澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞體外糖吸收的影響初探

王晨煒 蔡增宏 丘志龍 林燕玲 曾敏潔 李玲燕 韓丹 秦家樂 張偉云

【摘?要】?目的：探索澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞糖吸收的影響。方法：以不同濃度的澤瀉醇B處理HepG2細(xì)胞，經(jīng)CCK-8法（Cell Counting Kit-8細(xì)胞計數(shù)試劑，CCK-8），評估澤瀉醇B對細(xì)胞增殖的影響。將不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞分別采用藥物處理后，加入2-NBDG（2-［N-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑-4-氨基］-2-脫氧葡萄糖，2-NBDG）為葡萄糖熒光示蹤劑，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞熒光強度，以此評估澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞糖吸收的影響。結(jié)果：CCK-8實驗結(jié)果表明：在1～10 μmol/L范圍內(nèi)，澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞增殖的情況影響較小。糖吸收測定實驗結(jié)果表明：在模擬的條件下，澤瀉醇B表現(xiàn)出對HepG2細(xì)胞糖吸收有不同程度的促進作用。結(jié)論：初步確定澤瀉醇B可促進HepG2細(xì)胞的糖吸收，提示了澤瀉醇B可能是澤瀉降血糖的有效成分之一。

【關(guān)鍵詞】

澤瀉；澤瀉醇B；糖吸收；HepG2細(xì)胞

【中圖分類號】R285.5???【文獻標(biāo)志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2024）01-0018-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.01.zgmzmjyyzz202401005

Preliminary Study on the Effect of Alisitol B on Glucose Uptake in HepG2 Cells in vitro

WANG Chenwei1?CAI Zenghong1?QIU Zhilong1?LIN Yanling1?ZENG Minjie1

LI Lingyan1?HAN Dan1?QIN Jiale1?ZHANG Weiyun1，2*

1. Department of Pharmacy， Xiamen Medical College/Xiamen Key Laboratory of Traditional Chinese?Medicine Bioengineering， Fujian Province， Xiamen 361023，China;

2.College of Pharmacy， Fujian Medical University， Fujian Province， Fuzhou 350122， China

Abstract：Objective To investigate the effect of Alisol B on glucose absorption in HepG2 cells.Methods HepG2 cells were treated with different concentrations of AlisolB.Cell absorbance values were measured by CCK-8 method （cell Counting Kit-8 cell counting reagent， CCK-8） to evaluate the effects of Alisol B on cell proliferation.HepG2 cells cultured indifferent mediawere treated with drugs， and 2-NBDG （2-［N-7-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazo-4-amino］-2-deoxyglucose， 2-NBDG） was added as glucose fluorescent tracer， and the cell fluorescence intensity was measured by flow cytometry at a wavelength to evaluate the effect of Alisol B on glucose uptake in HepG2 cells.Results The results of CCK-8 experiments showed that in the range of 1～10 μmol/L， Alisol Bhad little effect on the value-added of HepG2 cells. The results of glucose absorption assay showed that Alisol B could promote the glucose absorption of HepG2 cells in different degrees under four simulated experimental environments.Conclusion It was preliminarily confirmed that Alisol B had a positive effect on the glucose absorption of HepG2 cells， and it was verified that Alisol B was one of the active ingredients for HepG2 cells in hypoglycemic.

Keywords：Alisma; Alisol B; Glucose Absorption; HepG2 Cells

糖尿病在中醫(yī)中被稱為“消渴病”，近年來已成為全球性公共衛(wèi)生問題，其中以2型糖尿病為主^［1］。中醫(yī)治療消渴病已有悠久的歷史，記載了許多有效的復(fù)方，澤瀉因降血糖功效在許多治療消渴的復(fù)方中都有被應(yīng)用^［2-3］。澤瀉為澤瀉科植物東方澤瀉Alismaorientale（Sam.） Juzep.或澤瀉Alisma plantag-aquatica Linn.的干燥塊莖。澤瀉性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂的功效^［4］?，F(xiàn)代藥理研究^［5-7］證實，澤瀉具有降血糖、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗炎、利尿、抗動脈粥樣硬化等藥理作用。澤瀉藥材中主要成分為萜類成分，包括三萜類、倍半萜類和二萜類，據(jù)文獻^［8-9］報道，其中三萜類化合物可能是澤瀉降血糖活性的有效成分之一，而澤瀉醇B是澤瀉三萜類中的重要化合物，在澤瀉中有較高含量^［10］。目前有研究報道澤瀉三萜單體能夠刺激3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取作用，其中包含澤瀉醇B、澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A等，其結(jié)構(gòu)均為原萜烷型四環(huán)三萜^［11-12］，但尚未有關(guān)澤瀉醇B對于HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收作用的報道，本文旨在通過建立HepG2細(xì)胞模型探索澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞體外糖吸收的影響。HepG2細(xì)胞系高度分化的肝癌細(xì)胞株，其生物學(xué)特性與正常肝細(xì)胞相近，在高水平的胰島素條件下，該細(xì)胞表面胰島素受體的數(shù)目下降程度與胰島素水平及刺激持續(xù)的時間呈正相關(guān)，且細(xì)胞能無限增殖，具有易于體外培養(yǎng)的特點，故HepG2細(xì)胞常被用于體外糖吸收的細(xì)胞模型建立^［13-14］。羅格列酮為噻唑烷二酮類降糖藥，是目前治療2型糖尿病的常用藥物之一^［15-16］。本實驗以澤瀉醇B為研究對象，以羅格列酮為陽性對照物，采用流式細(xì)胞儀測定HepG2細(xì)胞吸收2-NBDG后的熒光強度，以此觀察澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞糖吸收的影響，初步探究澤瀉醇B是否有降血糖活性的潛力。

1?儀器與材料

1.1?儀器?Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher科技有限公司生產(chǎn)；FC500分析型流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)；IC1000細(xì)胞計數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2?材料?澤瀉醇B（HPLC≥ 98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；葡萄糖熒光示蹤劑、CCK-8試劑盒、羅格列酮，均購自美國APExBIO公司；胰島素、DMEM低糖培養(yǎng)基、1×PBS緩沖液、100×青霉素-鏈霉素溶液，均購自Biosharp生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA，購自Thermo Fisher科技有限公司；葡萄糖（GC≥99.5%），購自美國西格瑪Sigma-Aldrich公司；胎牛血清，購自德國Cegrogen Biotech公司。

2?方法

2.1?HepG2細(xì)胞培養(yǎng)?取HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含1%青霉素、鏈霉素，10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，放入37 ℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2?CCK-8法細(xì)胞增殖/毒性檢測?取HepG2細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋至3×10⁴cells/mL，按每孔100 μL接種至96孔板中，在37 ℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組與待測藥物實驗組，對照組不進行藥物處理，待測藥物實驗組分成兩組分別加入100 μL1 μmol/L和100 μL10 μmol/L澤瀉醇B，1 h后，吸去藥物，加入100 μL10% CCK-8，培養(yǎng)2 h，用全波長酶標(biāo)儀在450 nm下測定各組細(xì)胞的吸光度，以對照組作為100%，進行結(jié)果的比較分析。

2.3?HepG2細(xì)胞糖吸收測定?準(zhǔn)備無血清DMEM低糖培養(yǎng)基（5.5 mmol/L）、無血清DMEM高糖培養(yǎng)基（30 mmol/L），并配置1 μmol/L胰島素，通過高糖環(huán)境模擬胰島素抵抗^［17］。以無血清DMEM低糖培養(yǎng)基模擬低糖環(huán)境；以無血清DMEM高糖培養(yǎng)基模擬高糖環(huán)境；以無血清DMEM低糖培養(yǎng)基加入1 μmol/L胰島素模擬在胰島素刺激下的低糖環(huán)境；以無血清DMEM高糖培養(yǎng)基加入1 μmol/L胰島素模擬在胰島素刺激下的高糖環(huán)境。參考文獻^［18］方法，取匯合度70%～80%的細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋成3×10⁴cells/mL，每孔2 mL接種至24孔板中，在37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白對照組、羅格列酮陽性對照組、澤瀉醇B組，空白對照組不進行藥物處理，陽性對照組分別加入1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的羅格列酮，澤瀉醇B組分別加入1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的澤瀉醇B。每個實驗組內(nèi)設(shè)置2個復(fù)孔，其中1孔額外加入10 μmol/L的2-NBDG處理細(xì)胞，另一孔不做處理，加藥結(jié)束后培養(yǎng)1 h，加入450 μLPBS轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管，用流式細(xì)胞儀在488 nm下測定1000個細(xì)胞吸光度平均值。設(shè)置空白對照組的熒光強度為100%。將未加入2-NBDG處理的細(xì)胞熒光強度作為背景值，用于扣除細(xì)胞和藥物本身的背景熒光強度。上述實驗均重復(fù)3次。

3?結(jié)果

3.1?澤瀉醇B對HepG2增殖/毒性影響?以0.1%DMSO為空白對照，1 μM澤瀉醇B細(xì)胞活力為 （99.17±0.25）%，10 μM澤瀉醇B細(xì)胞活力 （98.96±0.27）%，兩組結(jié)果均提示澤瀉醇B對細(xì)胞生長的影響較小，無顯著性差異。

3.2?不同濃度澤瀉醇B在低糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響?實驗結(jié)果表明，在低糖環(huán)境下，10 μmol/L的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收有明顯促進作用，葡萄糖吸收率增加達116%（如圖1）。

3.3?不同濃度澤瀉醇B在高糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響?實驗結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下，5 μmol/L的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收率增加達156%，其促進糖吸收活性與羅格列酮差異不大，提示了澤瀉醇B能顯著促進HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收（如圖2）。

3.4?不同濃度澤瀉醇B在胰島素刺激的低糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響?實驗結(jié)果表明，在胰島素刺激的低糖環(huán)境下，1 μmol/L和10 μmol/L的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收都產(chǎn)生促進作用，其中10 μmol/L的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收的促進作用十分顯著，葡萄糖吸收率增加達48%（如圖3）。

3.5?不同濃度澤瀉醇B在胰島素刺激的高糖環(huán)境下對HepG2糖吸收的影響?實驗結(jié)果表明，在胰島素刺激的高糖環(huán)境下，1 μmol/L和10 μmol/L的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收都表現(xiàn)出明顯的促進作用，前者葡萄糖吸收率增加達23%，后者葡萄糖吸收率增加達31%，兩組表現(xiàn)出的促進糖吸收活性效果都與羅格列酮相近（如圖4）。

4?討論

羅格列酮是用于治療2型糖尿病的西藥^［17］，有相關(guān)文獻^［19］指出長期使用羅格列酮會使患者出現(xiàn)心衰、肝功能損傷等副作用，而使用中藥治療糖尿病及其并發(fā)癥不僅能標(biāo)本兼治，藥效明顯，且無明顯不良反應(yīng)^［20］。因此探究中藥有效降血糖活性成分對臨床上治療糖尿病有十分重大的意義。

實驗采用澤瀉醇B為實驗對象，以羅格列酮為陽性藥物，探究澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞糖吸收的影響。實驗結(jié)果顯示在模擬的低糖環(huán)境下10 μmol/L、高糖環(huán)境下5 μmol/L、胰島素刺激的低糖環(huán)境下10 μmol/L、胰島素刺激的高糖環(huán)境下1 μmol/L用量的澤瀉醇B均展示出了與羅格列酮相近的促進葡萄糖吸收的活性，初步提示澤瀉醇B可能為澤瀉降血糖的有效化學(xué)成分之一。因本實驗僅用細(xì)胞模型初步探究了澤瀉醇B促進葡萄糖吸收的活性，今后可進一步采用小鼠模型^［21］開展實驗，研究澤瀉醇B是否具有降血糖活性并深入探究其作用機制。另外，本實驗結(jié)果顯示羅格列酮在有無胰島素條件下對糖吸收的影響沒有顯著差異，其具體原因及作用機制尚需深入研究。

實驗結(jié)果表明在模擬的4種環(huán)境下，不同濃度的澤瀉醇B對HepG2細(xì)胞的糖吸收均有促進作用，提示澤瀉醇B可能為澤瀉降血糖的有效成分之一。該結(jié)果為研究澤瀉降血糖物質(zhì)基礎(chǔ)提供了數(shù)據(jù)參考，為后續(xù)研發(fā)澤瀉相關(guān)藥物降低血糖、治療糖尿病提供了初步依據(jù)。

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（收稿日期：2023-04-04?編輯：劉?斌）

基金項目：福建省衛(wèi)健委醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題（2019-CXB-26）；廈門市醫(yī)療衛(wèi)生指導(dǎo)性項目（3502Z20224ZD1309）；廈門醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（X202212631016，X202212631025）；廈門醫(yī)學(xué)院校級一流課程項目（XBJK2021027）；廈門醫(yī)學(xué)院教育教學(xué)改革研究項目-金課建設(shè)培育計劃（XBJK2019013）。

作者簡介：王晨煒（2000—），男，漢族，本科，研究方向為中藥活性成分及其作用機理。E-mail： 596950705@qq.com

通信作者：張偉云（1980—），女，漢族，博士，教授、碩士生導(dǎo)師，研究方向為藥物分析、中藥活性成分及其作用機理。E-mail： zhangwy@xmu.edu.cn