哈茨木霉菌對(duì)灰葡萄孢菌生長(zhǎng)的抑制及培養(yǎng)基優(yōu)化研究

牛東東　馮振群　翟清云

摘要 哈茨木霉菌是一種重要的生防菌，灰葡萄孢菌是番茄灰霉病的病原菌，通過對(duì)峙試驗(yàn)研究哈芡木霉菌對(duì)灰葡萄孢菌的抑制作用。結(jié)果表明，該哈茨木霉菌在室內(nèi)能夠很好地抑制灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)。哈茨木霉菌的培養(yǎng)采用固液雙相培養(yǎng)的方法，用正交試驗(yàn)優(yōu)化法分別對(duì)液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，該哈茨木霉菌在優(yōu)化好的固液雙相培養(yǎng)基上能產(chǎn)生5.6×109個(gè)孢子。

關(guān)鍵詞 哈茨木霉菌；灰葡萄孢菌；抑制作用；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號(hào) Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）14-0098-01

Abstract Trichoderma harzianum is a kind of important biocontrol fungus.Botrytis cinerea Pers is the pathogen of tomato grey mould.The results of dual culture showed that the T.harzianum could restrain the growth of Botrytis cinerea Pers.Cultivation of T.harzianum adopted the solid-liquid two-phase method，used orthogonal test of the liquid medium and solid medium to optimize.The results showed that the T.harzianum could produce 5.6×109 spores in the mediums.

Key words Trichoderma harzianum；Botrytis cinerea Pers；inhibitory action；medium optimization

番茄灰霉病是危害番茄的主要病害之一，該致病菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers），能夠侵染番茄葉片、莖和青果等植株地上部分，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成大量爛花、爛果，直接影響產(chǎn)量。木霉菌作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面等生態(tài)環(huán)境中，具有適應(yīng)性強(qiáng)、存在范圍廣和廣譜、高效等優(yōu)點(diǎn)[1]。哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）是木霉菌中應(yīng)用最早、最廣的一個(gè)菌種，可以用于預(yù)防由腐霉菌、立枯絲核菌、鐮刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害[2-3]。

哈茨木霉孢子耐受性強(qiáng)，易于加工成制劑，是一類重要的生防真菌，其真菌孢子培養(yǎng)主要采用固體發(fā)酵。固體發(fā)酵雖然操作簡(jiǎn)單，但易受雜菌污染，產(chǎn)生孢子低，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)效率低。目前，主要采用先用液體發(fā)酵產(chǎn)生菌絲，再將菌液接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生孢子的固液雙相發(fā)酵培養(yǎng)模式。正交試驗(yàn)優(yōu)化法是優(yōu)化培養(yǎng)基常用的方法。因此，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化法對(duì)哈茨木霉的培養(yǎng)進(jìn)行初步優(yōu)化，為其在生防中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

供試菌種為哈茨木霉菌、番茄灰葡萄孢菌，由河南省生物農(nóng)藥工程研究中心分離獲得；試驗(yàn)儀器有恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、冰箱；試劑有葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、NaCl、NaOH、HCl；培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 哈茨木霉菌對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。平板對(duì)峙培養(yǎng)是研究生防菌效價(jià)最常用的方法之一，該方法操作簡(jiǎn)單，能直接觀察抑制效果，因而本試驗(yàn)采用平板對(duì)峙培養(yǎng)測(cè)定哈茨木霉菌對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制效果[4]。具體操作如下：在PDA培養(yǎng)基中心位置接種直徑為6 mm的番茄灰葡萄孢菌菌餅，距離平板中心兩側(cè)2 cm處，分別接種一塊直徑為6 mm的哈茨木霉菌菌餅，以只接種番茄灰葡萄孢菌菌餅為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)6～9 d后，與對(duì)照對(duì)比，觀察記載哈茨木霉菌對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制情況，每組處理3次重復(fù)。

1.2.2 哈茨木霉菌培養(yǎng)基優(yōu)化。

（1）液體培養(yǎng)基優(yōu)化。取制好的哈茨木霉菌孢子種子液（濃度為108 cfu/mL），按1%接種量分別接種于不同處理的液體培養(yǎng)基中，采用4因素3水平正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表1。培養(yǎng)條件為25 ℃，搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，7 d后過濾菌絲，80 ℃烘干并稱量菌絲干重[5-6]。每個(gè)處理3次重復(fù)。

（2）固體培養(yǎng)基優(yōu)化。取培養(yǎng)7 d的哈茨木霉菌菌絲懸浮液種子液（菌絲干重約為0.002 g/mL）按20%接種量分別接種于不同處理的固體蛭石培養(yǎng)基中，采用4因素3水平正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表2。培養(yǎng)條件為25 ℃，培養(yǎng)5 d，5 d后采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算孢子數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉菌對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制作用

由圖1可知，茨木霉菌在室內(nèi)對(duì)番茄灰葡萄孢菌有很好的抑制效果。哈茨木霉菌在PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)迅速，第3天哈茨木霉菌就表現(xiàn)出對(duì)番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。對(duì)（下轉(zhuǎn)第102頁(yè)）

峙試驗(yàn)第5天時(shí)，可以明顯看出哈茨木霉菌繼續(xù)生長(zhǎng)，占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)皿，番茄灰葡萄孢菌菌絲出現(xiàn)濃縮、消解等現(xiàn)象。在顯微鏡觀察下，哈茨木霉菌菌絲入侵番茄灰葡萄孢菌菌落，番茄灰霉菌絲出現(xiàn)斷裂。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，最終番茄灰霉病菌完全被抑制，直至死亡消失。

2.2 哈茨木霉菌的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 液體培養(yǎng)基優(yōu)化。將哈茨木霉菌孢子接種到表1中配方水平的培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后，稱量菌絲干重，結(jié)果見表3。可以看出，該哈茨木霉菌液體培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖1.5%、（NH4）2SO4 0.25%、酵母粉4%、花生餅粉4%。endprint

2.2.2 固體培養(yǎng)基優(yōu)化。將哈茨木霉菌菌絲接種到表2的固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后，通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，該哈茨木霉菌液體培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖1.5%、酵母粉2%、花生餅粉4%、麥麩6%。

3 結(jié)論與討論

哈茨木霉菌是一種重要的生防菌，能夠抑制多種植物病原菌生長(zhǎng)。平板對(duì)峙試驗(yàn)表明，哈茨木霉菌能夠很好地抑制番茄灰霉病菌生長(zhǎng)[7]。以往研究多側(cè)重于哈茨木霉菌菌絲的生長(zhǎng)，但菌絲不易于保存及應(yīng)用，加工成制劑困難。國(guó)外已有商品化的哈茨木霉菌成品，多數(shù)是孢子制劑。本試驗(yàn)哈茨木霉菌在優(yōu)化的固液雙向培養(yǎng)基上能產(chǎn)生5.6×109個(gè)孢子，方便加工成制劑及運(yùn)輸。

本試驗(yàn)僅限于室內(nèi)平板培養(yǎng)，對(duì)于該哈茨木霉菌在大田生產(chǎn)上是否具有良好的防效有待于進(jìn)一步研究。哈茨木霉菌的孢子具有抗性強(qiáng)、耐儲(chǔ)存、方便運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，液體發(fā)酵生產(chǎn)出較多菌絲，固體發(fā)酵易受雜菌的污染，產(chǎn)生孢子低，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，因而采用固液雙相發(fā)酵的方法是一種不錯(cuò)的選擇。正交優(yōu)化初步對(duì)哈茨木霉菌培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，哈茨木霉菌產(chǎn)生孢子受光照、溫度等很多條件的影響，下一步需要通過正交優(yōu)化或者響應(yīng)面法進(jìn)一步深度優(yōu)化[8]。

4 參考文獻(xiàn)

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