辛夷6種溶劑順序提取物對黃瓜灰霉病菌的抑制作用

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摘要：采用順序提取法，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水6種溶劑對辛夷進行提取。結(jié)果表明：去離子水的提取率最大，為12.06%；石油醚次之，為9.63%。采用生長速率法和孢子萌發(fā)法分別測定了辛夷6種順序提取物對黃瓜灰霉病致病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制效果。結(jié)果表明：辛夷6種順序提取物對灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有抑制作用，且對菌絲生長的EC50基本小于1 000 mg/L，對孢子萌發(fā)的EC50均在1 300 mg/L以上，說明辛夷各溶劑提取物對菌絲生長的抑制效果均優(yōu)于孢子萌發(fā)；石油醚、氯仿和去離子水提取物對菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為372.15 mg/L和1 318.92 mg/L，229.84 mg/L和1965.50 mg/L以及845.44 mg/L和4 321.80 mg/L。

關(guān)鍵詞：辛夷；順序提取物；灰葡萄孢菌；抑制作用

中圖分類號：X 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）09-0009-04

植物是生物活性化合物的天然寶庫，研究和開發(fā)植物源農(nóng)藥是一條研發(fā)新農(nóng)藥的有效途徑。植物源農(nóng)藥具有易降解、低毒性、對環(huán)境污染小等特點，符合當今社會的發(fā)展趨勢，已成為研究的熱點。辛夷是我國一種傳統(tǒng)中藥，是望春玉蘭花蕾的統(tǒng)稱[1]。辛夷提取物具有抑菌活性，起抑菌作用的主要活性成分存在于其揮發(fā)油中[2-4]。以不同溶劑的辛夷提取物為材料，研究其對黃瓜灰霉病致病菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）的菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用，為辛夷作為植物源農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 辛夷提取物的制備

采用索氏提取法[5-6]，選取極性不同的溶劑（石油醚<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<水），按照溶劑極性由小到大的順序，對辛夷依次進行提取。然后，將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到黏稠膏狀粗提物，稱定質(zhì)量并計算其提取率。此后，置于4 ℃冰箱保存。提取率計算公式為：

提取率（%）=×100% （1）

無菌條件下，用微量二甲基亞砜（不超過總體積2%）分別將6種不同溶劑的提取物充分溶解，再用無菌水配制成40 000 mg/L的母液。此后，采用二倍稀釋法將母液配成40 000、20 000、10 000、5 000、2 500 mg/L等5個濃度梯度。

1.2 供試菌株

灰葡萄孢菌從感染灰霉病的黃瓜上分離、純化獲得，保存于聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)實驗室。

1.3 離體生物測定

1.3.1 生長速率法 采用生長速率法[7]測定辛夷的6種溶劑提取物對菌絲生長的抑制效果。培養(yǎng)基為含藥PDA（葡萄糖-馬鈴薯-瓊脂培養(yǎng)基），空白對照不加藥；提取物終濃度分別為4 000、2 000、1 000、500、250 mg/L；菌餅直徑為0.5 cm；十字交叉法測量菌落直徑，3次重復(fù)。根據(jù)菌落直徑計算菌絲生長抑制率，公式如下：

校正直徑=平均直徑-菌餅直徑 （2）

抑制率（%）=×100% （3）

1.3.2 孢子萌發(fā)法 以孢子萌發(fā)法[8]（懸滴法）測定辛夷的6種溶劑提取物對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用。提取物終濃度分別為4 000，2 000，1 000，500，250 mg/L，3次重復(fù)，根據(jù)下列公式計算抑制率：

萌發(fā)率（%）=孢子萌發(fā)數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100% （4）

抑制率（%）=×100%（5）

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

應(yīng)用Microsoft Excel軟件處理數(shù)據(jù)；采用SPSS 10.0軟件建立毒力回歸曲線，將抑菌的百分率轉(zhuǎn)換成幾率值，濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)，進行幾率值分析，分別求出辛夷的6種溶劑提取物對灰葡萄孢菌的抑制濃度（EC50）[9]；利用DPS v3.01專業(yè)版軟件，采用Duncar新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛夷提取率

采用6種溶劑對辛夷進行順序提取，計算各樣品的提取率，結(jié)果如表1所示。

提取率的高低反映植物材料在溶劑中溶解量的多少。由表1可以看出：各種溶劑之間的提取率差別較大，其中去離子水對辛夷的提取率最高，為12.06%；石油醚的提取率次之，為9.63%；丙酮的提取率最低，為1.99%。

2.2 辛夷6種順序提取物對黃瓜灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制作用

辛夷提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制作用分別如表2和表3所示。

由表2可以看出：辛夷的6種順序提取物對灰葡萄孢菌的菌絲生長起抑制作用，但各溶劑提取物之間的差距較大；石油醚提取物的抑菌效果最好，其次為丙酮提取物，在4 000 mg/L濃度時，抑菌率分別為99.19%和97.40%；乙醇的提取物抑菌效果最差，在

4 000 mg/L時，抑菌率僅為76.96%。

由表3可以看出：各提取物的相關(guān)系數(shù)均大于0.900 0，相關(guān)性較高；EC50最小的是氯仿提取物，為229.84 mg/L；其次為丙酮提取物，為316.48 mg/L；去離子水的EC50較高，為845.44 mg/L；菌絲EC50最高的為乙醇提取物，為1 019.82 mg/L。相對來說，溶劑極性越小，其提取物對菌絲的抑制效果越明顯。

2.3 辛夷6種順序提取物對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用

辛夷提取物對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制濃度（EC50）如表4和表5所示。

由表4可以看出：辛夷的6種順序提取物對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)均有抑制作用；在濃度為4 000 mg/L時，石油醚提取物抑制效果最好，孢子萌發(fā)抑制率為79.50%；丙酮提取物與水提取物的抑菌效果都較差，孢子萌發(fā)抑制率分別為47.26%和46.17%，均不到50.00%。

由表5可以看出：石油醚提取物對孢子萌發(fā)的EC50最小，為1 318.92 mg/L；其次為氯仿提取物，EC50為1 965.50 mg/L；EC50最大的是水提取物，為

4 321.80 mg/L。由此可以看出，溶劑的極性越小，其提取物對孢子萌發(fā)的抑制作用越明顯。

3 結(jié)論與討論

采用順序提取法，用6種溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水）對辛夷進行提取。結(jié)果表明：去離子水的提取率最大，為12.06%；石油醚次之，為9.63%。

采用生長速率法測定各樣品對菌絲生長的抑制作用，孢子萌發(fā)法測定各樣品對孢子萌發(fā)的抑制作用。結(jié)果表明：辛夷6種溶劑的順序提取物對灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有抑制作用；其中，石油醚、氯仿提取物對菌絲生長的EC50分別為372.15 mg/L和229.84 mg/L，對孢子萌發(fā)的EC50分別為

1 318.92 mg/L和1 965.50 mg/L，抑菌效果較好；水提取物對菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為845.44 mg/L和4 321.80 mg/L，抑菌效果相對較差。

綜上說明，辛夷中的一些物質(zhì)雖易被去離子水提取，但這些物質(zhì)沒有抑菌活性。辛夷的主要抑菌活性物質(zhì)為脂溶性物質(zhì)，易被有機溶劑提取，且溶劑極性越小，提取液對孢子萌發(fā)的抑制效果越明顯；用單一溶劑提取辛夷的有效成分時，可以選擇石油醚或氯仿，以及與兩者極性相當或極性處于兩者之間的溶劑。6種測試溶劑提取物對菌絲生長的抑制效果優(yōu)于對孢子萌發(fā)的抑制效果。

目前，國內(nèi)利用植物粗提物抑制病原菌的研究還有很多。如王桂清[10]通過采用生長速率法和孢子萌發(fā)法測定了遼細辛根的不同溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇）粗提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)細辛的不同溶劑提取物對灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，并且對孢子萌發(fā)的抑制效果要好于對菌絲生長的抑制效果；其中石油醚提取物的抑菌效果較好，其對菌絲生長的EC50分別為177.44 mg/L與159.98 mg/L，對孢子萌發(fā)的EC50分別為173.23 mg/L與125.29 mg/L。王樹桐等[11]研究了丁香的甲醇提取物對番茄灰霉病菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)當提取物濃度為20 000 mg/L和

10 000 mg/L時，對菌絲的抑制率達到80%以上，當提取物濃度為10 000 mg/L時，完全抑制孢子的產(chǎn)生，濃度為5 000 mg/L時，對產(chǎn)孢的抑制率為85.40%，濃度進一步稀釋的話則不再表現(xiàn)顯著抑制作用。國內(nèi)對辛夷的抑菌作用也有所研究。李紅梅等[3]測試了123種中草藥提取物對板藍根根腐病菌（Fusarium solani）菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)辛夷提取物0.01 g/mL濃度時對菌絲生長的抑制率為11.58%，對孢子萌發(fā)的抑制率為6.00%。王樹桐等[4]研究測試了123種常見中草藥提取物對香蕉鐮刀菌枯萎病病原菌（F. oxysporum）的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)辛夷提取物1%的濃度對菌株B1和B2的菌絲生長抑制率分別為76.56%和24.73%，對孢子萌發(fā)的抑制率分別為40.06%和61.62%。

眾多的研究結(jié)果表明，利用一些植物提取物來作為植物源殺菌劑是可行的，且發(fā)展前景較為廣闊。為了能夠更好地利用植物源殺菌劑，研究清楚其有效成分勢在必行。辛夷含有的抑菌活性物質(zhì)可能不止一種，各物質(zhì)之間的抑菌活性可能是相輔相成的，可進行層析分離和質(zhì)譜分析，進一步測定各分離物質(zhì)對灰葡萄孢菌的抑菌活性。

參考文獻

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