated. Through the control strategy of low dissolved oxygen and biofilm bacteria enrichment， the inhibition of organic matter on anaerobic ammonia oxidizing bacteria（AnAOB） was alleviated， and starting of CANON process and enrichment of functional microorganisms were realized. The results show that， when the influent mass concentration of chemical oxygen demand in the influent is 600 mg/L， CANON process starts， and the highest total inorganic nitrogen removal rate is 79.46% during the stable operation of the reactor. Three-dimensional fluorescence spectra show that humic and fulvic acids are the main microbial metabolites. Microbial high-throughput sequencing results show that the relative abundance of Candidatus Kuenenia and Candidatus Brocadia， key genera of AnAOB， increase from 0.02% and 0.01% to 10.47% and 4.45% respectively， indicating that the enrichment of AnAOB is achieved successfully.

Keywords： completely autotrophic nitrogen removal over nitrite; organic matter; microbial; three-dimensional fluorescence spectrum; high-throughput sequencing

收稿日期： 2022-10-24""""""""" 網(wǎng)絡首發(fā)時間：2024-01-08T09：40：22

基金項目： 國家自然科學基金項目（21906064）

第一作者簡介： 翟方帥（1999—），男，山東濟南人。碩士研究生，研究方向為水污染監(jiān)測與控制工程。 E-mail： 735808395@qq.com。

通信作者簡介： 魏東（1985—），男，山東濟南人。副教授，博士，碩士生導師，研究方向為水污染控制。E-mail： weidong506@163.com。

網(wǎng)絡首發(fā)地址： https：//link.cnki.net/urlid/37.1378.N.20240105.1421.006

隨著我國城鎮(zhèn)化和工業(yè)化的發(fā)展，大量的氮元素被排放進入水體，進而導致了水體富營養(yǎng)化等嚴重后果［1］。近年來，國家廢水排放標準日趨嚴格，水處理工藝的升級換代是一項亟待解決的難題，但目前我國絕大多數(shù)污水處理廠仍采用傳統(tǒng)的硝化-反硝化工藝處理污水，具有需外加碳源、 曝氣需求量較大、 污泥產量多、 工藝流程長和占地面積大等諸多缺點［2］。全程自養(yǎng)脫氮（CANON）工藝是一種利用氨氧化菌（AOB）和厭氧氨氧化菌（AnAOB）直接將氨態(tài)氮在同一反應器內轉化為氮氣的新型脫氮工藝，具有曝氣需求量小、 無需外加有機碳源、 污泥產量低及溫室氣體排放少等優(yōu)點［3］，已迅速成為脫氮領域的熱點。

自養(yǎng)微生物AOB和AnAOB作為CANON工藝的關鍵功能微生物，其生命活動并不需要有機物參與［4］，但目前主流低碳氮比廢水中大多含有一定濃度的有機物。Chamchoi等［5］研究發(fā)現(xiàn)，當廢水中的化學需氧量（COD）質量濃度超過300 mg/L時，AnAOB的活性會受到嚴重抑制。同時，COD可以為異養(yǎng)菌提供底物，從而導致異養(yǎng)菌的活性大大提高，使得AnAOB在與異養(yǎng)菌的競爭中處于不利地位，造成系統(tǒng)內AnAOB群落失活甚至洗脫。

由于有機物對AnAOB的脅迫，CANON工藝對實際廢水的處理能力不強，大大限制了該工藝的實際推廣，因此開展有機物存在情況下的CANON工藝調控具有重要意義。 Xie等［6］通過添加生物炭成功緩解了質量濃度為150 mg/L的COD對厭氧氨氧化顆粒污泥的抑制， 提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性， 實驗組的脫氮性能、 污泥穩(wěn)定性及厭氧氨氧化相關功能基因的相對豐度皆優(yōu)于對照組的。 張方齋等［7］通過先后向反應器中接種短程硝化污泥和厭氧氨氧化污泥， 在進水COD質量濃度為（2 050±250） mg/L的情況下， 經(jīng)過150 d的運行， 成功啟動CANON工藝， 總氮（TN）去除率達到98.76%， 同時AnAOB的豐度達到（42.7±5.02）%。 通常， 有機物存在時CANON工藝調控的關鍵在于通過控制運行條件， 如控制恒定溫度（30～35 ℃）和低溶解氧（DO）濃度運行等， 實現(xiàn)生物膜中功能微生物的富集， 強化生物膜中各類微生物間的協(xié)同作用， 以抵抗廢水中有機物的沖擊。

本文中在含有機物進水中接種絮狀好氧活性污泥， 通過控制DO濃度和形成生物膜內部缺氧微環(huán)境的方法， 緩解COD對AnAOB的抑制， 實現(xiàn)CANON工藝的啟動與功能微生物AnAOB的富集， 為在含有機物廢水中CANON工藝的調控提供了參考。

濟南大學學報（自然科學版）第38卷

第2期翟方帥，等：有機物存在時全程自養(yǎng)脫氮工藝啟動及微生物群落結構演變

1" 材料與方法

1.1" 實驗裝置

實驗在一個由有機玻璃制成的圓柱體反應器中進行。反應器有效容積為3.4 L，有效高度為30 cm，內徑為12 cm。在反應器正面垂直方向設置間距為8 cm 的4個取樣口， 以便取樣和出水， 在側面的底部設置1個進水口。 利用微孔曝氣頭和氣泵為系統(tǒng)提供氧氣， 曝氣量由空氣流量計控制。 反應器底部放置一個磁子， 以磁力攪拌器驅動， 使反應器內水氣混合均勻。反應器中添加K3填料（比表面積800 m2/m3，密度為0.96 g/cm3），裝填量為反應器體積的40%，為微生物生長附著提供載體。

1.2" 接種污泥與實驗水質

實驗用污泥接種自實驗室長期運行的絮狀污泥反應器，單位體積初始接種污泥量為5 000 mg/L。采用人工模擬高氨氮（NH+4-N）廢水作為進水，利用NaHCO3控制進水的pH為7.6～8.0，主要組成成分及含量見表1。

另外，按照微量元素溶液與模擬廢水體積比為1∶1 000的比例向模擬廢水中加入微量元素溶液1、 2， 2種溶液的成分及含量見表2。

1.3" 運行條件

反應器以序批式運行， 每天運行3次， 每個運行周期為8 h， 包括進水階段（10 min）、 前置缺氧反應（80 min）、 好氧反應（360 min）、 沉降階段（15 min）、 出水階段（10 min）和閑置階段（5 min），反應器體積交換比為50%，水力停留時間（HRT）為16 h。通過加熱棒控制溫度為（30±2）℃。

1.4" 分析方法

1.4.1" 水質測定方法

NH+4-N采用納氏試劑比色法（GB 7479—87）測定，亞硝態(tài)氮（NO-2-N）根據(jù)N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法（GB 7493—87）測定，硝態(tài)氮（NO-3-N）根據(jù)氨基磺酸-紫外分光光度法（HJ/T 346—2007），以分光光度計（752N型，上海儀電分析有限公司）進行測定。

1.4.2" 熒光光譜分析

三維熒光光譜圖使用熒光光度計儀（LS-55型，美國Perkin-Elmer公司）獲得。儀器參數(shù)設定如下：發(fā)射波長（Em）為220～400 nm，增量為10 nm，激發(fā)波長（Ex）為280～550 nm，增量為0.5 nm。在本研究的測量中，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均保持在10 nm， 掃描速度設置為1 200 nm/min。

1.4.3" 微生物群落分析

收集階段Ⅰ（第1天）和階段Ⅲ（第63天）的污泥樣品，采用高通量測序方法研究反應器運行期間的微生物群落，樣品由北京諾禾致源生物信息科技有限公司分析處理。

采用十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）或十二烷基硫酸鈉（SDS）方法對樣本的基因組DNA進行提取，采用引物對515F-806R（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）擴增16SrRNA基因的V4區(qū)。擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠提取試劑盒處理后，建立測序文庫，在NovaSeq 6000測序系統(tǒng)進行測序。

2" 結果與討論

2.1" CANON工藝啟動過程的調控

根據(jù)生物反應器處理模擬廢水的性能（見圖1）及調控策略，將CANON工藝的啟動過程分為3個階段。

階段Ⅰ（第1—5 天）為好氧活性污泥接種后的適應階段， 污泥接種后采取限氧策略， 由于接種污泥所在原反應器中好氧階段DO濃度較高， 其中硝化細菌的活性較強， 因此采取限氧策略后， 系統(tǒng)的氨氮去除率仍然能維持一個較高的水平（92.68%～98.68%）。 在此期間， 亞硝酸鹽累積率（NAR）也從11.83%迅速增加到48.79%， 造成這個現(xiàn)象的原因是當DO濃度較低時， AOB的氧親和力強于亞硝酸鹽氧化菌（NOB）［8］的， NOB的活性受到了抑制，出現(xiàn)了亞硝酸鹽積累的現(xiàn)象。

階段Ⅱ（第6—42 天）主要是亞硝酸鹽大量積累、出現(xiàn)波動及恢復階段。第6—28天，逐漸降低曝氣量，以降低好氧階段反應器內的DO濃度，因此，NOB受到了持續(xù)抑制，出水NO-3-N含量總體呈下降趨勢，平均NAR為77.81%，總無機氮（TIN）去除率平均為28.84%。由此可見，系統(tǒng)內的主要反應還是以短程硝化反應為主導的。第31—33天，NAR急劇下降到（38.63±3.52）%，原因可能是隨著污泥量增加，AOB繁殖后導致DO相對過剩，NOB利用過量的DO和AOB產生的NO-2-N迅速繁殖所致，因此需要將曝氣量降低。第34—42天，NAR逐漸提高，最高達到了86.17%，TIN去除率也達到了58.02%。

在階段Ⅲ（第43—63 天）， 低DO濃度使NOB受到持續(xù)抑制， NAR維持在（85.91±5.24）%。 值得注意的是， 系統(tǒng)的TIN去除率從第43天的62.81%提高到第63天的79.46%，期間NH+4-N去除率平均為98.21%。由于AOB、 AnAOB和異養(yǎng)細菌在經(jīng)歷了缺氧階段以及長期的適應后，逐漸形成了復雜的協(xié)作生物膜，因此使系統(tǒng)中AnAOB即使在進水COD濃度為600 mg/L的脅迫下，依然能夠保持較高的活性，以保證該生物脫氮反應器具有較高的脫氮效率。

2.2" CANON工藝調控過程中的典型周期

選取階段Ⅲ的典型周期來考察反應過程中無機氮元素的變化，如圖2所示。從缺氧反應開始（系統(tǒng)運行10 min）至反應結束（系統(tǒng)運行90 min），反應器內NH+4-N的質量濃度從（82.64±1.31 ）mg/L下降至（72.58±0.70） mg/L，NO-2-N的質量濃度從（27.02±0.76） mg/L下降至（12.98±0.18） mg/L，NO-2-N和NH+4-N含量變化量的絕對值之比約為1.40， 接近于厭氧氨氨氧化反應的理論值1.32，說明在

缺氧階段的脫氮過程中， 厭氧氨氨氧化途徑起

主導作用。好氧反應開始后，NH+4-N含量隨著反應進行逐漸降低，NO-2-N含量逐漸增加，好氧反應結束時（系統(tǒng)運行450 min），NH+4-N、 NO-2-N的質量濃度分別為（0.92±0.42）、（50.66±0.23） mg/L。好氧反應結束后直到出水期間的30 min，NH+4-N和NO-2-N的含量無顯著變化。在整個周期內，NO-3-N的質量濃度稍有增加，保持在（1.17±0.13）～（10.09±1.07） mg/L。

產物（SMP）的種類及沿程變化。SMP是微生物在代謝底物或在衰亡過程中分泌并釋放到水體中的可溶于水的有機化合物［9］，與生物處理后出水水質是否達標密切相關，對環(huán)境安全與人類健康具有潛在危害。如圖所示，在Ex、 Em分別為320、 420 nm和270、 425 nm處，識別出A、 B峰，分別對應為腐殖酸和富里酸類物質［10］。前置缺氧反應剛開始時，A、 B峰的相對熒光強度分別為23.05、 30.01。隨著反應進行，腐殖酸類物質在缺氧反應結束、好氧反應結束及出水中的相對熒光強度分別為24.09、 24.48、 18.93，而富里酸類物質在缺氧反應結束、好氧反應結束及出水中的熒光強度分別為31.77、 30.38、 30.28。缺氧反應過程中，2種物質的熒光強度略微上升，結合典型周期中NO-2-N和NH+4-N含量變化量的絕對值之比約為1.40，推測缺氧階段反硝化反應速率較低。從好氧反應開始到出水，富里酸類物質的熒光強度逐漸減小，而腐殖酸類物質的熒光強度呈先增大后減小的趨勢?？傮w而言，2種物質的熒光強度在整個反應過程中變化并不明顯，說明這2種物質的生物可利用性和生物可降解性較差，與Wang等［11］研究得到的腐殖酸類物質代表不可生物降解的成分，而富里酸類物質則與生長無關的結論一致。

2.4" 微生物群落演替

為了更深入地了解培養(yǎng)前后微生物群落的變化， 利用高通量測序技術對階段Ⅰ（第1天）和階段Ⅲ（第58天）系統(tǒng)中的原核細菌群落結構進行了分析。 反應器不同階段的微生物群落結構及相對豐度如圖4所示。 由圖4（a）可以看出， 在門水平上， 階段Ⅲ污泥中相對豐度排名前5位的門分別是變形菌門Proteobacteria、 擬桿菌門Bacteroidota、 浮霉菌門Planctomycetota、 厚壁菌門Firmicutes和綠彎菌門Chloroflexi。Proteobacteria（占比為23.67%～54.06%）是廢水處理系統(tǒng)中常見的與脫氮和有機物降解有關的門［12］，包括AOB、 NOB和反硝化菌。Bacteroidota（占比為10.81%～20.20%）是一種常見的反硝化門類［13］，參與生物膜中難降解物質的降解，該門的存在可能與COD降解，以緩解COD對AnAOB的抑制作用密切相關。Planctomycetota（占比為2.16%～16.16%）與厭氧氨氧化脫氮途徑有關，其在系統(tǒng)中相對豐度的增加表明系統(tǒng)中的AnAOB逐漸適應了含有機物的進水。Firmicute（占比為13.37%～23.80%）與生物膜的形成密切相關，為AnAOB在填料上附著、生長繁殖提供了條件［14］。

Chloroflexi（占比為0.21%～6.24%）是從事降解細胞裂解和細胞代謝產生的微生物產物，系統(tǒng)中SMP含量較低可能與Chloroflexi的富集有關。

由圖4（b）可以看出，在屬水平上，Candidatus Kuenenia、 Chryseolinea和Candidatus Brocadia是階段Ⅲ污泥中的優(yōu)勢屬。Candidatus Kuenenia（占比為0.02%～10.47%）和Candidatus Brocadia（占比為0.01%～4.45%）通常在厭氧氨氧化系統(tǒng)中占主導地位［15］，其相對豐度的增加表明它們較AnAOB的其他屬更容易適應含有機物的廢水。系統(tǒng)中檢測到的Chryseolinea（占比為0.14%～6.05%）、 假胞桿菌屬Pseudomonas（占比為2.43%～7.43%）和陶厄氏菌屬Thauera（1.52%～1.79%）， 它們是系統(tǒng)中相對豐度較高的反硝化菌。 由于生物膜內層形成了微缺氧環(huán)境， 使反硝化菌能夠在體系中生長代謝， 因此結合典型周期缺氧階段NO-2-N和NH+4-N含量變化量的絕對值之比約為1.40分析， 推測系統(tǒng)內的脫氮途徑是以厭氧氨氧化反應為主導的。 此外， 系統(tǒng)中還檢測到芽孢桿菌屬Bacillus（占比為0.16%～3.48%）和不動桿菌屬Acinetobacter（占比為0.26%～2.4%），被鑒定為好氧反硝化菌，是一類好氧或兼性好氧、以有機碳作為能源的異養(yǎng)細菌［16］，它們的存在可能有助于緩解COD對AnAOB的抑制。

綜上所述，通過限制DO濃度及利用填料形成生物膜內部缺氧微環(huán)境，AOB、 AnAOB和各類反硝化菌共存于系統(tǒng)中，保證系統(tǒng)良好的脫氮性能。

3" 結論

本文中采用限氧、 利用填料形成生物膜內部缺氧微環(huán)境的方法，成功在含有機物的模擬廢水中實現(xiàn)了AnAOB的富集和CANON工藝的啟動，考察了系統(tǒng)出水水質及微生物群落變化，得到如下結論：

1）在CANON工藝啟動過程中，出水的TIN濃度逐漸降低，系統(tǒng)脫氮效率穩(wěn)定提高，出水水質得到改善。

2）系統(tǒng)內的異養(yǎng)反硝化菌活性較低，厭氧氨氧化脫氮途徑占據(jù)主導地位，生物膜缺氧微環(huán)境中的AnAOB在含有機物廢水中仍能保持較高活性。

3）出水中腐殖酸類物質和富里酸類物質為主要的微生物產物，且含量較少，說明該出水的有機質含量較少，具有更好的環(huán)境安全性。

4）經(jīng)過培養(yǎng)，Candidatus Kuenenia、 Chryseolinea和Candidatus Brocadia成為了系統(tǒng)中微生物的優(yōu)勢屬，AOB、 AnAOB和各類反硝化菌共存于系統(tǒng)中，互相協(xié)作，使系統(tǒng)具有良好的脫氮性能。

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（責任編輯：于海琴）