利用一碳資源生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白在飼料中的應(yīng)用研究進(jìn)展

■ 賀 姣 辛嘉英，* 張衛(wèi)丹 徐景懿 夏春谷

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150076；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州物理化學(xué)研究所羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000）

近年來(lái)，受到人口快速增長(zhǎng)的影響，預(yù)計(jì)到2056年，人口將達(dá)到100 億，全球糧食需求將增長(zhǎng)50%～80%，其中人們對(duì)蛋白質(zhì)的需求量逐漸增加，而海產(chǎn)品是人們獲取蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)飼料中蛋白質(zhì)含量要求較高，從而導(dǎo)致蛋白飼料資源短缺[1]。目前動(dòng)物飼料中蛋白質(zhì)來(lái)源主要是魚(yú)粉和豆粕，雖然魚(yú)粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且易消化吸收，但生產(chǎn)成本高，長(zhǎng)期廣泛使用將導(dǎo)致蛋白飼料供應(yīng)不足[2]。與此同時(shí)，在過(guò)去20 年中，全球大氣中CO2和CH4的總濃度分別增加了12.07%和5.90%，因此，需要開(kāi)發(fā)新型的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法，既可以保障蛋白質(zhì)安全供應(yīng)又可以為溫室氣體減排做出貢獻(xiàn)[3]。

CH4和其他一碳化合物[CO2、CO、甲醇（CH3OH）和甲酸鹽]被認(rèn)為是不影響糧食安全的下一代微生物碳原料的可持續(xù)候選者[4]，可以作為藻類(lèi)、酵母、真菌和細(xì)菌等微生物生長(zhǎng)過(guò)程中利用的底物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白（Single cell protein，SCP）。SCP 不僅蛋白質(zhì)含量高，而且含有糖類(lèi)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)以及重要氨基酸，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]。由一碳化合物生物合成的SCP 與傳統(tǒng)的飼料原料(如豆粕)相比，具有顯著的碳中和效益，能高質(zhì)量的替代蛋白質(zhì)，且土地使用和水消耗少。由于其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)，高消化率和氨基酸平衡性好而被主要應(yīng)用于動(dòng)物飼料，特別是在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用居多，因?yàn)槠錉I(yíng)養(yǎng)成分和魚(yú)粉相似，在未來(lái)可以成為魚(yú)粉的替代品。但受成本經(jīng)濟(jì)的限制，目前還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，通過(guò)利用合成生物學(xué)和基因工程手段改良微生物性狀，進(jìn)一步強(qiáng)化底物利用效率，有助于實(shí)現(xiàn)SCP 工業(yè)化生產(chǎn)。乙醇梭菌蛋白（Clostridium autoethanogenum protein,CAP）實(shí)現(xiàn)首次大規(guī)模生產(chǎn)并被我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)成為新型飼料蛋白源，并在水產(chǎn)飼料中投入使用[3]。

文章介紹了某些微生物利用一碳資源發(fā)酵生產(chǎn)SCP 的研究進(jìn)展，包括一碳資源的生物代謝途徑、各種菌體SCP 的生產(chǎn)及在飼料中的應(yīng)用，最后分析SCP商業(yè)化生產(chǎn)面臨的挑戰(zhàn)及未來(lái)可能解決的途徑，進(jìn)一步為提升SCP的應(yīng)用價(jià)值提供支持。

1 一碳?xì)怏w及微生物利用原理

1.1 一碳資源

隨著世界人口的持續(xù)增加，同時(shí)人們對(duì)食物消費(fèi)模式的改變，對(duì)高質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)豐富的食品的需求不斷增長(zhǎng)，尤其對(duì)蛋白質(zhì)的需求正在增加，然而，依靠動(dòng)物和乳制品生產(chǎn)來(lái)滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的蛋白質(zhì)需求最終是不可持續(xù)的[5-6]。雖然近年來(lái)畜牧業(yè)不斷擴(kuò)大生產(chǎn)來(lái)滿(mǎn)足人們對(duì)肉類(lèi)蛋白的需求，但在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)排放溫室氣體，給當(dāng)下“雙碳”任務(wù)帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。而植物蛋白生產(chǎn)不僅效率低下，而且會(huì)產(chǎn)生大量廢物，消耗土地和水資源，而且耗能高[7-8]。因此，現(xiàn)在越來(lái)越多的方法和技術(shù)在不斷被挖掘，特別是一碳資源的利用受到越來(lái)越多人的關(guān)注。一碳資源主要包括CH3OH、CH4、CO2和CO 等。CH3OH 是一種關(guān)鍵的溶劑和生物燃料產(chǎn)品，通過(guò)CH4的氧化和CO2的還原進(jìn)行生物生產(chǎn)，因其具有易儲(chǔ)存和易運(yùn)輸?shù)忍匦?，成為極具應(yīng)用潛力的原料，目前全球90%以上的CH3OH 來(lái)源于天然氣制備[9]。熱力學(xué)上，CH4可以在室溫條件下自發(fā)地氧化形成CH3OH。CH4是一種無(wú)味、無(wú)色、可燃的氣體，來(lái)源廣泛，天然氣是CH4最主要的來(lái)源，傳統(tǒng)上主要用于供熱、發(fā)電或作為運(yùn)輸燃料，其溫室效應(yīng)是CO2的26 倍[10]。大氣中CO2濃度日益增高導(dǎo)致的全球氣候變暖，也急需尋求CO2控制、捕獲以及利用方式。相比于控制CO2排放與捕獲，CO2轉(zhuǎn)化與利用既能降低溫室效應(yīng)，又能緩解由于化石燃料枯竭導(dǎo)致的資源危機(jī)。這些氣體直接排放或燃燒不但會(huì)污染環(huán)境還會(huì)造成資源浪費(fèi)，因此，通過(guò)工業(yè)生物技術(shù)將這些氣體轉(zhuǎn)化為飼料蛋白質(zhì)和其他產(chǎn)品是首選的技術(shù)手段。

1.2 一碳資源的生物轉(zhuǎn)化途徑

近年來(lái)，利用微生物將CH4和CO2作為底物轉(zhuǎn)化為增值產(chǎn)品越來(lái)越吸引人們的注意力，如聚β-羥基丁酸酯（PHB）、SCP、細(xì)胞外多糖、脂質(zhì)等，其中SCP的生產(chǎn)在當(dāng)前蛋白緊缺和環(huán)境污染問(wèn)題中發(fā)揮重要作用[11]。

1.2.1 CH4的氧化和同化途徑

CH4是最簡(jiǎn)單的碳?xì)浠衔镏?，也是由各種自然和人為來(lái)源產(chǎn)生的溫室氣體[12]，對(duì)全球變暖有重大貢獻(xiàn)。開(kāi)發(fā)將CH4轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品的方法日益成為CH4資源利用的重要研究方向。甲烷氧化菌（Methane oxidizing bacteria,MOB）是甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的一個(gè)分支，是革蘭氏陰性細(xì)菌，以CH4或CH3OH作為唯一的碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)[13]。MOB是一種系統(tǒng)發(fā)育多樣的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌，根據(jù)DNA量、細(xì)胞膜組成和碳同化的代謝途徑，主要分為Ⅰ型和Ⅱ型，分別隸屬于γ-變形菌和α-變形菌[14-15]。MOB的一個(gè)典型特征是具有甲烷單加氧酶（Methane monooxygenase，MMO）[16]。MMO 啟動(dòng)CH4氧化過(guò)程，并以?xún)煞N主要形式存在。顆粒性甲烷單加氧酶（Particulate methane monooxygenase,pMMO）是一種銅依賴(lài)性酶，具有高CH4親和力，但周轉(zhuǎn)率較慢[17]，在MOB中幾乎無(wú)處不在?？扇苄约淄閱渭友趺福╯MMO）在其活性中心使用鐵，并且僅在一些MOB中發(fā)現(xiàn)。

在MMO 催化下MOB 將CH4氧化為CH3OH，在甲醇脫氫酶（Methanol dehydrogenase，MDH）的作用下以及周質(zhì)吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quineone，PQQ）作為輔因子進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲醛（HCHO），而HCHO 是一種有毒的中間體，在Ⅰ型MOB 中HCHO 進(jìn)入單磷酸核酮糖途徑（RuMP）進(jìn)行同化[18]；存在四氫葉酸（H4F）和四氫甲烷蝶呤（H4MPT）介導(dǎo)的HCHO 向甲酸（HCOOH）的 轉(zhuǎn) 化[19]。在H4F 介 導(dǎo) 的HCHO 生 成HCOOH 的途徑中，預(yù)計(jì)HCHO 會(huì)與H4F 自發(fā)縮合形成亞甲基H4F，然后亞甲基H4F 進(jìn)一步氧化為HCOOH。在H4MPT 介導(dǎo)的途徑中，HCHO 與蝶呤縮合，然后經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成HCOOH（見(jiàn)圖1）。Ⅱ型MOB 利用HCOOH 進(jìn)入絲氨酸循環(huán)。HCOOH 在甲酸脫氫酶（Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）的催化下氧化為CO2進(jìn)一步進(jìn)入卡爾文循環(huán)（CBB）。

圖1 甲烷的代謝途徑

1.2.2 CH3OH的代謝途徑

最近，CH3OH 作為替代煤炭和石油的替代碳源受到了廣泛關(guān)注。在工業(yè)上，CH3OH 是由“合成氣”（CO 和H2）或大氣中CO2與H2的還原轉(zhuǎn)化制備的。由于CH3OH 是一種廉價(jià)的非食品基質(zhì)，它已成為生物技術(shù)和化學(xué)工藝的一種很有前途的原料。在自然環(huán)境中，CH3OH 是通過(guò)MOB 對(duì)CH4的氧化以及分別含有甲酯和甲氧基的植物果膠和木質(zhì)素的分解產(chǎn)生的[20]。

CH3OH 在甲基營(yíng)養(yǎng)酵母中的代謝概述如圖2 所示。CH3OH 首先被醇氧化酶（Alkyl oxidase，AOD）氧化，形成HCHO 和過(guò)氧化氫，這兩種物質(zhì)都是劇毒化合物。HCHO 是一種中心中間體，位于同化和異化途徑之間的分支點(diǎn)[21]。一部分HCHO 通過(guò)二羥基丙酮合酶（Dihydroxyacetone synthase，DAS）固定在5-磷酸木酮糖（Xu5P）上，形成二羥基丙酮（Dihydroxyacetone,DHA）和3-磷酸甘油醛（3-Phosphoglyceraldehyde,G3P），用于合成細(xì)胞成分和再生Xu5P。AOD 和DAS與分解過(guò)氧化氫的過(guò)氧化氫酶（Catalase，CTA）一起位于過(guò)氧化物酶體中。DHA 和G3P 在胞質(zhì)溶膠中被進(jìn)一步同化。DHA 被二羥基丙酮激酶（Dihydroxyacetone kinase，DHAK）磷酸化，隨后，磷酸二羥基丙酮（Dihydroxyacetone phosphate，DHAP）和G3P形成1，6-二磷酸果糖（1,6-Bisphosphate fructose，F(xiàn)BP），然后用于Xu5P 的再生和細(xì)胞成分的生物合成。另一部分HCHO通過(guò)胞質(zhì)異化途徑進(jìn)一步氧化為CO2。

圖2 甲醇的生物轉(zhuǎn)化途徑

1.2.3 HCHO、HCOOH的代謝途徑

HCHO 通過(guò)不同的途徑被吸收到細(xì)胞生物量中。Ⅰ型甲烷營(yíng)養(yǎng)菌是γ-變形菌，它們通過(guò)RuMP 和部分絲氨酸循環(huán)吸收HCHO（圖3a）。RuMP 有三個(gè)部分：融合、切割和重排。在聚合步驟中，HCHO 通過(guò)磷酸己糖合成酶（Hexose phosphate synthetase, HPS）與5-磷酸核酮糖（Ribulose 5-phosphate, R5P）縮合為6-磷酸己酮糖（6-Phosphohexanone, H6P）。所得產(chǎn)物隨后通過(guò)磷酸己糖異構(gòu)酶（Hexose phosphoisomerase, PHI）轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖（Fructose 6-phosphate, F6P）[22]。F6P 轉(zhuǎn)化為FBP，F(xiàn)BP 裂解為DHAP，然后通過(guò)果糖二磷酸醛縮酶轉(zhuǎn)化為G3P。RuMP 循環(huán)最后一步是R5P通過(guò)幾個(gè)可能的系列反應(yīng)再生以閉合循環(huán)[23]。

圖3 基于甲醛參與的代謝途徑

Ⅱ型甲烷營(yíng)養(yǎng)菌是α-變形菌，它們可以通過(guò)乙醛酸分流偶聯(lián)的絲氨酸循環(huán)吸收HCHO（圖3b）。HCOOH 經(jīng)多步催化反應(yīng)生成活性中間體5，10-亞甲基四氫葉酸（5,10-methylene-THF）在第一步通過(guò)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（Serine hydroxymethyltransferase,SHMT）與甘氨酸縮合形成絲氨酸，甘氨酸在隨后的絲氨酸循環(huán)中再生。絲氨酸通過(guò)絲氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Serine-glyoxylate aminotransferase, SGAT）與乙醛酸的轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)化為羥基丙酮酸[24]。羥基丙酮酸通過(guò)羥基丙酮酸還原酶還原為甘油酸，然后通過(guò)甘油酸2-激酶轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酸。2-磷酸甘油酸通過(guò)烯醇化酶轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate, PEP），磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化草酰乙酸的合成。將草酰乙酸轉(zhuǎn)化為蘋(píng)果酸，隨后通過(guò)蘋(píng)果酸脫氫酶和蘋(píng)果酸激酶分別用于形成蘋(píng)果酰輔酶A，蘋(píng)果酰輔酶A 裂解酶將蘋(píng)果酰輔酶A 裂解為乙酰輔酶A 和乙醛酸[19]。在最后一步中，甘氨酸通過(guò)SGAT從乙醛酸中再生，甘氨酸在絲氨酸循環(huán)中是與5,10-methylene-THF縮合的主要受體。

多種原核生物和真核生物可以利用一碳化合物進(jìn)行生長(zhǎng)，原核生物甲基營(yíng)養(yǎng)體可以利用多種一碳化合物，而真核生物甲基營(yíng)養(yǎng)體只能使用CH3OH 作為碳源[20]。天然甲酸鹽同化途徑開(kāi)始于將甲酸鹽與四氫葉酸（Tetrahydrofolate,THF）縮合以產(chǎn)生10-甲?；臍淙~酸（10-Formy-THF），然后還原為5,10-methylene-THF[25]。在之前的研究中，我們提出了幾種合成途徑，可以將5,10-methylene-THF 轉(zhuǎn)化為中心代謝中間體，從而在模式微生物中維持甲酸鹽的生長(zhǎng)[25-27]。其中兩種有前景的途徑是還原甘氨酸途徑和絲氨酸-蘇氨酸循環(huán)（圖4）。還原性甘氨酸途徑是短的、線性的，與中樞代謝的重疊有限。在該途徑中，可逆的甘氨酸切割系統(tǒng)將5,10-methylene-THF 與CO2和NH3縮合以產(chǎn)生甘氨酸，甘氨酸與另外的5,10-methylene-THF 進(jìn)一步縮合以產(chǎn)生絲氨酸。絲氨酸被脫氨基為丙酮酸鹽，丙酮酸鹽可以維持生物量的生產(chǎn)。另一方面，絲氨酸-蘇氨酸循環(huán)較長(zhǎng)，呈環(huán)狀，與內(nèi)源性代謝顯著重疊。在這個(gè)循環(huán)中，甘氨酸與5,10-methylene-THF 縮合產(chǎn)生絲氨酸，絲氨酸脫氨基為丙酮酸鹽，然后羧化為草酰乙酸鹽，并進(jìn)一步代謝為蘇氨酸。蘇氨酸被切割以再生甘氨酸，同時(shí)產(chǎn)生乙酰輔酶A作為生物質(zhì)前體[28]。

圖4 基于甲酸參與的代謝途徑

1.2.4 CO2的固定途徑

大氣中的CO2濃度在過(guò)去50年中急劇增加，大自然進(jìn)化出了多種復(fù)雜的二氧化碳固定途徑[29]。到目前為止，CO2可以通過(guò)三種途徑固定為有機(jī)碳：自養(yǎng)、異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)代謝。自養(yǎng)代謝可以進(jìn)一步細(xì)分為兩種途徑：光自養(yǎng)和化學(xué)自養(yǎng)。光自養(yǎng)代謝利用光作為能源，通過(guò)光合作用將無(wú)機(jī)CO2轉(zhuǎn)化為碳水化合物。在光合作用的第一階段，能量?jī)?chǔ)存和運(yùn)輸分子ATP 和NADPH 是通過(guò)光依賴(lài)反應(yīng)形成的，然后使用ATP 和NADPH 通過(guò)不依賴(lài)光的反應(yīng)將CO2固定到葡萄糖中。這是由核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribitulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RuBisCO）催化的，作為CBB 循環(huán)的一部分（見(jiàn)圖5）。CBB 循環(huán)（又稱(chēng)還原性磷酸戊糖循環(huán)）由不可逆的RuBisCO 催化反應(yīng)組成，其中一分子1，5 二磷酸核酮糖（1,5 Ribose bisphosphate，RuBP）、CO2和水產(chǎn)生兩分子3-磷酸甘油酸（3-Phosphoglycerate，PGA）。RuBisCO利用了光合作用產(chǎn)生的能量通過(guò)光呼吸催化RuBP的競(jìng)爭(zhēng)性氧化[30]。

圖5 還原性磷酸戊糖循環(huán)途徑

1.2.5 CO的同化途徑

CO 是大氣中除CO2外含量最高的空氣污染物，大量的CO 來(lái)源于自然和人類(lèi)活動(dòng)中的排放，由于工業(yè)廢氣和合成氣被認(rèn)為是最廉價(jià)和最靈活的CO 來(lái)源之一，多年來(lái)，使用這些氣體生產(chǎn)化學(xué)品和生物燃料的生物CO 轉(zhuǎn)化已被廣泛研究。乙醇梭菌通過(guò)Wood-Ljungdahl 途徑利用煉鋼廢氣中的CO 為碳源，氨為氮源，經(jīng)發(fā)酵將CO 轉(zhuǎn)化為乙醇的過(guò)程中會(huì)同時(shí)產(chǎn)生G3P[31]。

2 微生物利用一碳資源生產(chǎn)SCP

2.1 MOB利用CH4生產(chǎn)SCP

MOB 是以甲烷或甲醇作為唯一的碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，MOB 可以使用包括廢氣在內(nèi)的多種原料生產(chǎn)SCP。經(jīng)研究表明，連續(xù)培養(yǎng)是目前高產(chǎn)SCP 的培養(yǎng)方式，在生產(chǎn)過(guò)程中需要考慮溫度、pH 以及培養(yǎng)基的組成，此外，抗微生物化合物的存在也應(yīng)該考慮，因?yàn)樗鼈兛梢砸种扑鼈兊纳L(zhǎng)，從而抑制蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。如果基質(zhì)中含有大量具有類(lèi)似抗菌效果的化合物，則在使用前有必要進(jìn)行預(yù)處理。據(jù)報(bào)道，高壓滅菌是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的一種簡(jiǎn)單方法，但根據(jù)具體化合物的不同而有所不同[32]。MOB培養(yǎng)液經(jīng)離心、干燥和成型等單元操作后得到產(chǎn)品（如圖6 所示）。值得注意的是一旦微生物達(dá)到足夠的生物量，就必須分離SCP。這些分離過(guò)程包括各種提取和純化步驟，這些步驟可能會(huì)增加時(shí)間、能源使用和生產(chǎn)成本，并可能降低可持續(xù)性。一旦SCP 被分離出來(lái)，就可以將其轉(zhuǎn)化為成分，這一步驟的復(fù)雜性和成本取決于所需的純度或應(yīng)用。為了從生物質(zhì)中獲得蛋白質(zhì)，有必要濃縮生產(chǎn)生物，并通過(guò)脫水干燥去除其中含有蛋白質(zhì)的水性介質(zhì)。蛋白質(zhì)分離也可以根據(jù)其分散性、密度或大小進(jìn)行。這些工藝是必要的，但可能成本高昂，從而增加了所獲得產(chǎn)品的最終成本[33]。

圖6 甲烷氧化菌SCP生產(chǎn)工藝流程

2.2 甲醇酵母SCP的生產(chǎn)

20 世紀(jì)70 年代初，人們對(duì)使用CH3OH 作為碳源生產(chǎn)SCP 進(jìn)行了深入研究，建立了一種高細(xì)胞密度培養(yǎng)方法。甲醇酵母是重要的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母，將CH3OH作為碳源進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)一個(gè)周期以后經(jīng)離心、脫水干燥即可得到SCP[4]。酵母SCP 與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)來(lái)源如植物或動(dòng)物獲得的蛋白質(zhì)相比較具有更高含量的蛋白質(zhì)，甲醇酵母的蛋白質(zhì)質(zhì)量通常與肉類(lèi)和大豆的蛋白質(zhì)相似或更高，并且高于牛奶蛋白質(zhì)。甲醇酵母蛋白生物量具有良好的氨基酸平衡和豐富的B 族維生素，比植物性飼料更適合飼養(yǎng)家禽。經(jīng)濟(jì)分析表明從CH3OH 大規(guī)模生產(chǎn)SCP 在經(jīng)濟(jì)上不可行,去除核酸等工序增加了生產(chǎn)成本[34]。

2.3 微藻利用CO2生產(chǎn)SCP

藻類(lèi)是一大類(lèi)具有較強(qiáng)生存能力的物種。它可以生活在各種棲息地，包括極端沙漠、凍土和火山水，藻類(lèi)根據(jù)大小可分為大型藻類(lèi)和微型藻類(lèi)。微藻是自然界中光合效率最高的一類(lèi)生物。其光合效率可以達(dá)到10%～20%，遠(yuǎn)高于大多數(shù)陸地植物[35]。利用微藻生產(chǎn)SCP 一般是微藻培養(yǎng)液進(jìn)行離心收集細(xì)胞，將收集到的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞破碎得到細(xì)胞裂解物，之后進(jìn)行脫水干燥即可得到微藻SCP[4]。微藻蛋白質(zhì)含量和氨基酸圖譜在很大程度上取決于物種和生產(chǎn)條件。

據(jù)報(bào)道，微藻生物量的粗蛋白含量在30%～80%之間變化。當(dāng)談到營(yíng)養(yǎng)價(jià)值時(shí)，微藻的氨基酸圖譜與世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織定義的一種平衡良好的蛋白質(zhì)的參考圖譜相匹配[36]。盡管微藻生物量具有高蛋白質(zhì)含量和良好的氨基酸組成，但作為SCP 的直接使用受到其消化率的限制。具有堅(jiān)硬的纖維素細(xì)胞壁的消化能力相對(duì)較差，因此，需要尋找有效的生物質(zhì)預(yù)處理步驟，為微藻生物質(zhì)作為食品和飼料蛋白質(zhì)來(lái)源的應(yīng)用鋪平道路。 與此同時(shí)，微藻的風(fēng)味通常被描述為魚(yú)腥味，微藻引起的強(qiáng)烈的顏色和風(fēng)味是限制微藻生物質(zhì)在食品領(lǐng)域應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)之一。噴霧干燥微膠囊化是一種新興的掩蓋微藻不良風(fēng)味的方法[37]。從經(jīng)濟(jì)方面來(lái)考慮會(huì)增加生產(chǎn)成本，大規(guī)模應(yīng)用目前受到成本的限制。

2.4 CAP的生產(chǎn)

乙醇梭菌最早是在1994 年比利時(shí)科學(xué)家從兔子腸道里分離出來(lái)，可以利用CO 產(chǎn)生乙醇的厭氧菌。起初人們都只關(guān)注氣體生物發(fā)酵合成乙醇，而忽視了乙醇分離蒸餾過(guò)程中還有一種“麻煩的黏稠的物質(zhì)”，經(jīng)飼料所檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這種黏稠物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)[38]。CAP 是以工業(yè)尾氣中的CO 為碳源，氨為氮源，經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)的一種新型微生物蛋白。在含氨水的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，蒸餾去除乙醇得到乙醇梭菌發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH 和溫度進(jìn)行離心得到菌體蛋白，進(jìn)一步進(jìn)行脫水干燥得到CAP[4]。飼料所研究團(tuán)隊(duì)為了進(jìn)一步了解這種蛋白的功能特性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、加工適宜性等做了系統(tǒng)研究[39]。研究發(fā)現(xiàn)CAP 的蛋白質(zhì)含量高達(dá)85%，含有大量必需氨基酸和維生素，18 種氨基酸占蛋白質(zhì)比例達(dá)到94%，為單純蛋白質(zhì)，與FM 的氨基酸結(jié)構(gòu)相似。中國(guó)農(nóng)科院飼料所與北京首朗生物技術(shù)有限公司經(jīng)多年聯(lián)合攻關(guān)[40]，提高了反應(yīng)速度（22 s 合成），實(shí)現(xiàn)了萬(wàn)噸級(jí)的生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了飼料原料新產(chǎn)品從中試向大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化之路，飼料所也在“不經(jīng)意間”推動(dòng)了CAP 從未知菌體到飼料產(chǎn)業(yè)的廣泛應(yīng)用。此外，CAP 的生產(chǎn)將減少工業(yè)廢氣的排放和空氣污染[31]。

3 應(yīng)用

SCP 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，易消化吸收，所含氨基酸種類(lèi)繁多[41]。氨基酸譜是評(píng)估SCP 營(yíng)養(yǎng)的重要性指標(biāo)。特別是必需氨基酸組成，必需氨基酸是在人類(lèi)和動(dòng)物體內(nèi)不能產(chǎn)生，需從食物中獲得。包括蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸，每一種氨基酸在生長(zhǎng)、受損組織的修復(fù)和免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)行中都起著重要作用。近年來(lái)，提高動(dòng)物飼料中賴(lài)氨酸的比例已經(jīng)成為許多研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)，在動(dòng)物飼料中充分添加賴(lài)氨酸可以改善血液凝集，增強(qiáng)免疫力[42]。多種研究表明，來(lái)源于幾種微生物的SCP 由必需氨基酸和非必需氨基酸組成[43]，見(jiàn)表1。

表1 利用一碳資源產(chǎn)SCP產(chǎn)品與FM氨基酸的比較[10](%)

3.1 甲烷氧化菌SCP在飼料中的應(yīng)用

甲烷氧化菌SCP 具有較高的蛋白質(zhì)完整性，并且具有顯著的微量營(yíng)養(yǎng)特征，含有大量的B 族維生素、礦物質(zhì)和必需脂肪酸[44]。它的氨基酸圖譜與FM 相似，并且不存在抗?fàn)I養(yǎng)因子，甲烷氧化菌SCP比FM 具有更高的色氨酸含量和更低的賴(lài)氨酸含量，并且與大豆粉相比，它的氨基酸含量更高，含有更多的色氨酸和蛋氨酸。這意味著它們被視為水產(chǎn)飼料中可持續(xù)蛋白質(zhì)的最高潛在候選者之一[45]。Ruiz 等[46]對(duì)虹鱒幼魚(yú)進(jìn)行了一項(xiàng)全面研究，通過(guò)利用MOB獲得的SCP飼喂虹鱒幼魚(yú)，觀察其健康狀況、腸道微生物群的組成和多樣性以及在細(xì)菌病原體面前的抗病性等相關(guān)的幾個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)估最佳FM 替代水平。研究結(jié)果表明，11.25%甲烷氧化菌SCP 可以取代高達(dá)75%的FM而不會(huì)影響生長(zhǎng)和飼料效率。Zheng 等[47]對(duì)大菱鲆幼魚(yú)生長(zhǎng)、機(jī)體成分、抗氧化能力、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和蛋白質(zhì)代謝進(jìn)行研究。利用MOB 生產(chǎn)的SCP 代替FM對(duì)大菱鲆幼魚(yú)飼喂0（對(duì)照）、15%、30%，45%、60%、80%和100%。結(jié)果表明，不同飼糧處理的魚(yú)的存活率無(wú)顯著差異。此外，甲烷氧化菌SCP 替代FM 蛋白的0、15%和30%飼糧組的特定生長(zhǎng)率、飼料效率比和肉產(chǎn)量也無(wú)顯著差異。這與之前Biswas 等[48]對(duì)大西洋鮭魚(yú)和日本黃尾魚(yú)的研究一致，其中36%和30%的飼料FM 蛋白可以被甲烷氧化菌SCP 取代，而不會(huì)對(duì)生長(zhǎng)性能產(chǎn)生負(fù)面影響。

3.2 甲醇酵母SCP在飼料中的應(yīng)用

豆粕雖然具有平衡的營(yíng)養(yǎng)成分、高消化率，但由于其存在抗?fàn)I養(yǎng)因子而限制了在蝦和魚(yú)飼料中的應(yīng)用[49]。用酵母代替豆粕可以進(jìn)行更好的比較，因?yàn)榕c代替FM 時(shí)相比，飲食的營(yíng)養(yǎng)成分變化較少,與豆粕相比不具有其中的抗?fàn)I養(yǎng)素。利用甲醇酵母生產(chǎn)的SCP 具有良好的營(yíng)養(yǎng)特性，蛋白質(zhì)水平高，供應(yīng)穩(wěn)定，價(jià)格合理而成為新的替代飼料成分。在飼料中添加甲醇酵母SCP 已被證明可以提高水生動(dòng)物的生長(zhǎng)性能并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和代謝[50]。大量研究表明，酵母可作為多種水生動(dòng)物飼糧中的合理蛋白質(zhì)來(lái)源，包括太平洋白蝦、凡納濱對(duì)蝦、澳大利亞紅爪小龍蝦、幼年海鱸魚(yú)和加拿大鱈魚(yú)等[51]。

Guo等[52]研究評(píng)估甲醇酵母SCP在太平洋白蝦的實(shí)際飼糧中作為FM 或豆粕替代品的利用率，使用分級(jí)水平（0、60、120、180 g/kg 和240 g/kg）的甲醇酵母SCP 代替FM 和豆粕，結(jié)果表明，在最終生物量、存活率、蛋白質(zhì)保留率和飼料轉(zhuǎn)化率方面沒(méi)有顯著差異；然而，在FM 替換系列中顯示了最終體重和體重增加的有限差異。宋志峰等[53]發(fā)現(xiàn)用甲醇酵母SCP 替代豆粕等傳統(tǒng)蛋白飼喂仔豬可以改善其生長(zhǎng)性能、飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)仔豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、改善其腸道菌群健康等。H?ken?sen 等[54]研究了在斷奶后的前兩周，飼喂甲醇酵母SCP 對(duì)仔豬胃腸功能發(fā)育和健康的影響。斷奶誘導(dǎo)對(duì)照組仔豬的幾種免疫功能下調(diào)，而在甲醇酵母SCP 飼喂的仔豬中則不那么明顯。結(jié)果表明，飼喂甲醇酵母SCP 可以改善斷奶腸道穩(wěn)態(tài)，使仔豬更健壯。

3.3 微藻SCP在飼料中的應(yīng)用

利用微藻生產(chǎn)的SCP 蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類(lèi)差異小，可以替代FM 成為水產(chǎn)飼料中優(yōu)質(zhì)蛋白來(lái)源[55]。曹威榮[56]研究在飼料中添加微藻對(duì)尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能及體成分的影響，在基礎(chǔ)飼料中分別添加不同微藻蛋白，添加 7.5%和15%螺旋藻蛋白、7.5%和15%柵藻蛋白以及不添加任何微藻蛋白作為對(duì)照，結(jié)果表明，飼料中添加15%螺旋藻蛋白，尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)的增重率和特定生長(zhǎng)率最高，且顯著高于對(duì)照，魚(yú)體粗蛋白質(zhì)含量增加。飼料中添加?xùn)旁?，尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)的增重率和特定生長(zhǎng)率均沒(méi)有顯著變化。全峰等[57]研究飼料中添加復(fù)合微藻蛋白對(duì)半滑舌鰨生長(zhǎng)、體色及消化酶的影響。結(jié)果表明與對(duì)照組相比幼魚(yú)的增重率、特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率顯著提高。Mirzaie 等[58]研究確定螺旋藻蛋白在高溫肉雞中的潛在應(yīng)用，試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)在肉雞飼糧中補(bǔ)充螺旋藻蛋白，可以在生化水平上減輕環(huán)境溫度高造成的不利影響，包括酶抗氧化系統(tǒng)受損、應(yīng)激激素和脂質(zhì)水平升高。Carvalho 等[59]通過(guò)給公牛飼喂富含二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）微藻SCP，觀察其性能、胰島素敏感性及肉質(zhì)的影響。結(jié)果表明微藻SCP的添加可以提高DHA的含量，不會(huì)改變公牛的生長(zhǎng)或胴體特性，增加了牛肉中的n-3 脂肪酸和n-3∶n-6比例。

3.4 CAP在飼料中的應(yīng)用

CAP 的生產(chǎn)是環(huán)保和可再生的。CAP 含有高含量的粗蛋白和大量的脂質(zhì)、碳水化合物和維生素[60]。作為一種細(xì)菌蛋白，CAP 與植物蛋白相比含有更少的抗?fàn)I養(yǎng)因子，并且其生物胺含量低于動(dòng)物蛋白[61]。已經(jīng)研究了膳食CAP 在一些魚(yú)類(lèi)和蝦物種中的應(yīng)用[62]。Wu 等[63]研究用CAP 替代飼糧FM 對(duì)盤(pán)鮑的影響。分別為0、25%、50%、75%和100%的5 種含CAP 飼糧飼喂鮑魚(yú)110 d。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CAP 完全替代飼糧FM 對(duì)鮑魚(yú)生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，并且研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加25% CAP 飼糧飼喂鮑魚(yú)時(shí)其粗蛋白含量、硬度、羥脯氨酸含量、pH 等顯著升高，有利于鮑魚(yú)的生長(zhǎng)。Yang 等[31]研究探討了用CAP 代替FM 對(duì)大嘴鱸魚(yú)生長(zhǎng)、飼料利用和腸道組織學(xué)的影響。分別添加50、100、150、200 g/kg 和250 g/kg CAP 代替FM，對(duì)照組添加350 g/kg FM，分別飼喂大口鱸魚(yú)8 周，結(jié)果表明用150 g/kg CAP 替代FM 對(duì)大嘴鱸魚(yú)的生長(zhǎng)、飼料利用和腸道組織無(wú)不良影響。Chen 等[64]用平均初始體重（6.03±0.09） g 的黑鯛進(jìn)行了為期70 d 的飼養(yǎng)試驗(yàn)，以評(píng)估飼糧中用CAP 部分替代FM 的效果。采用CAP 分 級(jí) 水 平0、4.85%、9.70%、14.55%、19.40%、38.80%和58.20%替代FM，與其他飼料的魚(yú)相比，飼喂CAP 58.20%飼料的魚(yú)表現(xiàn)出顯著較低的喂養(yǎng)率，顯著提高的蛋白質(zhì)效率比和飼料效率比。由此可得CAP 是一種安全有效的替代蛋白質(zhì)來(lái)源，在黑鯛飼糧中可替代FM 達(dá)58.20%，對(duì)生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和消化酶活性無(wú)不良影響。

4 商業(yè)化生產(chǎn)SCP的局限性及解決途徑

在19 世紀(jì)70 年代，SCP 的生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并短暫地出現(xiàn)在市場(chǎng)中，但由于生產(chǎn)成本高，感官偏見(jiàn)、監(jiān)管挑戰(zhàn)、食品技術(shù)的不發(fā)達(dá)和安全問(wèn)題沒(méi)有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[65]。目前，美國(guó)KnipBio 公司利用甲醇作為原料生產(chǎn)的SCP 商業(yè)化產(chǎn)品KnipBio Meal 應(yīng)用于水產(chǎn)飼料中。丹麥Unibio 公司利用甲烷作為原料生產(chǎn)的SCP 商業(yè)化產(chǎn)品Uniprotein?應(yīng)用于仔豬飼料、馬鈴薯粉、魚(yú)粉蛋白等[66]。此外，SCP 的下游加工可能是資本密集型的，涉及細(xì)胞生物量濃縮、提取和可能的蛋白質(zhì)純化的一系列過(guò)程需要大量資源。例如，來(lái)自細(xì)菌來(lái)源的蛋白質(zhì)需要純化以去除細(xì)胞生物量中的核酸含量，因?yàn)檫@可能會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生嚴(yán)重不利影響。同時(shí)，藻類(lèi)和真菌衍生的SCP 需要進(jìn)行一些下游加工，以提高蛋白質(zhì)的生物利用率。這些生物體的細(xì)胞壁很厚，動(dòng)物無(wú)法消化，因此需要去除細(xì)胞壁以提高蛋白質(zhì)效率。在某些情況下，獲得純化底物和原料生物使用的特定底物的升級(jí)、增值成本也可能相對(duì)較高，尤其是對(duì)于化學(xué)異養(yǎng)生物，因此限制了大量SCP生產(chǎn)的商業(yè)化[67]。據(jù)了解，目前可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的項(xiàng)目是首席科學(xué)家、中國(guó)農(nóng)科院飼料所研究員薛敏研究的在人工的條件下，以CO 和氮源大規(guī)模生物合成的CAP[68]。最近的研究發(fā)展，如快速基因組測(cè)序、多組學(xué)數(shù)據(jù)生成和分析、計(jì)算機(jī)建模、吞吐量的提高和生物基礎(chǔ)的自動(dòng)化[69]，將加快通過(guò)基因修飾提高SCP 產(chǎn)量。同時(shí)當(dāng)將原料轉(zhuǎn)化為中間原料時(shí)，可以應(yīng)用微生物工程，這些原料可以用作生產(chǎn)SCP 的微生物的碳源。在這一領(lǐng)域，合成生物學(xué)工具已經(jīng)被使用或顯示出巨大的潛力。中間原料可能以具有成本效益和可持續(xù)的方式生產(chǎn)，而這些中間原料又可以被相應(yīng)的SCP 微生物用作低成本的碳源，用于積累生物質(zhì)，并生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)和功能化合物[70]。

5 展望

近年來(lái)，CO、CO2、CH4、CH3OH等一碳?xì)怏w排放量日益增加，從而造成溫室效應(yīng)日益嚴(yán)重。目前甲醇酵母、化能自養(yǎng)菌和光合自養(yǎng)菌等微生物利用CO、CO2和CH4等一碳資源生物合成的SCP 生產(chǎn)效率更高，可持續(xù)，不需要使用任何耕地和農(nóng)藥，同時(shí)去除工業(yè)廢氣和廢料，減輕飼料資源短缺的壓力。SCP 具有高蛋白質(zhì)含量、高消化率、氨基酸組成平衡、低碳排放以及至少在一定水平下支持最佳生長(zhǎng)性能和健康的特點(diǎn)，有望成為水產(chǎn)飼料中有前途的FM 替代品。因此，在糧食短缺和碳減排的雙重需求下，開(kāi)發(fā)利用一碳資源生產(chǎn)SCP 是一項(xiàng)很有前途的技術(shù)，可以提供營(yíng)養(yǎng)豐富且可持續(xù)的蛋白質(zhì)資源，以滿(mǎn)足未來(lái)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的擴(kuò)張。雖然實(shí)現(xiàn)商業(yè)規(guī)?；a(chǎn)仍具有挑戰(zhàn)性，但未來(lái)可以通過(guò)微生物工程、基因修飾等途徑提高SCP 的產(chǎn)量，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)利用一碳資源大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。