發(fā)酵大彈涂魚(yú)飼料乳酸菌的篩選鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

■ 楊 露 袁勇軍

（浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100）

大彈涂魚(yú)是分布于沿海灘涂的廣溫、廣鹽、兩棲的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，具有高蛋白、低脂肪、高維生素含量的特點(diǎn)，肉質(zhì)鮮美，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，市場(chǎng)需求量大[1]。目前，江蘇、廣西、福建和浙江等省都開(kāi)展了大彈涂魚(yú)養(yǎng)殖[2]。近年來(lái)，大彈涂魚(yú)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，病害防治的問(wèn)題日益突出[3]，尤其是魚(yú)體免疫力低下導(dǎo)致的體表潰爛出血、細(xì)菌感染，養(yǎng)殖效益不穩(wěn)定[4]。

傳統(tǒng)魚(yú)類養(yǎng)殖中，常采用抗生素類藥物來(lái)防治疾病、促進(jìn)生長(zhǎng)、節(jié)約營(yíng)養(yǎng)成分，但大部分抗生素類藥物會(huì)在水環(huán)境中累積，長(zhǎng)期使用會(huì)加重水體負(fù)擔(dān)，對(duì)魚(yú)機(jī)體健康造成危害[5]。我國(guó)于2020 年1 月1 日起獸藥中禁止使用除中草藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物添加劑品種，2020 年7 月1 日起飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑（中草藥類除外）的商品飼料。因此，尋找抗生素的替代物是漁業(yè)養(yǎng)殖的必然要求和發(fā)展趨勢(shì)。

乳酸菌是一類能從發(fā)酵性碳水化合物中產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的統(tǒng)稱，對(duì)宿主具有多種有益作用，如可增強(qiáng)魚(yú)類機(jī)體免疫力[6]，幫助腸道消化[7]，抵御病原菌[8]，改善水質(zhì)[9]，促進(jìn)生長(zhǎng)和繁殖[10]，具有極大的抗生素替代品潛力[11]。目前，對(duì)乳酸菌的應(yīng)用研究集中在豬、牛和羊等畜禽動(dòng)物，在魚(yú)類上的應(yīng)用相對(duì)較少[12]，許多從恒溫動(dòng)物分離出來(lái)的乳酸菌在水產(chǎn)動(dòng)物消化道內(nèi)存活時(shí)間短、穩(wěn)定性差、對(duì)腸道菌群調(diào)控能力弱，難以發(fā)揮其真正的益生效果[13]。本研究將從大彈涂魚(yú)腸道內(nèi)分離篩選出適應(yīng)性廣、生物活性強(qiáng)、發(fā)酵能力強(qiáng)的乳酸菌，將乳酸菌應(yīng)用于大彈涂魚(yú)飼料發(fā)酵并研究其發(fā)酵條件，為功能性大彈涂魚(yú)飼料的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)，并豐富乳酸菌在水產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用研究。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)用魚(yú)

從寧波市江北區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)購(gòu)買鮮活健康的大彈涂魚(yú)，選取體重在30～40 g/尾、魚(yú)體表面無(wú)傷痕和寄生蟲(chóng)者。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）、瓊脂粉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、PBS緩沖液（0.01 mol/L，北京索萊寶科技有限公司）、鹽酸（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、氫氧化鈉（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、膽鹽（生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、基礎(chǔ)飼糧（漳州健康水族用品有限公司，原料主要包括魚(yú)粉、南極磷蝦粉、豆粕等）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

QL-861 渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），ZHWY-2112B 大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩箱（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司），5810R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司），Nikon 80i 熒光顯微鏡（日本尼康公司），SpectraMax M3 酶標(biāo)儀（美國(guó)分子儀器公司）。

1.3 乳酸菌的分離純化及初步鑒定

所有操作在超凈臺(tái)進(jìn)行，保持無(wú)菌狀態(tài)。先用75%的酒精對(duì)魚(yú)體表面進(jìn)行消毒，剪開(kāi)腸道，用生理鹽水沖洗雜質(zhì)，碾碎后加入PBS 緩沖液進(jìn)行均質(zhì)，取上清液在8 000 r/min 下離心2 min，取沉淀用PBS 緩沖液稀釋，冰箱4 ℃保存。

在50 mL三角瓶中加入20 mL MRS液體培養(yǎng)基，加入0.4 mL腸道分離的菌液，瓶口使用透氣封口膜包裹，分別在28、32、37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，將所得菌液培養(yǎng)液稀釋到合適的倍數(shù)，涂布于MRS-CaCO3平板，挑取具有明顯鈣溶圈的菌落，重復(fù)劃線三次以上，至菌落形態(tài)一致。觀察分離純化的菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭氏染色，參照凌代文《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[14]進(jìn)行雙氧水試驗(yàn)、氧化酶試紙?jiān)囼?yàn)。

1.4 優(yōu)勢(shì)乳酸菌的篩選

1.4.1 產(chǎn)酸能力測(cè)定

將經(jīng)過(guò)初步鑒定的乳酸菌菌株用MRS 液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，用pH儀對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 抑菌能力測(cè)定

選取副溶血性弧菌和哈維氏弧菌作為指示菌，將200 μL 副溶血性弧菌和哈維氏弧菌接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，得到2×105CFU/mL 濃度的菌懸液。在MRS 固體培養(yǎng)基上注入0.2 mL菌懸液，用涂布器涂布均勻。在培養(yǎng)基表面垂直擺放牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基表面接觸無(wú)空隙。在杯中加入初篩乳酸菌菌液，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以牛津杯周圍沒(méi)有肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)域?yàn)橐志Γ糜螛?biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.4.3 耐膽鹽能力測(cè)定

在MRS液體培養(yǎng)基中分別加入0.1%、0.2%、0.3%濃度的膽鹽，將培養(yǎng)24 h 后的菌液按3.0%接種量接種，37 ℃處理3 h，以不添加膽鹽的MRS 液體培養(yǎng)基為空白組。處理完畢后，對(duì)每組菌液進(jìn)行梯度稀釋，取3 個(gè)合適的稀釋度，取200 μL 涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)菌落數(shù)，記錄結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算乳酸菌的存活率。

存活率（%）=Y1/Y×100

式中：Y1——為處理組中乳酸菌存活菌數(shù)（個(gè)）；

Y——空白對(duì)照組中乳酸菌存活菌數(shù)（個(gè)）。

1.4.4 耐酸能力測(cè)定

用1 mol/L 的HCl 將MRS 液體培養(yǎng)基的pH 分別調(diào)節(jié)成3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，將菌株按3.0%的接種量接種，37 ℃處理3 h，以不調(diào)節(jié)pH 的MRS 液體培養(yǎng)基為空白組。處理完畢后，按1.4.3 中的方法進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算乳酸菌的存活率。

1.4.5 發(fā)酵飼料性能的測(cè)定

將不同種類、不同配比的乳酸菌分別按3.0%添加量加入飼料底物中，放入帶單向氣閥的發(fā)酵袋中，控制發(fā)酵過(guò)程中水分含量為60%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時(shí)間控制在3 d，發(fā)酵結(jié)束后，放入40 ℃烘箱烘干3 d，對(duì)粗蛋白、干物質(zhì)回收率進(jìn)行測(cè)定評(píng)分，選出最優(yōu)菌種和配比。

1.4.6 優(yōu)勢(shì)乳酸菌的生物學(xué)鑒定

由華大基因公司進(jìn)行檢測(cè)。采用通用引物擴(kuò)增16S rRNA，正向引物27F，反相引物1 492R。3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，觀察條帶性狀。PCR 產(chǎn)物純化按照磁珠純化標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作，利用磁珠能夠吸附或者釋放帶電荷物質(zhì)的原理，在高鹽低pH 溶液吸附DNA，在低鹽高pH 溶液釋放DNA，從而達(dá)到分離提純DNA 產(chǎn)物的目的。將純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST 比對(duì)以及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.4.7 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將試驗(yàn)篩選出來(lái)的優(yōu)勢(shì)乳酸菌株按3.0%的比例接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，設(shè)3 個(gè)平行，每隔2 h 取樣，測(cè)定其OD600值，記錄數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化

參考孫中超[15]的方法，將乳酸菌發(fā)酵菌液、無(wú)菌水按比例加入基礎(chǔ)飼糧中，放入單向氣閥發(fā)酵袋中，混合均勻，排出多余空氣后用封口機(jī)封口，在適宜溫度下發(fā)酵相應(yīng)天數(shù)，發(fā)酵結(jié)束后，放入40 ℃烘箱烘干3 d，得到發(fā)酵飼料，置于4 ℃冰箱保藏存放。

單因素試驗(yàn)：乳酸菌接種量（1%、2%、3%、4%）、發(fā)酵溫度（17、27、37、47 ℃）、初始含水量（50%、60%、70%、80%）和發(fā)酵時(shí)間（1、3、5、7 d）對(duì)飼料粗蛋白含量的影響。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始含水量（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）作為影響因素，以發(fā)酵飼料粗蛋白含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L（934）正交試驗(yàn)，確定乳酸菌發(fā)酵飼料的最佳工藝。

1.6 飼料感官評(píng)價(jià)

對(duì)發(fā)酵飼料進(jìn)行顏色、氣味、質(zhì)地的感官評(píng)價(jià)，參照GB/T 10220—2012《感官分析 方法學(xué)總論》、GB/T 21172—2007《感官分析 食品顏色評(píng)價(jià)的總則和檢驗(yàn)方法》，并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)制定了乳酸菌發(fā)酵飼料感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示：

表1 乳酸菌發(fā)酵飼料感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1.7 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，方法中除正交試驗(yàn)外，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化及初步鑒定

統(tǒng)計(jì)在不同溫度培養(yǎng)條件下初篩、復(fù)篩得到的乳酸菌數(shù)，結(jié)果如表2 所示。從表2 可知，在37 ℃條件下分離篩選得到的乳酸菌更多，選用37 ℃作為本研究中乳酸菌的培養(yǎng)溫度。

表2 不同培養(yǎng)溫度下篩選所得乳酸菌數(shù)（個(gè)）

最終篩選出22 株菌，菌落形態(tài)呈現(xiàn)出不透明的乳白色圓形、表面光滑較圓、中間微隆起，同時(shí)在MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基上有明顯鈣溶圈。22 株乳酸菌的革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性、3%雙氧水和氧化酶試紙?jiān)囼?yàn)均顯示陰性，符合乳酸菌的生理生化特點(diǎn)，初步鑒定為乳酸菌。

2.2 優(yōu)勢(shì)乳酸菌的篩選

2.2.1 不同菌株產(chǎn)酸能力

乳酸菌是一類可以代謝乳糖產(chǎn)生乳酸，從而降低發(fā)酵產(chǎn)品pH 的一類微生物。乳酸菌在飼料發(fā)酵過(guò)程中的一大作用就是產(chǎn)酸，保證發(fā)酵環(huán)境的低pH，從而能夠有效抑制其他微生物的生長(zhǎng)繁殖，特別是一些有害微生物。乳酸菌的產(chǎn)酸能力是篩選發(fā)酵乳酸菌的重要特性。

選取pH 為4.6 以下的菌株為產(chǎn)酸能力較好的菌株，從表3 可知，菌株Bp1、Bp9、Bp15、Bp17、Bp19、Bp20有較好的產(chǎn)酸能力。

表3 22株乳酸菌產(chǎn)酸能力

2.2.2 不同菌株的抑菌能力

大彈涂魚(yú)作為一種常見(jiàn)的海水魚(yú)，容易遭受弧菌的侵害，通過(guò)口或傷口感染，可致使大彈涂魚(yú)肌肉潰爛化膿以及內(nèi)臟器官的嚴(yán)重病變，或引起敗血癥而導(dǎo)致病魚(yú)死亡。以常見(jiàn)的海水魚(yú)致病菌副溶血性弧菌和哈維氏弧菌為指示菌，比較抑菌圈的直徑大小，通過(guò)圖1 我們可以看出菌株Bp1、Bp17、Bp19、Bp20、Bp22 具有較好的抑菌能力，其抑菌圈直徑明顯大于15 mm。

圖1 22株乳酸菌對(duì)副溶血性弧菌和哈維氏弧菌的抑菌能力

綜合產(chǎn)酸能力和抑菌能力，最終選擇菌株Bp1、Bp17、Bp19、Bp20進(jìn)行下一步篩選。

2.2.3 不同菌株的耐膽鹽能力

乳酸菌在魚(yú)體內(nèi)發(fā)揮益生作用的前提是其可在魚(yú)體腸道中存活并定植，而乳酸菌要到達(dá)并定植于腸道，必須對(duì)膽鹽有一定的耐受性。如圖2 所示4 株乳酸菌在不同濃度膽鹽下的存活率，從圖中可以看出，不同濃度膽鹽對(duì)4 株菌的存活率均有影響，膽鹽濃度越高，乳酸菌存活率越低，0.3%膽鹽處理后，4 株菌的存活率均為0。菌株Bp1 和Bp20 耐膽鹽能力相對(duì)較高，經(jīng)過(guò)0.1%膽鹽處理，存活率均在13%以上，經(jīng)過(guò)0.2%膽鹽處理，存活率均在5%以上。

圖2 4株乳酸菌對(duì)不同濃度膽鹽的耐受力

2.2.4 不同菌株耐酸性能力

飼料發(fā)酵過(guò)程中由于微生物的作用，產(chǎn)生大量有機(jī)酸，使得pH 逐漸降低。為了適應(yīng)發(fā)酵的酸性環(huán)境，篩選出的優(yōu)良菌株應(yīng)具備較好的耐酸性。如圖3 所示的4株乳酸菌在不同酸性條件下的存活率，在pH≥6時(shí)，4 株乳酸菌存活率均在95%以上，當(dāng)pH＜6 時(shí)，存活率均在25%以下，菌株Bp1 和Bp20 顯示出較好的耐酸性。

圖3 4株乳酸菌對(duì)不同pH的耐受力

綜合耐膽鹽能力和耐酸能力，最終選擇菌株Bp1和Bp20進(jìn)行下一步的飼料發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2.5 不同菌株發(fā)酵飼料的能力

發(fā)酵后飼料的粗蛋白、干物質(zhì)回收率是判斷飼料質(zhì)量高低的重要指標(biāo)，其中，A 組加入Bp1 乳酸菌，B組加入Bp20 乳酸菌，C 組加入（Bp1∶Bp20）1∶1 混合菌液，D 組加入2∶1 混合菌液，E 組加入1∶2 混合菌液。從圖4 中可以看出，A 組加入3.0% Bp1 菌液的飼料粗蛋白含量和干物質(zhì)回收率分別為34.2% 和82.9%，均高于其他4 組，B 組加入3.0% Bp20 菌液的飼料粗蛋白含量和干物質(zhì)回收率分別為27.3%和76.8%，均低于其他4 組；比較C、D 兩組，隨著B(niǎo)p1 菌液比例的增加，粗蛋白含量由31.3%變?yōu)?3.2%，干物質(zhì)含量由78.1%變?yōu)?0.5%，結(jié)果逐漸接近A 組；比較C、E 兩組，隨著B(niǎo)p20 菌液比例的增加，粗蛋白含量由31.3%變?yōu)?9.1%，干物質(zhì)含量由71.8%變?yōu)?3.9%，結(jié)果逐漸接近B 組。綜上，A 組飼料發(fā)酵效果更好、質(zhì)量更高，僅接種菌株Bp1 更適合用于發(fā)酵大彈涂魚(yú)飼料。

圖4 5組發(fā)酵飼料的粗蛋白和干物質(zhì)回收率

2.2.6 優(yōu)勢(shì)乳酸菌的基因鑒定結(jié)果

測(cè)得菌株Bp1瓊脂糖凝膠條帶長(zhǎng)度在1 700 bp左右，符合乳酸菌的特性，同時(shí)，經(jīng)過(guò)圖5 進(jìn)化樹(shù)同源性分析，能夠確定該菌為發(fā)酵黏液乳桿菌。

圖5 Bp1進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建圖

2.2.7 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

從圖6 中可以看出，試驗(yàn)所選的優(yōu)勢(shì)乳酸菌初始OD600值0.3左右，在8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600值快速上升，12 h 后生長(zhǎng)達(dá)到高峰，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。在飼料發(fā)酵過(guò)程中，我們應(yīng)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的活躍乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，即10～13 h內(nèi)的菌液。

圖6 菌株Bp1的生長(zhǎng)曲線

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

通過(guò)單因素試驗(yàn)，得到結(jié)果如圖7所示。由圖7（A）所知，接種量在3%左右時(shí)，飼料粗蛋白含量最高，高達(dá)41.50%，接種量大于3%，粗蛋白含量開(kāi)始減少；由圖7（B）所知，隨著溫度的加，粗蛋白含量緩慢增加，37 ℃左右時(shí)，到達(dá)最高值37.96%，隨后飼料粗蛋白含量直線下降；由圖7（C）所知，隨著含水量的遞增，粗蛋白含量先增加后降低，飼料底物初始含水量在60%左右時(shí)，飼料粗蛋白含量最高，達(dá)到38.90%；由圖7（D）所知，發(fā)酵時(shí)間在5 d左右時(shí)，飼料粗蛋白含量最高，為35.96%，隨著發(fā)酵時(shí)間的持續(xù)增加，蛋白質(zhì)含量下降，趨近于30%。

圖7 4個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果折線圖

通過(guò)正交試驗(yàn)，得到結(jié)果如表4所示。從表4中可以看出，A1 的影響反映在第1、2、3 號(hào)試驗(yàn)中，A2 的影響反映在第4、5、6號(hào)試驗(yàn)中，A3的影響反映在第7、8、9號(hào)試驗(yàn)中。A 因素的1 水平所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)指標(biāo)之和為KA1=y1+y2+y3=36.83+35.92+29.14=101.89，kA1=KA1/3=33.96；A 因素的2 水平所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)指標(biāo)之和為KA2=y4+y5+y6=27.05+36.61+21=94.66，kA2=KA2/3=31.55；A因素的3 水平所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)指標(biāo)之和為KA3=y7+y8+y9=25.87+24.83+29.77=80.47，kA3=KA3/3=26.82；kA1＞kA2＞kA3說(shuō)明A 因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響，A1 為A 因素的優(yōu)水平，即發(fā)酵飼料最優(yōu)的菌種接種量為2.0%。

表4 試驗(yàn)結(jié)果分析

同理可得，發(fā)酵飼料最優(yōu)的發(fā)酵溫度為37 ℃、最優(yōu)含水量為60%、最優(yōu)發(fā)酵天數(shù)為3 d。在最優(yōu)工藝條件下，進(jìn)行飼料發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，得到飼料pH 為5.6，粗蛋白含量為（37.04±0.32）%，結(jié)果指標(biāo)均優(yōu)于9組試驗(yàn)組。

2.4 飼料感官評(píng)價(jià)

根據(jù)飼料評(píng)分表，對(duì)正交試驗(yàn)里的9 組處理組以及最佳發(fā)酵工藝下的第10 組飼料進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果如表5 所示，1、5 組實(shí)驗(yàn)組的感官評(píng)分較高，印證了D 因素對(duì)發(fā)酵飼料影響最大，第7 組試驗(yàn)組感官評(píng)分最低，其A、D 兩個(gè)因素均處于水平3，不適合用于發(fā)酵魚(yú)飼料。在最優(yōu)工藝條件下，經(jīng)過(guò)發(fā)酵的魚(yú)飼料顏色為紅褐色，質(zhì)地松散而不粘連，有淡淡的酸酒香味，說(shuō)明通過(guò)乳酸菌的發(fā)酵提高了飼料風(fēng)味和感官指標(biāo)。

表5 乳酸菌發(fā)酵飼料感官評(píng)定結(jié)果

3 討論

乳酸菌發(fā)酵飼料是以乳酸菌發(fā)酵為核心，將飼料原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和大分子物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化和分解，產(chǎn)生適口性好、富含大量活性乳酸菌及其代謝產(chǎn)物的微生態(tài)飼料[16]。目前，乳酸菌發(fā)酵飼料分為兩類：一是液態(tài)發(fā)酵飼料，是將谷物原料、維生素、礦物質(zhì)等和水按比例混合發(fā)酵，加入酸化劑使pH 降至3.5 左右，防止霉菌等有害菌生長(zhǎng)；二是固態(tài)發(fā)酵飼料，是將營(yíng)養(yǎng)豐富的全價(jià)飼料或谷物原料部分、乳酸菌和水按比例混合發(fā)酵[17]。固態(tài)發(fā)酵飼料優(yōu)點(diǎn)是飼料中含有多種有益菌，能提高飼料利用率[18]。本研究所篩選乳酸菌具有較好的產(chǎn)酸性能和發(fā)酵性能，通過(guò)固體發(fā)酵的方式，降低飼料pH，提高飼料的粗蛋白含量，能夠較好減少飼料中有害菌的生長(zhǎng)，為魚(yú)體提供更多營(yíng)養(yǎng)。Jiang 等[19]利用枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌混合發(fā)酵玉米蛋白粉，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后中性洗滌纖維含量顯著降低，粗蛋白、氨基酸和小肽含量顯著升高。Wang 等[20]使用由地衣芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌組合成的復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕，發(fā)酵后可溶性蛋白含量、乳酸含量和總氨基酸含量顯著升高。上述研究結(jié)論均與本研究相似。

Silva 等[21]研究表明飼料的風(fēng)味能夠影響動(dòng)物對(duì)飼料的選擇和進(jìn)食，從而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，類似地，Kondo 等[22]研究了飼料適口性對(duì)動(dòng)物采食行為的影響，發(fā)現(xiàn)飼料的適口性是影響動(dòng)物的采食量的主要因素之一。在發(fā)酵的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一系列芳香族化合物，從而改善飼料風(fēng)味，提高適口性[23]。吳正可等[24]使用嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕，發(fā)酵后的菜籽粕呈蓬松狀，顏色為黃褐色，有濃郁的酸香味。Liu 等[25]用乳酸菌發(fā)酵液吸附和發(fā)酵稻草飼料，發(fā)酵后的稻草飼料不僅具有獨(dú)特的酸香味，適口性也得到了改善。本研究中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵的魚(yú)飼料顏色為紅褐色，質(zhì)地松散而不粘連，有淡淡的酸酒香味，與原飼料相比，風(fēng)味更佳。

4 結(jié)論

本研究從大彈涂魚(yú)腸道分離篩選出22 株乳酸菌，通過(guò)對(duì)產(chǎn)酸能力、抑菌能力、耐膽鹽能力、耐酸能力、發(fā)酵飼料性能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，得到一株發(fā)酵性能較好的乳酸菌菌株Bp1。通過(guò)16S rRNA鑒定，確定該菌為發(fā)酵粘液乳桿菌，目前在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用較少，具有較好的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力。通過(guò)正交試驗(yàn)，確定了發(fā)酵大彈涂魚(yú)飼料的最佳工藝，菌種接種量為2.0%，發(fā)酵溫度為37 ℃、含水量為60%、發(fā)酵天數(shù)為3 d，在最優(yōu)工藝條件下，得到發(fā)酵飼料粗蛋白含量為（37.04±0.32）%，飼料pH 為5.6；與基礎(chǔ)飼料相比，該發(fā)酵飼料具有更高的粗蛋白含量，可為魚(yú)體提供更好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，pH 更低，能夠抑制大部分有害病原菌，更有利于大彈涂魚(yú)的綠色養(yǎng)殖。