核糖體調(diào)控因子1對(duì)人乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響

王潤(rùn)澤　彭翠修　宋軍瑩　侯琳

［摘要］目的探討核糖體合成調(diào)控因子1（RRS1）對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。方法通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細(xì)胞）以及正常人乳腺上皮細(xì)胞中RRS1蛋白的表達(dá)量；將MDA-MB-468細(xì)胞分別感染sh-RRS1慢病毒（sh-RRS1組）和陰性對(duì)照慢病毒（Con組），未進(jìn)行任何感染的MDA-MB-468細(xì)胞為Blank組，在熒光顯微鏡下觀察Con組和sh-RRS1組慢病毒感染效率，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)和Western Blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組細(xì)胞中RRS1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平；采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RRS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞活力的影響；采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RRS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果各乳腺癌細(xì)胞系中RRS1的表達(dá)水平均明顯高于正常人乳腺上皮細(xì)胞（F=28.71，P<0.05）；相較于Blank組和Con組，sh-RRS1組細(xì)胞中RRS1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（F=118.10、335.40，P<0.05），細(xì)胞增殖活力明顯減弱（F=825.60～2 839.00，P<0.05），侵襲和遷移能力明顯降低（F=25.60～430.80，P<0.05）。結(jié)論RRS1基因可能參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程，其作用可能與細(xì)胞中RRS1的高表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］乳腺腫瘤；細(xì)胞系，腫瘤；核蛋白質(zhì)類；核糖體調(diào)控因子1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

［中圖分類號(hào)］R737.9［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

Effect of regulator of ribosome synthesis 1 on proliferation and metastasis abilities of human breast cancer MDA-MB-468 cellsWANG Runze， PENG Cuixiu， SONG Junying， HOU Lin（Department of Biochemistry and Molecular Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of regulator of ribosome synthesis 1 （RRS1） on the proliferation and metastasis abilities of human breast cancer cells.MethodsWestern Blot was used to measure the protein expression level of RRS1 in human breast cancer cell lines （MDA-MB-231， MDA-MB-468， BT549， and MCF-7） and normal human breast epithelial cells. MDA-MB-468 cells were infected with sh-RRS1 lentivirus （sh-RRS1 group） and negative-control lentivirus （Con group）， and MDA-MB-468 cells without infection were established as Blank group. Lentiviral infection efficiency was observed under a fluorescence microscope for the Con group and the sh-RRS1 group， and quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of RRS1 in cells; CCK-8 assay was used to observe the effect of RRS1 on the viability of MDA-MB-468 cells; scratch assay， Transwell assay， and invasion assay were used to observe the effect of RRS1 on the invasion and migration abilities of MDA-MB-468 cells. ResultsThe expression level of RRS1 in the breast cancer cell lines was significantly higher than that in normal human breast epithelial cells （F=28.71，P<0.05）. Compared with the Blank group and the Con group， the sh-RRS1 group had significant reductions in the mRNA and protein expression levels of RRS1 （F=118.10，335.40，P<0.05）， cell proliferation activity （F=825.60-2839.00，P<0.05）， and the invasion and migration abilities of cells （F=25.60-430.80，P<0.05）. ConclusionThe RRS1 gene might be involved in the proliferation and metastasis of breast cancer cells， which may be associated with the high expression of RRS1 in cells.

［KEY WORDS］Breast Neoplasms; Cell line， tumor; Nuclear proteins; Regulator of ribosome synthesis 1; Cell proliferation; Cell movement

乳腺癌是全球女性最高發(fā)的癌癥之一，幾十年來(lái)發(fā)病率一直持續(xù)增高[1]，約90%的乳腺癌相關(guān)死亡與其轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。目前，手術(shù)治療并輔以放化療是乳腺癌的主要治療方法，但治療后復(fù)發(fā)率仍然較高，且化療的副作用較大，因此尋找新的治療方法就顯得尤為重要。近年來(lái)，隨著對(duì)乳腺癌認(rèn)識(shí)的不斷深入，乳腺癌的靶向治療逐漸成為研究的焦點(diǎn)。

乳腺癌具有增殖迅速、周圍組織浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處擴(kuò)散能力強(qiáng)等特點(diǎn)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞有著更為活躍的核糖體生物合成功能。核糖體合成調(diào)控因子1（RRS1）作為影響核糖體合成的關(guān)鍵因子，能夠介導(dǎo)25S rRNA的成熟和60S亞基的組裝[3-7]，參與核糖體的生物合成。此外，RRS1在其他生理與病理過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，RRS1可影響細(xì)胞周期致染色體畸變[8]，可參與亨廷頓病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[9]，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的P53活性[10]，并在乳腺癌、肝細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)直腸癌以及胃癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[11-17]。因此，RRS1有望成為乳腺癌治療的潛在新靶點(diǎn)，而RRS1與乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)系目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察敲降RRS1基因后乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞增殖、侵襲以及遷移能力的變化，探討RRS1在MDA-MB-468細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，為臨床治療乳腺癌提供新的思路和依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源

人乳腺癌細(xì)胞系的MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細(xì)胞以及正常人乳腺上皮細(xì)胞（HMEC）（武漢普諾賽公司），RRS1敲降慢病毒（sh-RRS1）、陰性對(duì)照慢病毒、病毒感染試劑（上海吉?jiǎng)P公司），Transwell小室（美國(guó)Millipore公司），細(xì)胞總蛋白提取試劑（RIPA）（思科捷公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒（中國(guó)諾唯贊公司）。

1.2研究方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)以及處理將人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細(xì)胞及正常HMEC分別置于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清以及體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素混合溶液的DMEM中，在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2慢病毒感染將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-468細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合約至70%時(shí)，分別感染sh-RRS1慢病毒（sh-RRS1組）和攜帶無(wú)義序列的陰性對(duì)照慢病毒（Con組），Blank組MDA-MB-468細(xì)胞未進(jìn)行任何感染。感染后于上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的感染效率，48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-468細(xì)胞，按每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，共接種5個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，6 h后任取一個(gè)培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，隨后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h以后，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，以酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值，吸光度值大小代表細(xì)胞活力。從接種后第2天開(kāi)始，每天于相同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)5 d。

1.2.4Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)水平收取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細(xì)胞、正常HMEC和各組MDA-MB-468細(xì)胞，RIPA法裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入適量5×蛋白上樣緩沖液，然后煮沸10 min。將總蛋白在100 g/L聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在體積分?jǐn)?shù)為0.05的脫脂奶粉中封閉2 h。兔抗人RRS1抗體（1∶1 000）4 ℃下孵育過(guò)夜，以GAPDH作為內(nèi)參照，羊抗兔二抗室溫下孵育1 h，顯影后拍照。蛋白條帶使用Image J軟件分析灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.2.5RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中RRS1 mRNA表達(dá)水平收取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組MDA-MB-468細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，以GAPDH作為內(nèi)參照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。采用2－△△CT方法計(jì)算各組細(xì)胞中RRS1以及GAPDH mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列為RRS1：正向5′-CCCT-ACCGGACACCAGAGTAA-3′，反向5′-CCGAAA-AGGGGTTGAAACTTCC-3′；GAPDH：正向5′-A-GAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反向5′-AGG-GGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力劃痕實(shí)驗(yàn)：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組MDA-MB-468細(xì)胞，接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，使用200 μL移液器槍尖垂直于孔板畫線，隨后用PBS洗滌2～3次。在孔內(nèi)加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)0、6、12、24 h后，顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕愈合情況，以24 h劃痕愈合情況進(jìn)行遷移能力差異分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。Transwell實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組MDA-MB-468細(xì)胞，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于Transwell小室中的上室中，下室中加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)0.3 FBS的DMEM培養(yǎng)液。Transwell小室提前在上室中加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)液，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h。加入細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)10～12 h，將上室中未穿過(guò)的細(xì)胞擦去，用結(jié)晶紫染液將下室的細(xì)胞染色5 min，以PBS清洗3次以后置于顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.2.7侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力將Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶8的比例混合，每個(gè)小室的上室中加入35 μL混合后的基質(zhì)膠，并放入培養(yǎng)箱中孵育1 h使其聚合成凝膠，其余流程的操作同Transwell實(shí)驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組不同時(shí)間的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1正常HMEC與乳腺癌細(xì)胞系中RRS1蛋白的表達(dá)量

Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常HMEC、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549以及MCF-7細(xì)胞中RRS1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.63±0.02、1.00±0.07、1.17±0.08、1.06±0.09、1.17±0.09，各組間比較差異具有顯著性（F=28.71，P<0.05），其中人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)量均顯著高于正常HMEC（P<0.05），人乳腺癌細(xì)胞系各細(xì)胞間比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2RRS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞增殖活力的影響

重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、分組和時(shí)間與分組的交互作用對(duì)細(xì)胞的增殖能力均具有明顯影響（F時(shí)間=3 153.00，F(xiàn)組別=1 298.00，F(xiàn)交互=244.30，P<0.05）；與第1天相比，Blank組、Con組、sh-RRS1組其他時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力均明顯增強(qiáng)（F=136.70～4240.00，P<0.05）；但是與Blank組相比，sh-RRS1組細(xì)胞第2～5天的增殖能力均明顯降低（F=825.60～2 839.00，P<0.05），而Blank組與Con組細(xì)胞增殖能力比較均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3各組細(xì)胞中RRS1蛋白和mRNA表達(dá)水平的比較

MDA-MB-468細(xì)胞慢病毒感染24 h后，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)含有綠色熒光蛋白（GFP）的細(xì)胞，結(jié)果顯示Con組和sh-RRS1組細(xì)胞的感染效率均在80%以上。Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，Blank組、Con組、sh-RRS1組細(xì)胞RRS1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.16±0.02、0.97±0.02、0.79±0.01，各組間比較差異具有顯著性（F=335.40，P<0.05），其中Blank組和Con組均顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，Blank組、Con組、sh-RRS1組細(xì)胞RRS1 mRNA的表達(dá)量分別為1.03±0.06、1.08±0.10、0.28±0.02，各組間比較差異具有顯著性（F=118.10，P<0.05），其中Blank組和Con組均顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

2.4RRS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，Blank組、Con組、sh-RRS1組細(xì)胞24 h遷移率分別為0.51±0.01、0.51±0.01、0.19±0.02，各組細(xì)胞遷移率比較差異具有顯著性（F=328.40，P<0.05），其中Blank組和Con組細(xì)胞遷移率均顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。MDA-MB-468細(xì)胞慢病毒感染48 h以后，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，Blank組、Con組、sh-RRS1組細(xì)胞從小室上層穿過(guò)至下層的數(shù)目分別為428.70±28.68、423.70±11.72、49.00±5.57，各組細(xì)胞從小室上層穿至下層小室的數(shù)目比較差異具有顯著性（F=430.80，P<0.05），其中Blank組和Con組穿至下層小室的數(shù)目顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5RRS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞侵襲能力的影響

MDA-MB-468細(xì)胞感染慢病毒48 h后，侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，Blank組、Con組、sh-RRS1組從小室上層穿過(guò)至下層的細(xì)胞數(shù)目分別為226.00±55.65、212.00±40.84、16.00±9.00，各組間比較差異具有顯著意義（F=25.60，P<0.05），其中Blank組和Con組的細(xì)胞數(shù)目均顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

3討論

隨著發(fā)病率的逐年上升，乳腺癌已然成為全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤。原發(fā)性乳腺癌的5年生存率為99%，然而約有三分之一的乳腺癌患者會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，多發(fā)生在確診后的5年內(nèi)，并對(duì)患者的發(fā)病率和死亡率產(chǎn)生重大影響。一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者5年生存率將會(huì)驟降至約23%[18]。乳腺癌具有向骨、肝、腦以及肺轉(zhuǎn)移的傾向，稱之為器官趨向性[19-21]。因此乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的問(wèn)題逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，有多條信號(hào)通路與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有重要的調(diào)節(jié)作用[22-23]。核糖體是普遍存在于細(xì)胞中的一種高度精密的細(xì)胞器，是生物體細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成工廠，核糖體的生物合成過(guò)程是細(xì)胞內(nèi)最復(fù)雜的過(guò)程，大量調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路共同參與核糖體的生物合成。由于腫瘤細(xì)胞需要大量核糖體以維持自身的快速生長(zhǎng)[24-25]，因此針對(duì)核糖體的生物合成過(guò)程進(jìn)行干預(yù)有望為乳腺癌的治療提供新的途徑。

RRS1蛋白是影響核糖體合成的關(guān)鍵因子，參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，RRS1蛋白通過(guò)激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和侵襲[26]。miRNA-148A能夠下調(diào)RRS1蛋白表達(dá)，抑制宮頸癌的增殖和侵襲，并促進(jìn)其凋亡[18]。在甲狀腺乳頭狀癌中，RRS1蛋白表達(dá)下調(diào)抑制了其增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[14]。WANG等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)慢病毒shRNA抑制RRS1的表達(dá)后，可顯著抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的集落生成能力，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，RRS1蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞中P53通路具有重要影響[27-28]。RRS1蛋白在核仁中招募核糖體蛋白L11（RPL11）并參與組成5S核糖核蛋白顆粒（5S RNP）[29]，當(dāng)降低細(xì)胞內(nèi)的RRS1的表達(dá)以后，RPL11會(huì)從5S RNP中游離出來(lái)并與鼠雙微體基因2（MDM2）結(jié)合，從而抑制MDM2對(duì)P53的泛素化，最終激活P53[5，19-21]。研究表明，RRS1在肝細(xì)胞癌中拷貝數(shù)增加，并通過(guò)RPL11-MDM2-P53通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展[17]。由此可以推測(cè)，RRS1與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但RRS1在人乳腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。

本研究通過(guò)建立MDA-MB-468細(xì)胞的RRS1敲降模型，探討RRS1在MDA-MB-468增殖和轉(zhuǎn)移中的作用。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細(xì)胞當(dāng)中RRS1蛋白的表達(dá)水平均明顯高于正常HMEC，提示腫瘤細(xì)胞中有較高水平的RRS1蛋白以維持其旺盛的生理活動(dòng)。為進(jìn)一步探討相關(guān)作用機(jī)制，本研究以sh-RRS1慢病毒感染MDA-MB-468細(xì)胞48 h后，采用RT-qPCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)慢病毒對(duì)RRS1基因的敲降效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲降RRS1基因顯著減少了MDA-MB-468細(xì)胞RRS1 mRNA和蛋白的表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲降RRS1顯著抑制了MDA-MB-468細(xì)胞的增殖活力，對(duì)敲降RRS1的MDA-MB-468細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，敲降RRS1后MDA-MB-468細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力明顯下降。上述結(jié)果表明，RRS1蛋白能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468的增殖和轉(zhuǎn)移，而敲降RRS1基因后可降低乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468的增殖和轉(zhuǎn)移能力。提示RRS1蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖能力有明顯的促進(jìn)作用。

綜上所述，乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞在敲降RRS1基因后表現(xiàn)出明顯的增殖抑制現(xiàn)象，并且侵襲能力和遷移能力也明顯減弱，提示RRS1在乳腺癌的增殖、遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。本研究首次從細(xì)胞水平上探討了乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的乳腺癌治療靶點(diǎn)提供了數(shù)據(jù)參考，但具體的分子機(jī)制還需要后續(xù)進(jìn)一步探討。

作者聲明：王潤(rùn)澤、侯琳參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；王潤(rùn)澤、彭翠修、宋軍瑩進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)；王潤(rùn)澤參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

［參考文獻(xiàn)］

[1]SIEGEL R L， MILLER K D， FUCHS H E， et al. Cancer statistics， 2021[J]. CA Cancer J Clin， 2021，71（1）：7-33.

[2]LIANG Y R， ZHANG H W， SONG X J， et al. Metastatic heterogeneity of breast cancer： Molecular mechanism and potential therapeutic targets[J]. Semin Cancer Biol， 2020，60：14-27.

[3]GRANNEMAN S， BASERGA S J. Ribosome biogenesis： Of knobs and RNA processing[J]. Exp Cell Res， 2004，296（1）：43-50.

[4]BALER J， HURT E. Eukaryotic ribosome assembly[J]. Annu Rev Biochem， 2019，88：281-306.

[5]ZHANG J Y， HARNPICHARNCHAI P， JAKOVLJEVIC J， et al. Assembly factors Rpf2 and Rrs1 recruit 5S rRNA and ribosomal proteins rpL5 and rpL11 into nascent ribosomes[J]. Genes Dev， 2007，21（20）：2580-2592.

[6]TSUNO A， MIYOSHI K， TSUJII R， et al. RRS1， a conserved essential gene， encodes a novel regulatory protein required for ribosome biogenesis in Saccharomyces cerevisiae[J]. Mol Cell Biol， 2000， 20（6）：2066-2074.

[7]KHARDE S， CALVIO F R， GUMIERO A， et al. The structure of Rpf2-Rrs1 explains its role in ribosome biogenesis[J]. Nucleic Acids Res， 2015，43（14）：7083-7095.

[8]GAMBE A E， MATSUNAGA S， TAKATA H， et al. A nucleolar protein RRS1 contributes to chromosome congression[J]. FEBS Lett， 2009，583（12）：1951-1956.

[9]HORIGOME C， OKADA T， SHIMAZU K， et al. Ribosome biogenesis factors bind a nuclear envelope SUN domain protein to cluster yeast telomeres[J]. EMBO J， 2011，30（18）：3799-3811.

[10]CARNEMOLLA A， FOSSALE E， AGOSTONI E， et al. Rrs1 is involved in endoplasmic reticulum stress response in Huntington disease[J]. J Biol Chem， 2009，284（27）：18167-18173.

[11]SONG J L， MA Z L， HUA Y N， et al. Functional role of RRS1 in breast cancer cell proliferation[J]. J Cell Mol Med， 2018，22（12）：6304-6313.

[12]HUA Y N， SONG J L， MA Z L， et al. Effect of RRS1 gene knockdown on BT549 cell line proliferation and apoptosis in breast cancer[J]. Neoplasma， 2019，66（1）：28-32.

[13]WANG J T， LI Z， ZUO C Z， et al. Knockdown of RRS1 by lentiviral-mediated RNAi promotes apoptosis and suppresses proliferation of human hepatocellular carcinoma cells[J]. Oncol Rep， 2017，38（4）：2166-2172.

[14]CAO P B， YANG A Q， LI P Y， et al. Genomic gain of RRS1 promotes hepatocellular carcinoma through reducing the RPL11-MDM2-p53 signaling[J]. Sci Adv， 2021，7（35）：eabf4304.

[15]WU X L， YANG Z W， HE L， et al. RRS1 silencing suppresses colorectal cancer cell proliferation and tumorigenesis by inhibiting G2/M progression and angiogenesis[J]. Oncotarget， 2017，8（47）：82968-82980.

[16]MA Y L， YAN F， WEI W J， et al. microRNA-598 inhibits the growth and maintenance of gastric cancer stem-like cells by down-regulating RRS1[J]. Cell Cycle， 2019，18（20）：2757-2769.

[17]CHEN F， JIN Y Q， FENG L， et al. RRS1 gene expression involved in the progression of papillary thyroid carcinoma[J]. Cancer Cell Int， 2018，18：20.

[18]SIEGEL R， NAISHADHAM D， JEMAL A. Cancer statistics， 2012[J]. CA A Cancer J Clin， 2012，62（1）：10-29.

[19]HAO S J， HA L， CHENG G， et al. A spontaneous 3D bone-on-a-chip for bone metastasis study of breast cancer cells[J]. Small， 2018，14（12）：e1702787.

[20]WATASE C， SHIINO S， SHIMOI T， et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state， treatment options and future perspectives[J]. Cancers （Basel）， 2021，13（5）：1078.

[21]WU Q， LI J J， ZHU S， et al. Breast cancer subtypes predict the preferential site of distant metastases： A SEER based study[J]. Oncotarget， 2017，8（17）：27990-27996.

[22]XU Y Y， YE S， ZHANG N， et al. The FTO/miR-181b-3p/ARL5B signaling pathway regulates cell migration and invasion in breast cancer[J]. Cancer Commun （Lond）， 2020，40（10）：484-500.

[23]YI D D， WANG R， SHI X B， et al. METTL14 promotes the migration and invasion of breast cancer cells by modulating N6-methyladenosine and hsa-miR-146a-5p expression[J]. Oncol Rep， 2020，43（5）：1375-1386.

[24]PENZO M， MONTANARO L， TRER D， et al. The ribosome biogenesis-cancer connection[J]. Cells， 2019，8（1）：E55.

[25]NAIT SLIMANE S， MARCEL V， FENOUIL T， et al. Ribosome biogenesis alterations in colorectal cancer[J]. Cells， 2020，9（11）：E2361.

[26]YAN X J， WU S， LIU Q， et al. RRS1 promotes retinoblastoma cell proliferation and invasion via activating the AKT/mTOR signaling pathway[J]. Biomed Res Int， 2020：2420437.

[27]DONATI G， PEDDIGARI S， MERCER C A， et al. 5S ribosomal RNA is an essential component of a nascent ribosomal precursor complex that regulates the Hdm2-p53 checkpoint[J]. Cell Rep， 2013，4（1）：87-98.

[28]NISHIMURA K， KUMAZAWA T， KURODA T， et al. Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation[J]. Cell Rep， 2015，10（8）：1310-1323.

[29]MICIC J， LI Y， WU S， et al. Coupling of 5S RNP rotation with maturation of functional centers during large ribosomal subunit assembly[J]. Nat Commun， 2020，11（1）：3751.

（本文編輯 耿波 厲建強(qiáng)）