奇白消軟膏的定性鑒別與定量檢測

梁林輝 章斌 姚永秀 彭東 劉德軍 趙君

【摘?要】 目的：建立奇白消軟膏的定性鑒別與含量測定方法，加強(qiáng)奇白消軟膏的質(zhì)量控制。方法：采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的黃連和人工牛黃進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中黃連有效成分鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果：奇白消軟膏的TLC斑點(diǎn)清晰、陰性無干擾、分離度好；鹽酸小檗堿在1.28～38.4 μg；回歸方程為Y=49873.84X-554.74（r＝1）。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD分別為0.41%、0.38%、1.8%；加樣回收率為98.88％～101.23％，RSD為0.95％（n＝6）。結(jié)論：本研究建立的TLC和HPLC簡便易行，準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于奇白消軟膏的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】?奇白消軟膏；鹽酸小檗堿；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量控制

【中圖分類號】R284.1???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2024）01-0028-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.01.zgmzmjyyzz202401007

Research on TLC Indentification and Content Determination of Qibaixiao Ointment

LIANG Linhui1，2?ZHANG Bin1，2*?YAO Yongxiu1，2?PENG Dong3?LIU Dejun1，2?ZHAO Jun4

1. School of Pharmacy and Medical Laboratory Science， Yaan Polytechnic College， Yaan， 625000， China;

2.Yaan Food and Drug Application Development Research Center， Yaan， 625000， China;

3.Yaan Puyuan Biotechnology Co.， Ltd， Yaan， 625000， China;

4. School of pharmacy， Chengdu Medical College， Chengdu， 610000， China

Abstract：Objective To establish the identification and content determination methods of Qibaixiao Ointment， to enhance the quality controllability of Qibaixiao Ointment. Methods Thin layer chromatography method（TLC）was used for qualitative identification of Coptis chinensis Franch， Bovis calculus Artifactus. Using high performance liquid chromatography （HPLC） was used for content determination of Berberine hydrochloride. Results The TLC spots were clear spots with less negative interference， well separated and good reproducibility. Berberine hydrochloride showed a good linear relationship in the range of 1.28-38.4 μg. The regression equation was： Y=49873.84X-554.74（r＝1）. The RSD values of precision， repeatability and stability experiments were 0.41%， 0.38%， 1.8%. The average recovery rates was 98.88%-101.23% with RSD was 0.95%（n=6）. Conclusion The qualitative identification method and content determination method established method in this study for Qibaixiao Ointment are easy to operate with good reproducibility and accurate， reliable. It can be used to evaluate the quality of Qibaixiao Ointment.

Keywords：Qibaixiao Ointment; Berberine Hydrochloride; TLC; HPLC; Quality Control

奇白消軟膏是由黃連、人工牛黃、冰片、琥珀、朱砂粉等6味中藥組成，輔以凡士林適量，制成的軟膏劑，具有解毒燥濕，殺蟲止癢功效。其中，君藥黃連清熱燥濕，瀉火解毒；人工牛黃清熱解毒；佐以冰片、琥珀、朱砂，清熱止痛、散瘀止血、安神解毒^［1］。臨床常用于外陰白斑病，癥見白斑帶下、陰癢、皸裂，潰瘍、增生或萎縮等^［2］。同時(shí)，奇白消軟膏在治療嬰兒濕疹方面療效顯著^［3］。奇白消軟膏臨床使用多年，但未見有其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。為加強(qiáng)制劑的質(zhì)量控制，保證用藥安全、有效，本文研究該制劑薄層鑒別和含量測定兩項(xiàng)主要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目，為奇白消軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考。

1?儀器與材料

1.1?儀器?Essentia LC-16高效液相色譜儀（日本島津），AUW120D分析天平（日本島津），Symmetry-C18色譜柱（美國沃特世），Shim-pack VP-ODS色譜柱 ?（日本島津）。

1.2?藥品與試劑?奇白消軟膏（批號：20210616-1、20210616-2，四川家傳方中醫(yī)藥科技有限公司）；鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-20100，含量：86％，中國食品藥品檢定研究院）；黃連對照藥材（批號：DZYC-H-004，成都瑞芬思生物科技有限公司）；牛膽粉（批號：KZTL-5E46，中國食品藥品檢定研究院）；色譜純甲醇（批號：LOT 210841，賽默飛）、色譜純乙腈（批號：210774，賽默飛）；純化水為市售純凈水；其他試劑（分析純）均為市售常規(guī)試劑。

2?方法與結(jié)果

2.1?定性鑒別

2.1.1?黃連的薄層鑒別?取奇白消軟膏3.0 g，加石油醚30 mL攪拌均勻，3000 r/min離心5 min，棄去上清夜，沉淀加25 mL甲醇超聲處理30 min，3000 r/min離心5 min，上清液為供試品溶液；取除黃連藥材外其他5味藥材，按處方比例混合并與凡士林混合均勻，參照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取黃連對照藥材0.25 g，加25 mL甲醇超聲處理30 min，3000 r/min離心5 min，上清液作為對照藥材溶液。取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對照溶液、對照藥材溶液及對照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙醇-冰乙酸-水（4∶1∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，365 nm下檢視。供試品和對照藥材色譜在相應(yīng)的位置上顯三個(gè)相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾（如圖1a）。

按上述方法，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）為展開劑，把硅膠板置于濃氨飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，365 nm下檢視。供試品和對照藥材色譜在相應(yīng)的位置上顯五個(gè)相同顏色的斑點(diǎn)，供陰性對照無干擾（如圖1b）。

2.1.2?人工牛黃的薄層鑒別?取奇白消軟膏3.0 g，加石油醚30 mL攪拌均勻，3000 r/min離心5 min，棄去上清夜，沉淀加25 mL甲醇超聲處理30 min，3000 r/min離心5 min，上清液為供試品溶液；取除人工牛黃外其他5味藥材，按處方比例混合并與凡士林混合均勻，參照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取牛膽粉對照品，加甲醇制成1.5 mg/mL的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對照溶液及對照品溶液各8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品和對照品色譜在相應(yīng)的位置上顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾（如圖2）。

2.2?含量測定

2.2.1?色譜方法適用性考察

2.2.1.1?色譜條件?處方中黃連為君藥，故選擇黃連的有效成分鹽酸小檗堿作為奇白消軟膏含量測定指標(biāo)。色譜柱： Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長為345 nm；流動(dòng)相為乙腈：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（30∶70）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。結(jié)果表明，樣品中鹽酸小檗堿峰分離好，峰形對稱，并且陰性無干擾，該法專屬性良好（如圖3）。

2.2.1.2?對照品溶液的制備?精密稱取鹽酸小檗堿對照品，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.2.1.3?線性關(guān)系考察?精密量取鹽酸小檗堿對照品溶液適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇搖勻，定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.5 μg/mL、3 μg/mL、9 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL、40 μg/mL的對照品溶液。按“2.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4；鹽酸小檗堿的回歸方程、線性范圍見表1。結(jié)果表明鹽酸小檗堿的線性關(guān)系良好。

2.2.1.4?精密度試驗(yàn)?參照“2.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，選取“2.2.1.3”項(xiàng)下濃度為25 μg/mL鹽酸小檗堿對照品，連續(xù)進(jìn)樣6次，鹽酸小檗堿的峰面積RSD為 0.41%，儀器精密度良好。

2.2.2?樣品溶液的制備方法考察

2.2.2.1?制備方法試驗(yàn)?取齊白消軟膏（批號：20210616-1）12份，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別以50%甲醇-鹽酸（100∶1）、75%甲醇-鹽酸（100∶1）、甲醇-鹽酸（100∶1）、50%乙醇-鹽酸（100∶1）、70%乙醇-鹽酸（100∶1）、95%乙醇-鹽酸（100∶1）混合溶液各50 mL為提取溶劑，平行1份，稱定重量，超聲處理30 min，取出，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。按“2.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定含量，結(jié)果見表3。由表3可知，95%乙醇對指標(biāo)成分的提取含量較高。但考慮到齊白消軟膏中凡士林對提取效果的影響，故進(jìn)行追加實(shí)驗(yàn)，先除去凡士林，再考察甲醇和95%乙醇的提取效果。取本品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加20 mL石油醚（60～90），攪拌振搖，濾過，殘?jiān)芗尤爰状?鹽酸（100∶1）、95%乙醇-鹽酸（100∶1）混合溶液50 mL，平行1份，稱定重量。同法制成供試品溶液。結(jié)果表明，去除凡士林后，鹽酸小檗堿含量明顯提高，優(yōu)選以甲醇-鹽酸（100∶1）溶劑來制備樣品。

2.2.2.2?供試品溶液的制備?取本品適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加20 mL石油醚（60～90），攪拌振搖，濾過，殘?jiān)芗尤爰状?鹽酸（100∶1）混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-鹽酸（100∶1）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3?陰性對照溶液的制備?取奇白消軟膏（缺黃連）陰性對照，按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備得缺黃連的陰性對照溶液。

2.2.3?重復(fù)性試驗(yàn)?取本品（批號：20210616-1）0.5 g，精密稱定，共6份，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備；按“2.2.1.1”色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見表4，鹽酸小檗堿含量的RSD為1.80%，表明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.2.4?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取“2.2.3”項(xiàng)下1號供試品溶液，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣，記錄鹽酸小檗堿峰面積，計(jì)算RSD值。由表5可知，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.38%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5?加樣回收率試驗(yàn)?取已知含量的樣品（批號：20210616-2）0.5 g，精密稱定，共6份，計(jì)算得鹽酸小檗堿含量為（3.1629 mg/g），分別精密加入鹽酸小檗堿（0.2741 mg/mL）的對照品溶液5 mL，定容，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算回收率。由表6可知，鹽酸小檗堿平均加樣回收率為99.93%，RSD值為0.95%，表明該方法的準(zhǔn)確度較好。

2.2.6?樣品含量測定?取黃連藥材、批次奇白消軟膏（批號： 20210616-1、20210616-2）樣品各1份，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并取“2.2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表7。處方中，黃連80 g，總量1000 g，轉(zhuǎn)移率為63.51%，計(jì)算公式如下：

3?討論

奇白消軟膏是以大量凡士林為輔料制成的稠膏劑，對薄層鑒別及含量測定帶來一定難度，本實(shí)驗(yàn)首先考慮的是去除凡士林而不影響檢測結(jié)果。

冰片作為一種佐劑，在燒傷、止痛去癢等皮膚疾病中應(yīng)用廣泛^［4］，屬單萜化合物，在乙醚、氯仿、石油醚等親脂性溶劑中極易溶解，與凡士林溶解性相似。因此，在樣品前處理的過程中易把冰片一并去除，故未對奇白消軟膏中冰片進(jìn)行薄層鑒別研究。

薄層鑒別中，本試驗(yàn)采用不同展開劑加以篩選優(yōu)化。在黃連的薄層鑒別中，本文比較了2020版藥典展開系統(tǒng)Ⅰ：環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）、展開系統(tǒng)Ⅱ：苯-乙酸乙酯-異濃丙醇-甲醇-濃氨（12∶6∶3∶3∶1）^［5］和自制的展開系統(tǒng)Ⅲ：正丁醇-乙醇-冰乙酸-水（4∶1∶2∶1）三種不同展開劑對色譜情況的影響，研究發(fā)現(xiàn)展開系統(tǒng)Ⅰ和Ⅲ分離良好，斑點(diǎn)分度更大，陰性無干擾，均可作為齊白消軟膏中黃連的薄層鑒別展開系統(tǒng)。

2020版中國藥典，人工牛黃中牛膽粉的鑒別使用的展開系統(tǒng)為甲苯-冰醋酸-水（7.5∶10∶0.3），趙薩茹拉^［6］在蒙藥方劑古日古木-13中的西紅花和人工牛黃的薄層色譜定性鑒別研究中，鑒別人工牛黃采用相同的展開系統(tǒng)。本試驗(yàn)嘗試比較了甲苯-冰醋酸-水（7.5∶10∶0.3）、正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）和石油醚-乙酸乙酯-甲酸（2∶10∶0.2）三種不同展開系統(tǒng)對色譜情況的影響，發(fā)現(xiàn)三種展開系統(tǒng)均可分離，在展開系統(tǒng)甲苯-冰醋酸-水（7.5∶10∶0.3）為展開劑中展開，樣品斑點(diǎn)和對照品斑點(diǎn)不在同一條直線上，原因可能是黃連的干擾。正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）中展開，斑點(diǎn)分離的好、清晰，比移值合適，優(yōu)選該系統(tǒng)作為齊白消軟膏中人工牛黃的薄層鑒別展開系統(tǒng)。

黃連中鹽酸小檗堿含量測定采用藥典方法并適當(dāng)優(yōu)化，檢測波長為345 nm；調(diào)整流動(dòng)相為乙腈：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）比例為30∶70。結(jié)果表明，樣品中各峰分離完全，鹽酸小檗堿峰形對稱，陰性無干擾，該法專屬性良好。

綜上所述，本研究所建立的方法簡便易行、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為奇白消軟膏的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步制劑開發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了藥學(xué)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2023-04-03?編輯：劉?斌）

基金項(xiàng)目：四川省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目：2020CP0031；雅安市2021年度省級轉(zhuǎn)移支付項(xiàng)目：22ZYZF0003。

作者簡介：梁林輝（1986—），男，漢族，碩士，講師、工程師，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail：llhui1986@126.com

通信作者：章斌（1986—），男，漢族，碩士，副教授，研究方向?yàn)橹兴幹苿┵|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：zhanglab@foxmail.com