3種硫酸多糖的酶抑制作用研究

摘 要：硫酸多糖具有抗凝血、抗病毒、抗菌、抗癌及促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等多種生物活性，且能抑制生物體內(nèi)存在的各種酶的過度活性，有效維持生命健康和防止衰老。本文對褐藻糖膠（Fucoidan，F(xiàn)PS）、紫菜多糖（Porphyran，PP）、硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）等3種硫酸多糖抑制透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase，HAase）、膠原蛋白酶（Collagenase，CLS）、酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）和彈性蛋白酶（Elastase，PPE）的活性作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，F(xiàn)PS對HAase、CLS、PPE均有抑制作用；PP和CS對HAase、PPE有較強抑制作用，其中CS具有極強的HAase抑制活性；硫酸多糖抑制HAase活性作用可能與硫酸基有關(guān)，需進(jìn)一步驗證；多糖分子量越小，其抑制HAase活性作用越大。本研究有望為硫酸多糖在保濕護(hù)膚、抗黑色素生成、維持肌膚彈性等方面的開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞：硫酸多糖；褐藻糖膠；紫菜多糖；硫酸軟骨素；酶；抑制作用

Research on Enzyme Inhibition of Three Types of Sulfated Polysaccharides

ZHANG Yang

（Wuhu Institute of Technology， Wuhu 241003， China）

Abstract： Sulfated polysaccharides exhibit a range of biological activities， including anticoagulation， antivirus， antibacterial， anticancer， and promotion of wound healing， as well as inhibiting the excessive activity of various enzymes within living organisms， effectively maintaining life health and preventing aging. This paper investigates the inhibition of three sulfated polysaccharides-fucoidan （FPS）， porphyran （PP）， and chondroitin sulfate （CS） on the activity of hyaluronidase HAase， collagenase （CLS）， tyrosinase （TYR）， and elastase （PPE）. The results indicate that FPS exhibits inhibitions on HAase， CLS， and PPE; PP and CS have strong inhibitions on HAase and PPE， with CS showing particularly strong inhibitory activity against HAase. The activities of sulfated polysaccharides on HAase may be linked with sulfates， which requires further verification; it has been observed that the smaller the molecular weight of the polysaccharides， the greater their inhibition on HAase activity. This research is expected to provide a reference for the development and utilization of sulfated polysaccharides in aspects such as moisturizing skincare， anti-melanin production， and maintaining skin elasticity.

Keywords： sulfated polysaccharides; fucoidan; porphyrin; chondroitin sulfate; enzyme; inhibition

硫酸多糖（Sulfated Polysaccharides）廣泛存在于生物界[1]，在動物界以肝素（Heparin）、硫酸皮膚素（Dermatan Sulfate）等形式存在于動物組織中，在植物界以硫酸鼠李糖（Rhamnan Sulfate）等形式存在于各類海藻中。硫酸多糖具有多種生理作用，如抗病毒和抗菌作用[2-3]、抗癌作用[4]、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合作用[5]等，可應(yīng)用于食品添加劑（如凝膠劑）、藥物治療（如抗凝血劑）及化妝品（如保濕特性）等領(lǐng)域。本文對褐藻糖膠（Fucoidan）、紫菜多糖（Porphyran）、硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate）等3種硫酸多糖的酶活性抑制作用進(jìn)行探究。其中，褐藻糖膠是一種膳食纖維[6]，存在于海帶、裙帶菜和海蘊等褐藻的黏液中，在海參和其他動物體內(nèi)也有類似物質(zhì)，該化合物主要由數(shù)萬至數(shù)十萬個以α-1，2鍵和α-1，4鍵連接的L-巖藻糖組成，平均分子量約為200 000；紫菜多糖是一種以半乳糖為基本單位，存在于紫菜屬紅藻中的硫酸多糖，具有增稠、消炎和增強免疫力等功效[7]；硫酸軟骨素是一種存在于動物體內(nèi)的糖胺聚糖，在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的含量特別高，也廣泛存在于結(jié)締組織中（如皮膚、大腦和其他組織），大多數(shù)以蛋白聚糖的形式存在于細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面[8]。研究中使用的酶包括透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase）、膠原蛋白酶（Collagenase）、酪氨酸酶（Tyrosinase）和彈性蛋白酶（Elastase）。通過探究硫酸多糖對酶的抑制作用，以期為天然提取的硫酸多糖在食品藥品行業(yè)和化妝護(hù)膚品行業(yè)的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

褐藻糖膠（F5631，西格瑪公司）；紫菜多糖（S29753，源葉生物科技公司）；硫酸軟骨素（C9819，西格瑪公司）；透明質(zhì)酸酶（H3885，西格瑪公司）；Compound 48/80（C2313，西格瑪公司）；膠原蛋白酶（C1889，西格瑪公司）；酪氨酸酶（T3824，西格瑪公司）；彈性蛋白酶（E7885，西格瑪公司）；HEPES（賽默飛世爾科技公司）；其他所用試劑均為分析純。

電子天平BS 124S（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；超聲波清洗機XO-3200DT（南京先歐儀器制造有限公司）；臺式高速離心機TG16-W（長沙湘智離心機儀器有限公司）；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海青浦滬西儀器廠）；恒溫振蕩器HZ-C（太倉市實驗設(shè)備廠）；高速大容量冷卻離心機7780Ⅱ（日本久保田公司）；紫外可見分光光度計UV-1800（日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 多糖分子量測定

連接裝有Toyopearl HW-60和Toyopearl HW-70的色譜柱，將其浸入30 ℃的恒溫水浴中，用0.2 mol·L-1氯化鈉作為洗脫液，以1.3 mL·min-1的流速進(jìn)行凝膠滲透色譜分析。使用分子量分別為1 220 000、720 000、340 000、107 000、20 000和6 100的普魯蘭多糖Shodex STANDARD P-82作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以分子量為縱坐標(biāo)，保留時間為橫坐標(biāo)，繪制多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。各硫酸多糖樣品的濃度均為1.0 mg·mL-1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以普魯蘭當(dāng)量測得多糖分子量。

1.2.2 多糖硫酸基含量測定

精確稱取多糖樣品10 mg于試管中，加入1 mol·L-1 HCl 2 mL，在沸水中水解5 h；在60 ℃下減壓濃縮，干燥并凝固，加入少量超純水，重復(fù)干燥過程5次；再將凝固物溶解在10 mL超純水中，制得硫酸多糖樣品溶液。往0.5 mL樣品溶液中加入99%濃度乙醇2 mL；再加入BaCl2緩沖液1 mL、玫棕酸鈉溶液1.5 mL，充分?jǐn)嚢韬笤谑覝叵卤芄夥胖?0 min；于520 nm波長下測定溶液吸光度。以Na2SO4為標(biāo)樣，配制硫酸基濃度為0 μL·mL-1、9.6 μL·mL-1、19.2 μL·mL-1、28.8 μL·mL-1、38.4 μL·mL-1、48.0 μL·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測量吸光度。以硫酸基濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制硫酸基含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

1.2.3 硫酸多糖抑制酶活性試驗

（1）透明質(zhì)酸酶活性抑制試驗。參考MAEDA等[9]和KAKEGAWA等[10]的方法，將50 μL透明質(zhì)酸酶溶液（4.0 mg·mL-1）添加至100 μL硫酸多糖樣品（0.7 mg·mL-1），空白組添加0.1 mol·L-1乙酸緩沖液至樣品；37 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)20 min；添加100 μL活化劑Compound 48/80溶液（0.5 mg·mL-1），同樣37 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)20 min；繼續(xù)添加250 μL透明質(zhì)酸鈉溶液（0.8 mg·mL-1），37 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)40 min；繼續(xù)添加0.4 mol·L-1氫氧化鈉溶液100 μL后反應(yīng)中止；再添加0.8 mol·L-1硼酸溶液100 μL，水浴沸煮3 min；用冰水急速冷卻至室溫后，繼續(xù)添加p-DABA溶液3 mL，37 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)20 min；于585 nm波長下測定溶液吸光度。同時以0.7 mg·mL-1色甘酸（Cromolyn）為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做對照試驗。硫酸多糖抑制透明質(zhì)酸酶活性的計算公式為

式中：S為硫酸多糖樣品的吸光度值；SB為樣品空白的吸光度值；C為對照組的吸光度值；CB為空白對照的吸光度值。

（2）膠原蛋白酶活性抑制試驗。將50 μL膠原蛋白酶溶液（0.1 mg·mL-1）添加至50 μL硫酸多糖樣品（1.0 mg·mL-1），空白組添加超純水至樣品；繼續(xù)添加400 μL 0.5 mmol·L-1多肽（Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg）；37 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)40 min；添加1 mL 25 mmol·L-1檸檬酸溶液后反應(yīng)中止；繼續(xù)添加5 mL乙酸乙酯，激烈振動試管，再用離心機3 000 r·min-1離心分離10 min；取乙酸乙酯層于320 nm波長下測定溶液吸光度。同時以25 mmol·L-1（9.3 mg·mL-1）EDTA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做對照試驗。硫酸多糖抑制膠原蛋白酶活性按公式（1）計算。

（3）酪氨酸酶活性抑制試驗。往0.9 mL硫酸多糖樣品（1.0 mg·mL-1）中添加300 μL酪氨酸溶液（0.3 mg·mL-1），繼續(xù)添加1 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 6.8）；37 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)10 min；再添加100 μL酪氨酸酶溶液（5 000 U·mL-1），其中，空白組添加磷酸緩沖液；37 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)40 min；繼續(xù)添加50 μL 2 mol·L-1疊氮化鈉溶液后反應(yīng)中止，冰水急速冷卻至室溫后，于475 nm波長下測定溶液吸光度。同時以5 mmol·L-1（0.71 mg·mL-1）曲酸（Kojic Acid）為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做對照試驗。硫酸多糖抑制酪氨酸酶活性按公式（1）計算。

（4）彈性蛋白酶活性抑制試驗。向96孔分析微板加樣50 μL硫酸多糖（1.0 mg·mL-1），繼續(xù)添加25 μL彈性蛋白酶溶液（6 μg·mL-1），其中，空白組添加0.1 mol·L-1 HEPES緩沖液；將分析微板放置在4 ℃冷藏柜中反應(yīng)15 min；從冷藏柜拿出后繼續(xù)添加25 μL 8 mmol·L-1合成基質(zhì)（MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA），室溫下放置反應(yīng)30 min；于405 nm波長下測定溶液吸光度。同時以5.4 μg·mL-1彈性蛋白（Elastin）為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做對照試驗。硫酸多糖抑制彈性蛋白酶活性按公式（1）計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖分子量

采用凝膠滲透色譜法測得褐藻糖膠的分子量為344 000，紫菜多糖的分子量為100 000，硫酸軟骨素的分子量為69 000。

2.2 多糖硫酸基含量

經(jīng)測定，褐藻糖膠的硫酸基含量為22.7%，紫菜多糖的硫酸基含量為5.6%，硫酸軟骨素的硫酸基含量為16.1%。

2.3 硫酸多糖對生物酶的活性抑制

2.3.1 對透明質(zhì)酸酶的抑制活性

硫酸多糖樣品濃度均為0.7 mg·mL-1，抑制透明質(zhì)酸酶活性程度如圖3所示。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色甘酸的透明質(zhì)酸酶活性抑制率為71.3%；硫酸軟骨素的透明質(zhì)酸酶活性抑制率最高，為92.4%，高于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色甘酸；其次是紫菜多糖，酶活性抑制率為56.9%；最后是褐藻糖膠，酶活性抑制率為38.3%。以上結(jié)果表明，3種硫酸多糖對透明質(zhì)酸酶活性均有抑制作用。

2.3.2 對膠原蛋白酶的抑制活性

硫酸多糖樣品濃度均為1.0 mg·mL-1，抑制膠原蛋白酶活性程度如圖4所示。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)EDTA的膠原蛋白酶活性抑制率為71.0%；褐藻糖膠的膠原蛋白酶活性抑制率為39.8%；紫菜多糖的酶活性抑制率為0%；硫酸軟骨素的酶活性抑制率為0%。以上結(jié)果表明，僅褐藻糖膠對膠原蛋白酶活性有抑制作用，紫菜多糖、硫酸軟骨素對膠原蛋白酶均無抑制作用。

2.3.3 對酪氨酸酶的抑制活性

硫酸多糖抑制酪氨酸酶活性程度如圖5所示，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲酸的酪氨酸酶活性抑制率為76.2%。各硫酸多糖樣品濃度為1.0 mg·mL-1時，褐藻糖膠、紫菜多糖、硫酸軟骨素的酪氨酸酶活性抑制率分別為1.5%、1.9%、1.3%；為進(jìn)一步驗證硫酸多糖對酪氨酸酶的抑制程度，將多糖樣品濃度提升為15.0 mg·mL-1時，褐藻糖膠、紫菜多糖、硫酸軟骨素的酶活性抑制率分別為14.8%、22.1%、9.7%。試驗結(jié)果表明，3種硫酸多糖對酪氨酸酶活性抑制程度有限，而隨著多糖濃度的增加，對酪氨酸酶活性抑制作用有一定程度增強，可能是硫酸基含量的影響所致。

2.3.4 對彈性蛋白酶的抑制活性

硫酸多糖樣品濃度均為1.0 mg·mL-1，抑制彈性蛋白酶活性程度如圖6所示。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對彈性蛋白酶活性抑制率為58.6%；褐藻糖膠對彈性蛋白酶抑制活性最高，酶活性抑制率為62.1%；紫菜多糖酶活性抑制率為30.0%；硫酸軟骨素為酶活性抑制率34.4%。以上結(jié)果表明，褐藻糖膠對彈性蛋白酶活性有較強的抑制作用；紫菜多糖和硫酸軟骨素對彈性蛋白酶的抑制程度相當(dāng)，均為褐藻糖膠的一半左右。

3 結(jié)論

硫酸多糖在食品藥品等多領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[11-13]，本研究對褐藻糖膠、紫菜多糖、硫酸軟骨素抑制酶活性作用進(jìn)行了研究。褐藻糖膠顯示出對透明質(zhì)酸酶、膠原蛋白酶和彈性蛋白酶的抑制活性，這些特性有望使硫酸多糖在保濕護(hù)膚、抗黑色素生成、維持肌膚彈性等方面得到更多有效開發(fā)利用。紫菜多糖雖缺乏對膠原蛋白酶的抑制活性，但對透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶的活性均有抑制作用，同樣可以進(jìn)一步研究其在保健護(hù)膚及健康食品等方面的開發(fā)價值。硫酸軟骨素有極強的透明質(zhì)酸酶抑制活性，以及具有與紫菜多糖相當(dāng)?shù)膹椥缘鞍酌敢种苹钚?，因此硫酸軟骨素在保濕和維持肌膚彈性方面比紫菜多糖更有優(yōu)勢，然而與紫菜多糖同樣對膠原蛋白酶無抑制作用。3種硫酸多糖抑制酪氨酸酶活性作用均較弱，開發(fā)利用前景較小。

3種硫酸多糖對透明質(zhì)酸酶均有抑制作用，推測可能與多糖中的硫酸基有關(guān)，本研究因試驗樣本較少，未證實硫酸基含量與透明質(zhì)酸酶抑制活性之間有明顯的相關(guān)性，今后需進(jìn)一步研究驗證。此外，多糖分子量測量結(jié)果表明，分子量越小，硫酸多糖抑制透明質(zhì)酸酶活性作用越大；作為酶抑制劑，分子量越小的硫酸多糖比底物透明質(zhì)酸更容易與酶的活性位點結(jié)合，降低透明質(zhì)酸酶的催化速率。在其他3項酶活性抑制試驗中，硫酸多糖對膠原蛋白酶、酪氨酸酶和彈性蛋白酶的抑制活性與多糖分子量或硫酸基含量無明顯相關(guān)性。

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基金項目：安徽省高校自然科學(xué)研究重點項目“海洋綠藻中提取成分的相關(guān)活性研究”（KJ2020A0921）。

作者簡介：張洋（1988—），男，安徽蕪湖人，碩士，講師。研究方向：天然活性物質(zhì)。