高效液相色譜法測定食品中4-己基間苯二酚殘留量的方法驗證

摘 要：目的：驗證沈陽市食品藥品檢驗所實驗室是否有開展《食品安全國家標準 食品中4-己基間苯二酚殘留量的測定》（GB 5009.280—2020）項目的檢驗?zāi)芰?。方法：采用高效液相色譜進行分離，熒光檢測器進行檢測分析，根據(jù)保留時間進行定性分析，外標法進行準確定量，同時驗證方法標準曲線線性范圍、檢出限、定量限、精密度和回收率。結(jié)果：當(dāng)4-己基間苯二酚濃度在0.02～2.00 mg·L-1時，呈現(xiàn)出的線性關(guān)系良好，方法檢出限、定量限、精密度和回收率均能滿足國家標準方法要求。結(jié)論：沈陽市食品藥品檢驗所實驗室有能力進行食品中4-己基間苯二酚殘留量的測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；食品；4-己基間苯二酚；方法驗證

Validation of Method for Determination of 4-Hexylresorcinol Residues in Food by High Performance Liquid Chromatography

WANG Yun1， LI Qiaolian1， LIN Yang1， YU Jiaozhu1， JU Xiaoying1， DANG Hui2

（1.Shenyang Food and Drug Inspection Institute， Shenyang 110122， China; 2.Liaoning Open University， Shenyang 110034， China）

Abstract： Objective： To verify whether the laboratory of Shenyang Institute for Food and Drug Control has the ability to carry out the GB 5009.280—2020 project. Method： High performance liquid chromatography was used for separation， fluorescence detector was used for detection and analysis， qualitative analysis was carried out according to the retention time， and external standard method was used for accurate quantification. At the same time， the linear range， detection limit， quantitative limit， precision and recovery rate of the standard curve of the method were verified.Result： When the concentration of 4-hexylresorcinol is in the range of 0.02～2.00 mg·L-1， the linear relationship is good. The detection limit， quantitative limit， precision and recovery rate of the method can meet the requirements of national standard method. Conclusion： The laboratory of Shenyang Food and Drug Inspection Institute has the ability to determine the residual amount of 4-hexylresorcinol in food.

Keywords： high performance liquid chromatography; food; 4-hexylresorcinol; method verification

4-己基間苯二酚是一種新型抗氧化劑，能夠抑制褐變，其本身為黃白色、白色針狀結(jié)晶，如遇空氣、光則變成淡棕粉紅色，有強澀味，弱臭，可使舌頭產(chǎn)生麻木感，微溶于甲醇、植物油、乙醇、氯仿、水及苯等物質(zhì)[1-3]。4-己基間苯二酚是一種水產(chǎn)品類的加工助劑，能夠有效抑制蝦類產(chǎn)品機體中的多酚氧化酶的活性，可在貯存過程中保持蟹類、蝦類等甲殼水產(chǎn)品不產(chǎn)生褐變，色澤較好[4-6]。原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會于2014年12月24日發(fā)布的《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規(guī)定，4-己基間苯二酚為我國合法的食品添加劑，可作為抗氧化劑應(yīng)用在蝦類鮮水產(chǎn)的食品中，要求按生產(chǎn)需要適量使用，食品中殘留量應(yīng)≤1 mg·kg-1。

在國民經(jīng)濟快速發(fā)展的時代，人們對健康更加重視，對水產(chǎn)品的營養(yǎng)成分、口感、鮮嫩程度要求越來越高。因此，4-己基間苯二酚作為一種可應(yīng)用于蝦類鮮水產(chǎn)中的抗氧化劑備受關(guān)注[7-9]。目前，食品中4-己基間苯二酚殘留量的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及氣相色譜-質(zhì)譜法[10]。采用高效液相色譜分離，熒光檢測器檢測的方法可準確快速地對4-己基間苯二酚進行定性定量分析，此方法已被廣泛應(yīng)用于鮮水產(chǎn)蝦和螃蟹中4-己基間苯二酚殘留量的測定中。

本文根據(jù)實驗室資質(zhì)認定的相關(guān)要求，在使用檢驗方法前對食品中4-己基間苯二酚殘留量進行方法驗證，從而保證本實驗室的環(huán)境條件、儀器設(shè)備、人員能力和試劑耗材能夠滿足《食品安全國家標準 食品中4-己基間苯二酚殘留量的測定》

（GB 5009.280—2020）方法的要求。本次驗證的內(nèi)容主要包括標準品、儀器設(shè)備、試劑耗材等是否滿足要求，方法檢出限、定量限、標準曲線線性范圍、精密度和回收率是否滿足相關(guān)標準的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦：市售；乙腈：色譜純，美國Fisher公司；甲醇：色譜純，美國Fisher公司；乙酸乙酯：色譜純，國藥集團；正己烷：色譜純，天津市四友精細化學(xué)品有限公司；無水硫酸鈉：分析純，天津市博迪化工有限公司；實驗用水：均為GB/T 6682—2008規(guī)定的超純水；4-己基間苯二酚標準物質(zhì)：純度為98.8%，F(xiàn)irst standard。

1.2 主要設(shè)備和儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，配2475FlR檢測器，美國Waters公司；QUINTIX213-1CN電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DMV-16多試管渦旋混合器，廣東省科寅公司；H1750R醫(yī)用離心機，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

取代表性樣品的可食部分約500 g，經(jīng)組織搗碎機粉碎混勻后，裝入潔凈的容器中作為試樣，密封并做好標識，試樣于-18 ℃保存。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取。準確稱取2.00 g制備好的樣品于

50 mL離心管中，加入乙酸乙酯20 mL，無水硫酸鈉3 g，均質(zhì)30 s，然后離心3 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到100 mL濃縮瓶中，在剩余的殘渣中加入20 mL乙酸乙酯，重復(fù)上述流程，進行均質(zhì)，離心，合并兩次上清液于同一個濃縮瓶之中，在35 ℃水浴中蒸發(fā)至近干。

（2）凈化。在提取好的殘渣中加入2 mL甲醇-乙腈-水（1∶2∶1）混合溶液進行復(fù)溶，然后進行10 s超聲、30 s渦旋，使殘渣全部溶解，再加入乙腈飽和正己烷溶液2 mL，渦旋后轉(zhuǎn)移至離心管中，離心3 min，棄去正己烷層后，再次向離心管中加入2 mL乙腈飽和正己烷溶液，先進行30 s渦旋，然后離心，棄去上層正己烷，吸取下層溶液經(jīng)0.45 μm有機膜過濾后待測。

1.3.3 繪制標準曲線

標準儲備液（100 mg·L-1）：稱取10 mg（精確到0.01 mg）4-己基間苯二酚標準物質(zhì)，置于100 mL容量瓶中，使用甲醇進行溶解，然后定容至刻度線，混合均勻。

標準中間液（10 mg·L-1）：吸取1.00 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇進行稀釋、定容。

標準系列工作液：分別吸取0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL標準中間液，置于10 mL容量瓶中，用甲醇-乙腈-水（1∶2∶1）混合溶液定容至10 mL，得到濃度分別為0.02 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1及2.00 mg·L-1的標準系列工作液。

1.3.4 儀器條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水=65∶35（體積比）；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長310 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線及其相關(guān)要求

按照標準的儀器條件將標準系列工作液分別注入液相色譜儀中進行測試分析，4-己基間苯二酚標準溶液的液相色譜圖如圖1所示。由圖1可知，采用反相液相色譜-熒光檢測器測定4-己基間苯二酚，所得色譜峰兩邊對稱，無拖尾，不分叉，較為理想。

4-己基間苯二酚標準系列工作液得到的標準校正曲線如圖2所示。由圖2可知，4-己基間苯二酚標準校正曲線線性方程為Y=1.85×106X-9.46×103，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 136，滿足《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求（R2≥0.99）。因此，當(dāng)4-己基間苯二酚濃度為0.20～2.00 mg·L-1時，線性關(guān)系良好。

2.2 方法檢出限

根據(jù)國家標準《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中“信噪比法評估LOD”的方法對方法檢出限進行測定，以檢出限（0.020 0 mg·kg-1）水平進行加標實驗，10次平行測定結(jié)果分別為0.021 0 mg·kg-1、0.024 0 mg·kg-1、0.023 0 mg·kg-1、0.025 0 mg·kg-1、0.023 0 mg·kg-1、0.022 0 mg·kg-1、0.025 0 mg·kg-1、0.021 0 mg·kg-1、0.023 0 mg·kg-1及0.024 0 mg·kg-1，平均值為0.023 0 mg·kg-1，信噪比（s/n）均大于3。

2.3 方法定量限

根據(jù)國家標準《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中“信噪比法評估LOD”的方法對方法定量限進行測定，以定量限（0.050 0 mg·kg-1）水平進行加標實驗，10次平行測定結(jié)果分別為0.052 0 mg·kg-1、0.051 0 mg·kg-1、0.050 0 mg·kg-1、0.050 0 mg·kg-1、0.053 0 mg·kg-1、0.051 0 mg·kg-1、0.052 0 mg·kg-1、0.050 0 mg·kg-1、0.053 0 mg·kg-1及0.051 0 mg·kg-1，平均值為0.051 3 mg·kg-1，信噪比（s/n）均大于10。

2.4 精密度

根據(jù)《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求，選取一種陽性樣品進行3水平6平行精密度試驗。本研究選取選取低（0.050 0 mg·kg-1）、中（0.100 0 mg·kg-1）、高（0.500 0 mg·kg-1）3種濃度的樣品分別進行6次平行試驗。低、中、高三水平下的精密度分別為1.02%、2.88%、1.15%，均滿足GB/T 27404—2008對于精密度的要求。

2.5 加標回收率

根據(jù)國家標準GB/T 27404—2008相關(guān)要求，以空白蝦為樣品進行3水平加標實驗，不同加標濃度下的加標回收率如表1所示。由表1可知，低濃度（0.050 0 mg·kg-1）下的加標回收率為101.4%，中濃度（0.100 0 mg·kg-1）下的加標回收率為96.8%，高濃度（0.500 0 mg·kg-1）下的加標回收率為85.0%，均滿足GB/T 27404—2008對于加標回收率的要求。

3 結(jié)論

在現(xiàn)有的儀器和設(shè)備條件下，對本實驗室檢測食品中4-己基間苯二酚殘留量的能力進行驗證，分別對標準曲線線性范圍、檢出限、定量限、精密度和回收率進行分析實驗。結(jié)果表明，4-己基間苯二酚標準校正曲線線性方程為Y=1.85×106X-9.46×103，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 136，符合國家標準GB/T 27404—2008的要求（R2≥0.99）；檢出限為0.023 0 mg·kg-1，且樣品峰高均能到達基線噪音的3倍，滿足GB 5009.280—2020中檢出限0.020 0 mg·kg-1的要求；定量限為0.051 3 mg·kg-1，且樣品峰高均能達到基線噪音的10倍，滿足GB 5009.280—2020中定量限0.050 0 mg·kg-1的要求；低、中、高三水平下的精密度分別為1.02%、2.88%、1.15%，滿足GB/T 27404—2008對于精密度的要求；低、中、高三水平下的加標回收率分別為101.4%、96.8%、85.0%，滿足GB/T 27404—2008對于加標回收率的要求。綜上所述，本實驗室檢測食品中4-己基間苯二酚殘留量的能力可以滿足GB 5009.280—2020的要求。

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作者簡介：王韻（1987—），女，山東萊州人，碩士，工程師。研究方向：食品檢測與分析。