錳納米酶比色法檢測(cè)電化學(xué)制備過(guò)氧化氫

文章編號(hào)：1671-3559（2024）02-0210-09DOI：10.13349/j.cnki.jdxbn.20230529.001

摘要： 為了拓展納米酶的應(yīng)用，采用離子交換和高溫?zé)峤夥▽⒕鶆蚍稚⒌腻i原子摻雜到中空碳骨架中制備中空結(jié)構(gòu)的錳納米酶；提出一種基于錳納米酶的比色法，用于檢測(cè)電化學(xué)雙電子氧還原原位產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的濃度。結(jié)果表明，錳納米酶具有優(yōu)異的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性，可催化過(guò)氧化氫將無(wú)色3， 3’， 5， 5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化為藍(lán)色氧化態(tài)TMB；當(dāng)過(guò)氧化氫濃度為0～6 mmol/L時(shí)，體系的吸光度與過(guò)氧化氫濃度具有良好的多段線性關(guān)系，錳納米酶比色法具有極低的檢出限（0.45 μmol/L）和優(yōu)異的抗干擾性能。

關(guān)鍵詞： 電化學(xué)； 納米酶； 比色分析； 過(guò)氧化氫

中圖分類(lèi)號(hào)： Q554+.6； O657.32

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

開(kāi)放科學(xué)識(shí)別碼（OSID碼）：

Manganese Nanozyme Based Colorimetric Detection of

Hydrogen Peroxide Prepared by Electrochemistry

DONG Xuyang， LI Zhe， XIA Mingyuan， KANG Ge， YUAN Zhenfeng， LU Yizhong

（School of Materials Science and Engineering， University of Jinan， Jinan 250022， Shandong， China）

Abstract： To expand the application of nanozymes， homogeneously dispersed manganese atoms were doped into the hollow carbon skeleton by ion exchange and high temperature pyrolysis， and a hollow manganese nanozyme （Mn-NC） was prepared. A colorimetric method based on Mn-NC was developed to detect the concentration of hydrogen peroxide produced in situ by electrochemical two-electron oxygen reduction. The results show that Mn-NC has excellent peroxidase like activity and can catalyze the oxidation of colorless 3， 3’， 5， 5’-tetramethylbenzidine（TMB） to blue oxidized TMB by hydrogen peroxide. When the hydrogen peroxide concentration is 0～6 mmol/L， the absorbance of the system has a good multi-segment linear relationship with the hydrogen peroxide concentration， and Mn-NC colorimetric method has very low detection limit （0.45 μmol/L） and excellent anti-interference performance.

Keywords： electrochemistry; nanozyme; colorimetric analysis; hydrogen peroxide

收稿日期： 2022-11-26""""""""" 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時(shí)間：2023-05-30T10：53：00

基金項(xiàng)目： 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（22172063）；泰山青年學(xué)者專(zhuān)家計(jì)劃（tsqn201812080）；濟(jì)南市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)自主培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2021GXRC052）

第一作者簡(jiǎn)介： 董旭陽(yáng)（1997—），男，山東濰坊人。碩士研究生，研究方向?yàn)榧{米酶分析檢測(cè)。E-mail： 1107565587@qq.com。

通信作者簡(jiǎn)介： 逯一中（1985—），男，山東東營(yíng)人。教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣怆姶呋?生物傳感。E-mail： mse_luyz@ujn.edu.cn。

網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址： https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1378.N.20230529.1442.002.html

近年來(lái)，研究人員對(duì)電化學(xué)雙電子氧還原制備過(guò)氧化氫（H2O2）進(jìn)行了大量研究［1］。研究人員設(shè)計(jì)了多種電催化劑，使H2O2的電化學(xué)合成可與傳統(tǒng)的蒽醌合成方法相媲美［2］。此外，監(jiān)測(cè)電化學(xué)系統(tǒng)中的H2O2濃度非常重要，例如在Li-O2電池中，H2O2用于量化放電產(chǎn)物并用作改善電池性能的添加劑［3］，因此，具有良好抗干擾性能且靈敏可靠的H2O2濃度檢測(cè)方法對(duì)于電化學(xué)雙電子氧還原制備H2O2的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。

最近，研究人員報(bào)道了幾種H2O2的定量檢測(cè)方法， 包括紫外-可見(jiàn)分光光度法［4］、 熒光法［5］和滴定法［6］等， 對(duì)它們的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)和綜合比較［7］，然而，在復(fù)雜的電化學(xué)系統(tǒng)中精確定量H2O2濃度仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，原因是影響H2O2測(cè)量和分析的因素有很多，例如強(qiáng)酸或強(qiáng)堿。此外，工作電極、 參比電極和對(duì)電極也可能在電化學(xué)反應(yīng)中引入干擾物質(zhì)并導(dǎo)致誤差。雖然旋轉(zhuǎn)環(huán)盤(pán)電極裝置可以測(cè)量H2O2濃度，但測(cè)量結(jié)果是實(shí)時(shí)的［8］，對(duì)于累積的H2O2濃度仍需要準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。目前常用的方法是氧化還原滴定結(jié)合紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-Vis）測(cè)量，如硫酸鈰滴定結(jié)合UV-Vis測(cè)量是根據(jù)H2O2還原前后Ce4+、 Ce3+的顏色變化［9］，然而，Ce4+的強(qiáng)氧化性會(huì)導(dǎo)致電解液中許多物種被氧化。在復(fù)雜的測(cè)量過(guò)程中還會(huì)有更多的影響因素導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確［10］。

錳（Mn）是生物體必需的金屬元素［11］，多價(jià)態(tài)和高電子自旋性使其成為許多金屬酶的關(guān)鍵輔助因子［12］，例如錳超氧化物歧化酶（MnSOD）［13］、 丙酮酸羧化酶［14］和精氨酸酶［15］。此外，由于不同功能的酶具有各自重要的調(diào)節(jié)作用，因此錳還會(huì)影響生物體的氧化還原穩(wěn)態(tài)和新陳代謝。受到這些獨(dú)特特性的啟發(fā)，近年來(lái)錳納米酶引起了人們廣泛關(guān)注。不同錳納米酶表現(xiàn)出不同的類(lèi)酶活性，如超氧化物歧化酶（SOD）［16］和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶［17］，因此錳納米酶有望成為量化H2O2濃度的敏感性測(cè)試方法的催化劑。例如，Zhu等［18］發(fā)現(xiàn)錳原子摻雜ZIF-8材料中與氮配位的錳原子表現(xiàn)出顯著的芬頓活性，該材料的體外酶活性高于二氧化錳的，可通過(guò)破壞細(xì)胞氧化還原平衡來(lái)治療腫瘤疾病。此外，不同材料的摻雜是提高納米酶催化性能的有效方法，碳摻雜金屬納米材料通過(guò)錨定碳骨架來(lái)物理阻礙納米金屬材料的聚集，使納米金屬材料具有更高的催化活性。例如，Chen等［19］研究發(fā)現(xiàn)，氮摻雜碳材料具有更大的活性表面積和更好的電子傳導(dǎo)性，增強(qiáng)了材料的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性。

本文中采用錳納米酶比色法對(duì)電化學(xué)雙電子氧還原（ORR）制備的H2O2濃度進(jìn)行檢測(cè)。采用離子交換法將錳原子摻雜到鋅基沸石咪唑（ZIF-8）中空碳骨架結(jié)構(gòu)（ZIF-8 HNCs）中，900 ℃熱解前驅(qū)體得到錳納米酶（Mn-NC）。豐富的Mn—Nx活性位點(diǎn)和較大的比表面積，賦予Mn-NC優(yōu)異的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性。根據(jù)H2O2介導(dǎo)的 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化，提出了一種靈敏且簡(jiǎn)易的比色法，用于檢測(cè)H2O2濃度。

1" 實(shí)驗(yàn)

1.1" 試劑

六水合硝酸鋅（Zn（NO3）2·6H2O）、 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、 2-甲基咪唑、 鄰苯二胺（OPD）、 2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、 二甲基酰胺（DMF）、 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），購(gòu)自Sigma-Aldrich公司； 氯化錳（MnCl2）、 單寧酸（C76H52O46，TA）、 四氯金酸（HAuCl4·4H2O），購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司； 過(guò)氧化氫，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑公司。

1.2" 測(cè)試儀器

采用透射電子顯微鏡（TEM，JEM2100 Plus型）表征催化劑的形態(tài)；采用X射線衍射儀（XRD，D8-Advance型）表征催化劑的結(jié)構(gòu)； 采用X射線光電子能譜儀（XPS， Thermo Scientific K-Alpha型）探究催化劑的成分和價(jià)態(tài)； 采用全自動(dòng)比表面及孔隙分析儀（BET，麥克 ASAP2460型）測(cè)試催化劑的比表面積；采用傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR， iS50型）表征催化劑的分子結(jié)構(gòu)； 采用紫外分光光度計(jì)（UV-Vis， UV-8000型）采集體系的吸光度； 采用恒電位儀（CHI760E型）進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。

1.3" 材料制備

合成ZIF-8 HNCs。將120 mg Zn（NO3）2·6H2O和4 mg CTAB溶解在4 mL水中，隨后將其加入到含有1.816 g 2-甲基咪唑的28 mL水中，劇烈攪拌2 h得到ZIF-8。 將所得沉淀物離心分離，水洗3次，65 ℃真空干燥過(guò)夜。 在超聲波作用下將40 mg ZIF-8分散在3 mL水中，攪拌30 min，形成均勻分散體后， 將4 mL單寧酸水溶液（質(zhì)量濃度為25 g/L）加入混合物中，在室溫下攪拌2 h。最后，將獲得的ZIF-8 HNCs離心分離并在65 ℃真空干燥6 h。

合成Mn-NC。將ZIF-8 HNCs（40 mg）粉末在超聲波作用下分散在水（20 mL）中，攪拌5 min形成均勻混合物后，將400 μL MnCl2水溶液（質(zhì)量濃度為100 g/L）注入混合溶液中，然后將混合溶液劇烈攪拌3 h以使鹽溶液完全吸收。離心分離，在60 ℃真空干燥箱中干燥6 h，將樣品置于管式爐中，在氬氣（體積流量為10 mL/min）氣氛下加熱至900 ℃（升溫速率為5 ℃/min） 2 h，得到Mn-NC。

合成金-碳納米管。室溫下將500 mg碳納米管（CNTs）在濃度為12 mol/L的HNO3溶液中攪拌12 h進(jìn)行氧化預(yù)處理， 所得樣品用去離子水洗滌至中性并在真空烘箱中干燥過(guò)夜， 所得樣品命名為氧化碳納米管（OCNTs）。 將50 mg的OCNTs放入50 mL DMF中并超聲處理30 min， 以使OCNTs均勻分散在溶劑中。將所得懸浮液在油浴鍋中加熱回流，當(dāng)加熱溫度達(dá)到140 ℃時(shí)，分別加入50、 100、 150、 200 μL濃度為100 mmol/L的HAuCl4·4H2O水溶液，并在140 ℃保溫6 h， 所得樣品用去離子水洗滌3次， 并在60 ℃真空烘箱中干燥過(guò)夜， 研磨后得到的粉末狀固體為目標(biāo)產(chǎn)物金納米團(tuán)簇負(fù)載的碳缺陷碳納米管， 命名為Au-OCNTs-x（x=50、 100、 150、 200， 代表HAuCl4·4H2O的添加量）。

1.4" Mn-NC的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性

將10 μL 均勻分散的Mn-NC水基懸浮液（質(zhì)量濃度為1 g/L）、 920 μL pH為3.2醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、 20 μL 濃度為0.1 mol/L的H2O2溶液和50 μL濃度為5 mmol/L的TMB溶液混合均勻并反應(yīng)15 min。 對(duì)該混合溶液進(jìn)行UV-Vis光譜測(cè)量吸光度。

1.5" 用Mn/NC檢測(cè)H2O2

將10 μL 均勻分散的Mn-NC水基懸浮液（質(zhì)量濃度為1 g/L）、 920 μL pH=3.2醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、 20 μL不同濃度的H2O2溶液和50 μL濃度為5 mmol/L的TMB溶液混合均勻， 反應(yīng)15 min。對(duì)混合溶液進(jìn)行UV-Vis光譜測(cè)量吸光度，從而得到H2O2標(biāo)準(zhǔn)線。

H2O2是通過(guò)電化學(xué)雙電子氧還原制備的， 使用負(fù)載在有碳缺陷的碳納米管（Au-OCNTs-150）上的金納米團(tuán)簇作為電催化劑。 反應(yīng)過(guò)程中， 每隔1 h取出1 mL含H2O2的電解液備用。 用這種電解液代替H2O2， 并在與上述測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)線性度相同的條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.6" 電化學(xué)實(shí)驗(yàn)

不同金負(fù)載量的Au-OCNTs-x催化劑的電極制備過(guò)程如下：首先，將4 mg不同金負(fù)載量的碳納米管分別分散在含有0.8 mL異丙醇、 0.2 mL超純水和10 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%全氟磺酸型聚合物（Nafion）溶液的混合物中，在超聲波作用下產(chǎn)生均勻的電極催化劑溶液。然后，將10 μL電極催化劑溶液滴到拋光的旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)圓環(huán)電極（RRDE）上，在具有三電極系統(tǒng)的電化學(xué)工作站（CHI-760E型）進(jìn)行電催化活性評(píng)估。用催化劑修飾的RRDE、 飽和甘汞電極（SCE）和石墨棒分別作為工作電極、 參比電極和對(duì)電極，選擇pH為13、 KOH的濃度為0.1 mol/L的溶液為電解液。ORR活性通過(guò)掃描速率分別為50、 10 mV/s的循環(huán)伏安法（CV）、 線性掃描伏安法（LSV）得到。

2" 結(jié)果與討論

2.1" Mn-NC的結(jié)構(gòu)表征

Mn-NC是通過(guò)受控化學(xué)蝕刻法形成的ZIF-8納米立方體（ZIF-8 NCs）前驅(qū)體熱解合成的。首先，將ZIF-8 NCs粉末溶解在水中并用單寧酸（TA）蝕刻以產(chǎn)生中空結(jié)構(gòu)前體。具體來(lái)說(shuō)，TA將自由質(zhì)子釋放到溶液中，一些TA分子吸附在ZIF-8 NCs的表面。然后，H+可以滲透到ZIF-8 NCs的內(nèi)部［20］。隨后，內(nèi)核被H+蝕刻，而ZIF-8 NCs的外層被外部TA分子保護(hù)， 形成ZIF-8 HNCs。Mn2+離子通過(guò)離子交換方法被吸收到ZIF-8 HNCs結(jié)構(gòu)中。然后，混合物在氬氣氣氛中于900 ℃熱解。在熱解過(guò)程中，有機(jī)MOF配體轉(zhuǎn)化為氮摻雜碳結(jié)構(gòu)，Mn原子被富氮多孔碳捕獲，得到Mn-NC。合成過(guò)程如圖1所示。

由于ZIF-8具有規(guī)則的納米立方體形貌， 因此制備的Mn2+摻雜ZIF-8也具有規(guī)則的中空納米立方體形貌。TEM圖像顯示，制備的 Mn-NC與熱解的ZIF-8 HNCs具有相同的立方體形貌［見(jiàn)圖2（a）］， 平均粒徑約為150 nm。此外，在透射電子顯微鏡圖像［見(jiàn)圖2（a）左下角的插圖］中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的Mn納米顆粒或Mn團(tuán)簇。 Mn-NC和氮摻雜碳（NC）樣品的傅里葉紅外變換（FTIR）光譜［見(jiàn)圖2（b）］顯示3個(gè)特征峰， 波數(shù)為3 423 cm-1處為C—OH和N—H的伸縮振動(dòng)吸收峰， 波數(shù)為1 606、 1 290 cm-1處分別對(duì)應(yīng)CN/CC和C—N的拉伸吸收峰。 與NC相比， Mn-NC在波數(shù)830 cm-1處有一個(gè)新峰［見(jiàn)圖2（b）左下角插圖］， 這歸因于金屬配體Mn—N的振動(dòng)。 X射線衍射（XRD）圖譜［見(jiàn)圖2（c）］與氮摻雜碳類(lèi)似， 并且沒(méi)有出現(xiàn)Mn特征峰， 表明Mn呈原子級(jí)均勻分散在氮摻雜碳骨架中。 比表面積分析數(shù)據(jù)顯示，Mn-NC的比表面積為563.61 m2/g［見(jiàn)圖2（d）］，表明Mn-NC具有巨大的比表面積［21］，使得Mn-NC具有較好的催化活性。

采用X射線光電子能譜（XPS）研究Mn-NC中的元素價(jià)態(tài)， 如圖3所示。 由圖可以看出， 在結(jié)合能為614.9、 531.3、 400.1、 284.8 eV附近的光電子峰分別對(duì)應(yīng)于Mn 2p、 O 1s、 N 1s和C 1s電子［圖3（a）］，其中Mn 2p3/2電子的光電子峰（結(jié)合能約為642.0 eV）位于Mn0的光電子峰（結(jié)合能約為640.9 eV）和Mn4+的光電子峰（結(jié)合能約為642.5 eV）之間，證實(shí)了Mn-NC中Mn的價(jià)態(tài)為Mn2+或Mn3+［圖3（b）］［22］。

2.2" Mn-NC的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性

Mn-NC和NC在水中均具有良好的分散性， 在均相體系中未觀察到明顯的小顆粒， 有利于其在比色檢測(cè)中的應(yīng)用。 同時(shí)， 由于1 mL的體系中僅加入10 μL質(zhì)量濃度為1 g/L的Mn-NC水基懸浮液， 因此Mn-NC對(duì)體系的背景吸收的影響可忽略不計(jì)。 將TMB在H2O2存在下的氧化作為探針?lè)磻?yīng)來(lái)評(píng)估Mn-NC的類(lèi)過(guò)氧化物酶樣活性。 TMB的乙醇溶液是無(wú)色的， 在UV-Vis測(cè)試范圍內(nèi)無(wú)強(qiáng)吸收峰。Mn-NC的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性可催化H2O2將TMB氧化為藍(lán)色氧化態(tài)TMB（oxTMB）。根據(jù)TMB和oxTMB的顏色變化， 可以通過(guò)比色法確定H2O2濃度。 圖4為Mn-NC的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性定性表征結(jié)果。 如圖4（a）所示， 含有Mn-NC和高濃度H2O2和TMB的溶液呈深藍(lán)色， 在波長(zhǎng)652 nm處有強(qiáng)吸收峰（黑線）， 不含H2O2的溶液呈淡藍(lán)色（紅線）。 未摻雜Mn的NC的催化活性低于Mn-NC（橙線）的， 表明Mn-NC的過(guò)氧化物酶活性?xún)H在同時(shí)摻雜錳和碳化時(shí)顯著增強(qiáng)， 因?yàn)樗鼈冃纬闪舜罅勘┞兜腗n—Nx活性位點(diǎn)。當(dāng)混合溶液中加入低濃度的H2O2時(shí)， Mn-NC的類(lèi)氧化物酶活性降低（藍(lán)線）。造成這種現(xiàn)象的原因可能是Mn3+的存在。雖然Mn-NC本身具有一定的類(lèi)氧化物酶活性，且Mn3+具有強(qiáng)氧化性，但Mn2+是一種穩(wěn)定的離子，沒(méi)有強(qiáng)氧化性，當(dāng)體系中無(wú)H2O2時(shí)，Mn-NC的類(lèi)氧化物酶活性與Mn3+共同氧化TMB，使得無(wú)H2O2的體系變藍(lán)。當(dāng)加入H2O2后，由于Mn3+的強(qiáng)氧化性，H2O2率先與Mn3+發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將H2O2分解為H2O和O2，并且Mn3+也被消耗，無(wú)法氧化TMB，此時(shí)只能由Mn-NC的類(lèi)氧化物酶活性發(fā)揮作用，因此，當(dāng)加入少量H2O2時(shí)會(huì)降低Mn-NC的類(lèi)氧化物酶活性。當(dāng)加入的H2O2相對(duì)于Mn-NC中的Mn3+過(guò)量時(shí)，Mn3+被完全消耗之后還會(huì)剩余部分H2O2，于是Mn-NC的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性發(fā)揮作用，催化H2O2氧化TMB使其變?yōu)樗{(lán)色的oxTMB［23］。

采用OPD和ABTS作為代表性的類(lèi)過(guò)氧化物酶底物進(jìn)一步驗(yàn)證Mn-NC的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性。結(jié)果顯示，Mn-NC可以在H2O2存在下催化OPD和ABTS的氧化，氧化后的OPD和ABTS顯示出黃色和綠色，結(jié)果如圖4（b）所示。

H2O2在過(guò)氧化物酶反應(yīng)中起著不可或缺的作用，通常被分解成活性氧。超氧化物歧化酶（SOD）、 異丙醇和色氨酸分別作為超氧陰離子（O·-2）、 羥基自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2）的清除劑。在體系中引入不同的清除劑確定Mn-NC催化反應(yīng)的反應(yīng)中間體。 如圖5（a）所示， 加入異丙醇和色氨酸后， 體系的吸光度明顯減小， 而SOD對(duì)體系的影響較小， 說(shuō)明體系中存在·OH和1O2。然后，對(duì)Mn-NC的酶活性進(jìn)行探究，計(jì)算得到Mn-NC的比活性為0.37 U/mg［見(jiàn)圖5（b）］，證明Mn-NC具有良好的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性［24］。

與天然酶一樣，Mn-NC的催化活性也受多種因素影響，以下研究pH、 催化劑濃度、 孵育溫度和孵育時(shí)間對(duì)Mn-NC催化活性的影響，尋找最佳測(cè)試條件。首先考察pH對(duì)Mn-NC催化的TMB顯色反應(yīng)的影響。隨著pH的增加，吸光度先增大后減小，在pH為3.2時(shí)達(dá)到峰值。隨著Mn-NC濃度的增加，顯色系統(tǒng)的吸光度繼續(xù)增大。溫度對(duì)Mn-NC催化活性的影響實(shí)驗(yàn)在水浴鍋中進(jìn)行。顯色系統(tǒng)的吸光度隨著溫度的升高而減小，表明溫度過(guò)高不利于Mn-NC催化的TMB顯色反應(yīng)。在優(yōu)化上述反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，確定最適pH為3.2， Mn-NC質(zhì)量濃度和孵育溫度分別為10 μg/mL和25 ℃?？紤]到活性和時(shí)間有效性，選擇孵育時(shí)間為15 min。

在優(yōu)化的條件下， 進(jìn)一步研究Mn-NC的類(lèi)過(guò)氧化物催化穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)， 結(jié)果見(jiàn)圖5（c）、 （d）。 從圖中可以看出， 在一定的底物濃度范圍內(nèi)Mn-NC催化反應(yīng)遵循典型的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)模型。 米氏常數(shù)KM和最大初始反應(yīng)速率vmax可通過(guò)公式 1/v= KM/（vmaxc）+1/vmax的斜率和截距獲得，式中： v為不同底物濃度下的初始反應(yīng)速率； c為底物的濃度。 KM等于反應(yīng)速度達(dá)到最大速度一半時(shí)的底物濃度，通常用于表示酶與底物的親和力， KM越小，親和力越強(qiáng)。經(jīng)計(jì)算，Mn-NC與底物H2O2、 TMB的KM分別為2.848、 0.239 mmol/L。與文獻(xiàn)報(bào)道的納米酶以及天然辣根過(guò)氧化物酶（HRP）相比，本文中制備的Mn-NC具有較小的KM值，表明它對(duì)酶促反應(yīng)底物具有很強(qiáng)的親和力。

2.3" Mn-NC檢測(cè)過(guò)氧化氫

Mn-NC比色法可用于檢測(cè)電化學(xué)ORR過(guò)程制備的H2O2累積濃度。H2O2的制備和檢測(cè)過(guò)程如圖6（a）所示。

由于具有高催化活性， 在H2O2的作用下， Mn-NC可以催化TMB生成藍(lán)色的oxTMB， 從而使溶液顏色發(fā)生變化。 當(dāng)H2O2濃度較低時(shí)， Mn-NC-H2O2-TMB體系的吸光度與H2O2濃度成反比； 當(dāng)H2O2濃度較高時(shí)， 體系的吸光度與H2O2濃度成正比， 如圖6（b）—（e）所示。 H2O2濃度為0～0.009、 0.025～0.5 mmol/L時(shí)，體系的吸光度與H2O2濃度呈現(xiàn)兩段線性關(guān)系。體系的吸光度在0.5～6 mmol/L范圍內(nèi)的隨著H2O2濃度升高而呈線性增大［見(jiàn)圖6（e）］。

根據(jù)公式cl=3σ/S可計(jì)算得到檢出限，其中cl為檢出限，σ為空白樣標(biāo)準(zhǔn)差，S為擬合直線斜率。計(jì)算出的cl為0.45 μmol/L，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)電化學(xué)雙電子氧還原累積的H2O2。

H2O2是在三電極體系的電解池中通過(guò)雙電子氧還原過(guò)程制備的， 其中通過(guò)DMF還原負(fù)載金納米團(tuán)簇的碳缺陷碳納米管（Au-OCNTs-150）制備的催化劑材料負(fù)載在工作電極上， Au-OCNTs-150表現(xiàn)出優(yōu)異的電化學(xué)雙電子氧還原性能， 具有較高的H2O2選擇性（約96%）。 在測(cè)試過(guò)程中， 每小時(shí)取出約20 μL含有電化學(xué)制備的H2O2的電解液， 按照與上述相同的步驟進(jìn)行測(cè)量。在Mn-NC的催化下， 含有H2O2的電解液可以將TMB氧化成藍(lán)色， 從而比色得出電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的累積H2O2濃度，結(jié)果見(jiàn)圖7。如圖7（a）所示，隨著不同電化學(xué)反應(yīng)時(shí)間的電解液（其中包含電化學(xué)制備的H2O2）的加入，體系的吸光度呈下降趨勢(shì)。反應(yīng)進(jìn)行不同時(shí)間后檢測(cè)到的H2O2濃度分別為0.09、 0.205、 0.315、 0.390 mmol/L［見(jiàn)圖7（b）］。

此外，還對(duì)已知濃度的H2O2溶液進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證Mn-NC檢測(cè)電化學(xué)產(chǎn)生的H2O2濃度的準(zhǔn)確性。 如圖7（c）所示， 檢測(cè)得到的H2O2濃度與已知的H2O2濃度基本相同， 驗(yàn)證了Mn-NC檢測(cè)電化學(xué)制備的H2O2濃度的準(zhǔn)確性。 將KOH溶液作為電解液研究常見(jiàn)污染物（如硝酸根離子、 硫酸根離子、 氯離子等）和溶劑（如乙醇、 甲醇、 丙酮、 氫氧化鉀溶液等）的干擾效應(yīng)， 結(jié)果見(jiàn)圖7（d）。 可以看出， 這些污染物和溶劑的干擾可以忽略不計(jì)， 表明Mn-NC可用于工程實(shí)際中檢測(cè)電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2。

3" 結(jié)論

本文中通過(guò)蝕刻、 摻雜和熱解工藝制備了Mn摻雜的中空納米立方體納米酶，擁有Mn—Nx活性位點(diǎn)和較大比表面積的Mn-NC具有優(yōu)異的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性。 本文中提出了一種基于Mn-NC的靈敏可靠的比色方法， 用于檢測(cè)電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的累積H2O2濃度， 具有寬線性范圍、 低檢出限以及優(yōu)異的抗干擾性能。 該研究對(duì)于設(shè)計(jì)具有改進(jìn)性能的納米酶， 開(kāi)發(fā)納米酶參與測(cè)定H2O2濃度的方法具有參考價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：于海琴）