Sirt1對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞外泌體釋放的影響

丁琳　周燕　劉珊珊　劉南池　馬瑞霞

［摘要］目的探討煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)的去乙酰化酶1（Sirt1）對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞外泌體釋放的影響。方法將永生化小鼠足細(xì)胞MPC5分為正常糖組（5.5 mmol/L葡萄糖，A組）、高滲組（5.5 mmol/L葡萄糖＋24.5 mmol/L甘露醇，B組）、高糖組（30.0 mmol/L葡萄糖，C組）、高糖＋Sirt1過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染組（Sirt1過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染＋30.0 mmol/L葡萄糖，D組）、高糖＋陰性慢病毒轉(zhuǎn)染組（陰性慢病毒轉(zhuǎn)染＋30.0 mmol/L葡萄糖，E組）、高糖＋外泌體分泌抑制劑組（GW4869＋30.0 mmol/L葡萄糖，F(xiàn)組）6組。采用免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞Sirt1、足細(xì)胞裂孔膜蛋白（Nephrin、Podocin）及CD63、CD81、Alix的表達(dá)水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)D、E組細(xì)胞Sirt1 mRNA表達(dá)水平，使用透射電子顯微鏡觀察足細(xì)胞外泌體形態(tài)，采用納米粒子跟蹤分析技術(shù)檢測(cè)外泌體的粒徑和濃度。結(jié)果RT-qPCR結(jié)果顯示，D組足細(xì)胞Sirt1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于E組（t=14.580，P<0.01）。納米粒子跟蹤分析及免疫印跡結(jié)果顯示，A～C組間足細(xì)胞Sirt1、Nephrin和Podocin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均具有顯著性（F=49.84～106.40，P<0.01）；與A組相比，C組足細(xì)胞外泌體分泌顯著增加（t=14.550，P<0.01），Nephrin、Podocin、Sirt1相對(duì)表達(dá)量顯著減少（t=7.446～15.110，P<0.01）；與E組相比，D組足細(xì)胞外泌體分泌顯著減少（t=74.610，P<0.01），Nephrin、Podocin、Sirt1相對(duì)表達(dá)量顯著增加（t=4.657～32.860，P<0.05）；與C組相比，F(xiàn)組足細(xì)胞外泌體分泌顯著減少（t=16.300，P<0.05），Nephrin、Podocin相對(duì)表達(dá)量顯著增加（t=3.790、8.151，P<0.01），Sirt1表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。結(jié)論高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞Sirt1減少可促進(jìn)外泌體分泌及足細(xì)胞損傷。

［關(guān)鍵詞］糖尿病腎??；血糖；足細(xì)胞；外泌體；抗衰老酶1

［中圖分類(lèi)號(hào)］R587.24［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

Effect of Sirt1 on high glucose-induced exosome release from podocytes? DING Lin， ZHOU Yan， LIU Shanshan， LIU Nanchi， MA Ruixia（Department of Nephrology， The Affiliated Hospital of Qingdao Univesity， Qingdao 266003， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of nicotinamide adenine dinucleotide-dependent deacetylase 1 （Sirt1） on high glucose-induced exosome release from podocytes. MethodsImmortalized mouse podocytes MPC5 were divided into six groups： normal glucose group （5.5 mmol/L glucose， group A）， high mannitol group （5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol， group B）， high glucose group （30.0 mmol/L glucose， group C）， high glucose+Sirt1-overexpressed lentivirus transfection group （Sirt1-overexpressed lentivirus transfection+30.0 mmol/L glucose， group D）， high glucose+negative lentivirus transfection group （negative lentivirus transfection+30.0 mmol/L glucose， group E）， and high glucose+exosome secretion inhibitor group （GW4869+30.0 mmol/L glucose， group F）. Western blot was used to analyze the expression levels of Nephrin， Podocin， Sirt1， CD63， CD81， and Alix in each group. Real-time quantitative polymerase chain reaction was used to analyze the expression level of Sirt1 mRNA in D and E group. The morphology of podocyte exosomes was observed by a transmission electron microscope. The particle size and concentration of exosomes were determined by nanoparticle tracking analysis. ResultsThe results of RT-qPCR showed that the relative expression of Sirt1 mRNA was significantly increased in group D compared with that in group E （t=14.580，P<0.01）. The results of nanoparticle tracking analysis and Western blot showed that the relative expression of Sirt1， Nephrin， and Podocin proteins in podocytes among groups A to C was significantly different （F=49.84-106.40，P<0.01）. Compared with group A， group C had significantly increased secretion of podocyte exosomes （t=14.550，P<0.01） and significantly reduced expression of Sirt1， Nephrin， and Podocin （t=7.446-15.110，P<0.01）. Compared with group E， group D had significantly reduced release of podocyte exosomes （t=74.610，P<0.01） and significantly increased relative expression of Sirt1， Nephrin， and Podocin （t=4.657-32.860，P<0.05）. Compared with group C， group F had significantly reduced release of podocyte exosomes （t=16.300，P<0.05） and significantly increased relative expression of Nephrin and Podocin （t=3.790，8.151，P<0.01）， but showed no significant change in the expression level of Sirt1 （P>0.05）. ConclusionLoss of Sirt1 in high glucose-treated podocytes promotes exosome secretion and podocyte injury.

［KEY WORDS］Diabetic nephropathies; Blood glucose; Podocytes; Exosomes; Sirtuin

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見(jiàn)并發(fā)癥，已成為導(dǎo)致慢性腎臟病和終末期腎病的首要原因[1]。DN以腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、系膜區(qū)擴(kuò)張、足細(xì)胞損傷為特征性表現(xiàn)，其中足細(xì)胞損傷是DN發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[2]。外泌體是細(xì)胞主動(dòng)分泌的直徑約為50～150 nm的均一膜性囊泡結(jié)構(gòu)，其可攜帶豐富的生物活性分子，能夠在可溶性分子之外介導(dǎo)細(xì)胞間新型對(duì)話(huà)[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境刺激下，足細(xì)胞分泌外泌體增加，但其具體機(jī)制尚不清楚[4]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)的去乙?；?（Sirt1）是去乙?；讣易宄蓡T，可促進(jìn)高糖環(huán)境下腎臟細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，對(duì)DN發(fā)病時(shí)的腎細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、腎組織炎癥、腎臟纖維化等有改善作用[5]。但Sirt1是否影響DN足細(xì)胞外泌體分泌目前尚無(wú)研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)闡明Sirt1在DN足細(xì)胞外泌體分泌中的作用。

1材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑與儀器

永生化小鼠足細(xì)胞MPC5由東南大學(xué)腎臟病研究所惠贈(zèng)。ECL化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)買(mǎi)于北京Biosharp公司，IFN-γ購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，慢病毒購(gòu)買(mǎi)于上海吉瑪基因，直標(biāo)抗體GAPDH、β-actin購(gòu)買(mǎi)于上海Abway公司，Sirt1、Nephrin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Podocin抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，CD63、CD81、Alix抗體購(gòu)買(mǎi)于上海Santa Cruz公司。Nano-drop 2000購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Thermo Fisher公司，逆轉(zhuǎn)錄儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.2足細(xì)胞分組與處理

足細(xì)胞MPC5復(fù)蘇后以Mundel法[6]培養(yǎng)，分為以下6組：①正常糖組（A組）：在含5.5 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)基當(dāng)中培養(yǎng)48 h；②高滲組（B組）：在含5.5 mmol/L葡萄糖和24.5 mmol/L甘露醇的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；③高糖組（C組）：在含30.0 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；④高糖＋Sirt1過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染組（D組）：足細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt1過(guò)表達(dá)慢病毒后，在含30.0 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；⑤高糖＋陰性慢病毒轉(zhuǎn)染組（E組）：足細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性慢病毒后在含30.0 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；⑥高糖＋外泌體分泌抑制劑組（F組）：在含有30.0 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)基中加GW4869后培養(yǎng)48 h。

1.3足細(xì)胞外泌體提取與鑒定

將A、C、D、E、F組足細(xì)胞在不含胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，分別收集等量細(xì)胞上清液，使用差速離心法[7]分離足細(xì)胞外泌體。使用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，然后使用納米粒子跟蹤分析（NTA）技術(shù)檢測(cè)外泌體粒徑和濃度。

1.4免疫印跡法檢測(cè)各組足細(xì)胞Nephrin、Podocin、Sirt1及外泌體相關(guān)標(biāo)記蛋白相對(duì)表達(dá)量

RIPA裂解液、PMSF、堿性磷酸酶抑制劑按照100∶1∶1比例配置后用于提取各組培養(yǎng)48 h的足細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白的濃度，在提取的總蛋白中加入上樣緩沖液和雙蒸水，制成等濃度等體積的蛋白樣本，充分混勻，100 ℃水浴加熱5 min。將處理好的蛋白樣本經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，以快速封閉液室溫封閉15 min以后，分別加入一抗（Nephrin、Podocin、Sirt1、CD63、CD81及Alix以1∶1 000稀釋?zhuān)睒?biāo)GAPDH、β-actin以1∶10 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗（以1∶3 000稀釋?zhuān)?，室溫孵? h，再洗膜以后使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。采用Image J軟件檢測(cè)各個(gè)目的條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算各目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.5RT-qPCR法檢測(cè)D、E組足細(xì)胞Sirt1 mRNA表達(dá)水平

提取D、E組培養(yǎng)48 h的足細(xì)胞總RNA后，用Nano-drop 2000檢測(cè)兩組足細(xì)胞RNA的濃度和純度，用HiScript Ⅲ RT SuperMix在逆轉(zhuǎn)錄儀中逆轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后在7300 RT-qPCR檢測(cè)系統(tǒng)中使用PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)所用引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，Sirt1引物的序列為F：5′-GCTGACGACTTCGACGACG-3′，R：5′-TCGGTCAACAGGAGGTTGTCT-3′，β-actin引物序列為F：5′-GGGAAATCGTGCGTGAC-3′，R：5′-AGGCTGGAAAAGAGCCT-3′。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△CT計(jì)算細(xì)胞Sirt1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著意義。

2結(jié)果

2.1各組足細(xì)胞Sirt1、Nephrin、Podocin表達(dá)水平比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，D、E組Sirt1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為15.50±2.43、1.01±0.17，D組足細(xì)胞Sirt1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著高于E組（t=14.580，P<0.05）。免疫印跡法分析顯示，A～C多組間足細(xì)胞Sirt1、Nephrin和Podocin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均有顯著性（F=49.84～106.40，P<0.01）；與A組相比，C組足細(xì)胞Sirt1、Nephrin以及Podocin相對(duì)表達(dá)量顯著降低（t=7.446～15.110，P<0.01），B組足細(xì)胞Sirt1、Nephrin和Podocin相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異（P>0.05）；與E組相比，D組足細(xì)胞Sirt1、Nephrin和Podocin相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（t=4.657～32.860，P<0.05）；與C組相比，F(xiàn)組足細(xì)胞Nephrin、Podocin相對(duì)表達(dá)量顯著升高（t=3.790、8.151，P<0.01），Sirt1表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

2.2足細(xì)胞外泌提取及體分泌情況

透射電鏡下可見(jiàn)各組足細(xì)胞外泌體呈現(xiàn)典型的茶托樣結(jié)構(gòu)（圖2A）。NTA檢測(cè)結(jié)果顯示，A、C、D、E、F組足細(xì)胞外泌體濃度分別為（61.30±1.50）×106/L、（87.00±2.60）×106/L、（21.2±0.30）×106/L、（66.00±1.00）×106/L和（6.40±0.46）×106/L；與A組相比，C組足細(xì)胞外泌體分泌顯著增加（t=14.550，P<0.01）；與E組相比，D組足細(xì)胞外泌體分泌顯著減少（t=74.610，P<0.01）；與C組相比，F(xiàn)組足細(xì)胞外泌體分泌量顯著減少（t=16.300，P<0.05）。免疫印跡法結(jié)果顯示，與A組相比，C組足細(xì)胞外泌體相關(guān)標(biāo)志蛋白Alix、CD63以及CD81表達(dá)增加（圖2B）；與E組相比，D組足細(xì)胞Alix、CD63以及CD81表達(dá)減少（圖2C）。

3討論

DN是糖尿病患者嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，是一種慢性進(jìn)行性疾病，是終末期腎臟病的常見(jiàn)病因，近年來(lái)其發(fā)病率與日俱增[6]。目前DN的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。研究顯示，足細(xì)胞是位于腎小球基底膜外表面的終末分化細(xì)胞，在維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用[8]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腎小球足細(xì)胞在DN的發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用[9-12]，但其具體機(jī)制仍不十分清楚。

外泌體是一種直徑為50～150 nm的細(xì)胞外囊泡，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程形成，并且由細(xì)胞內(nèi)多泡體（MVBs）釋放[3]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，參與各種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展[13-14]。由于足細(xì)胞可分泌含有多種因子的外泌體[15-16]，且足細(xì)胞功能受外泌體的調(diào)節(jié)[17-18]，因此外泌體分泌異?？赡苁荄N足細(xì)胞功能障礙的重要機(jī)制。既往研究發(fā)現(xiàn)，在體外高糖環(huán)境刺激下，足細(xì)胞分泌外泌體增加。此外鏈脲佐菌素誘導(dǎo)6、12周小鼠體內(nèi)尿足細(xì)胞外泌體分泌增加，且先于尿蛋白升高[4]。但DN足細(xì)胞外泌體分泌增加的具體機(jī)制尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)其可能與Sirt1表達(dá)的減少有關(guān)。

Sirt1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)的去乙?；讣易宄蓡T，在機(jī)體衰老、炎癥中發(fā)揮著重要作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1可維持高糖環(huán)境下腎臟細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，對(duì)DN發(fā)病時(shí)的腎細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、腎組織炎癥、腎臟纖維化等有改善作用[20]。既往研究表明，Sirt1在DN患者足細(xì)胞和腎小球細(xì)胞中表達(dá)降低，且糖尿病小鼠Sirt1全身敲除及足細(xì)胞特異性敲除均可加速DN的進(jìn)展[21]。此外，Sirt1活性增高可以預(yù)防糖尿病誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，并有效緩解DN的進(jìn)展[22]。關(guān)于Sirt1與外泌體分泌間的關(guān)系，LATIFKAR等[23]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中，Sirt1的缺失可能通過(guò)影響V型質(zhì)子ATP酶催化亞基A（ATP6V1A）mRNA的穩(wěn)定性，來(lái)影響溶酶體膜上ATP6V1A的表達(dá)，造成溶酶體酸化功能障礙，進(jìn)而引起MVBs與質(zhì)膜融合，增加外泌體釋放。上述過(guò)程中能夠在細(xì)胞水平上促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)，但是Sirt1在DN足細(xì)胞外泌體分泌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞Nephrin、Podocin以及Sirt1表達(dá)減少，足細(xì)胞外泌體分泌增加。對(duì)足細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt1過(guò)表達(dá)慢病毒后，發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下足細(xì)胞外泌體釋放減少，Nephrin、Podocin及Sirt1表達(dá)增加，足細(xì)胞損傷減輕。此外，外泌體釋放抑制劑GW4869干預(yù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞后，足細(xì)胞損傷也有所減輕。以上結(jié)果提示Sirt1可能通過(guò)抑制外泌體分泌減輕DN足細(xì)胞損傷，但上述結(jié)論還需進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，且需對(duì)Sirt1下游機(jī)制進(jìn)行探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞外泌體分泌增加與Sirt1的減少有關(guān)，而過(guò)表達(dá)Sirt1可減輕足細(xì)胞的損傷，減少外泌體分泌。本研究首次研究了Sirt1與DN足細(xì)胞外泌體分泌的關(guān)系，補(bǔ)充了足細(xì)胞外泌體釋放的具體分子機(jī)制，為DN治療新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

作者聲明：丁琳、馬瑞霞參與了研究設(shè)計(jì)；丁琳、周燕、劉珊珊、劉南池、馬瑞霞參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強(qiáng)）