高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定面粉中7種非法添加劑

王穎怡?吳玉田?鄒璐?孟春楊?鐘雪?周貽兵

摘 要：目的：建立一種分析面粉中7種非法添加劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。方法：試樣經(jīng)乙腈∶水（1∶1，V∶V）提取、超聲、離心、氮吹濃縮后，經(jīng)Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱分離、0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨水和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分析。結(jié)果：7種目標(biāo)化合物在0.10～8.00 ng·mL-1呈良好的線性關(guān)系（R2＞0.990），檢出限為0.03～0.15 mg·kg-1，定量限為0.10～0.45 mg·kg-1；回收率在88.6%～104.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～5.8%（n=6）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可滿足小麥粉中7種非法添加物的同時(shí)檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；小麥粉；非法添加劑；噻苯咪唑；苯甲羥肟酸

Simultaneous Determination of 7 Illegal Additives in Flour by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Abstract： Objective： To establish a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of 7 illegal additives in flour. Method： The samples were extracted by acetonitrile∶water （1∶1，V∶V）， concentrated by ultrasound， centrifugation and nitrogen blowing， separated by Agilent Eclipse Plus C18 RRHD column， and then eluted with 0.1% formic acid -5 mmol·L-1 ammonium formate water and methanol as mobile phase， and analyzed by multi-reaction monitoring mode. Result： There was a good linear relationship （R2＞0.990） between 0.10～8.00 ng·mL-1 for the 7 target compounds. The limit of detection was 0.03～0.15 mg·kg-1， and the limit of quantification was 0.10～0.45 mg·kg-1. The recoveries were 88.6% ～104.3%， and the relative standard deviations were 2.1%～5.8%（n=6）. Conclusion： The method is simple， sensitive and accurate， and can satisfy the simultaneous detection of 7 illegal additives in wheat flour.

Keywords： high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; wheat flour; illegal additives; thiobenzimidazole; benzohydroxamic acid

國(guó)內(nèi)三大糧食作物之一的小麥?zhǔn)莾H次于稻谷的第二大糧食作物，其含有大量碳水化合物和蛋白質(zhì)，小麥粉（面粉）是其主要加工產(chǎn)品。國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的資料表明，伴隨著國(guó)內(nèi)小麥出產(chǎn)量的不斷增加，面粉的產(chǎn)量與消費(fèi)量也在不斷增加，但其安全性與品質(zhì)也曾出現(xiàn)過嚴(yán)重的問題[1]。隨著經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)與生活水平的提升，市場(chǎng)對(duì)面粉類產(chǎn)品的品質(zhì)有著越來越嚴(yán)苛的標(biāo)準(zhǔn)[2]。部分生產(chǎn)者為了追求最大利益，利用化學(xué)制劑提高面粉質(zhì)量，掩蓋其存在的質(zhì)量問題，如使用硫脲作為增白劑、曲酸作為保鮮劑，以及使用噻二唑作為抗生素等非食品原料。此外，如果貯存環(huán)境或條件達(dá)不到國(guó)家規(guī)定的要求，小麥在貯藏期間易發(fā)霉變質(zhì)，或者受到昆蟲與老鼠啃食，從而造成面粉污染。目前，不法商家為了避免小麥粉出現(xiàn)醒發(fā)、復(fù)色和黑點(diǎn)，向其中非法添入了苯甲羥肟酸以及三聚硫氰酸三鈉鹽成分，最終使產(chǎn)品達(dá)到出廠標(biāo)準(zhǔn)。上述行為不僅給消費(fèi)者的身體健康帶來很大危害，還會(huì)對(duì)食品安全產(chǎn)生影響。原國(guó)家食藥監(jiān)管總局2017年公布的《總局關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告》的第4條內(nèi)容針對(duì)企業(yè)的生產(chǎn)過程明確規(guī)定，嚴(yán)格禁止將非食品原材料添入面粉中，如過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過硫酸鹽、噻二唑和曲酸等[3]。因此，在使用添加劑時(shí)，需堅(jiān)持“安全、合理、有限、有效”的原則，嚴(yán)格執(zhí)行國(guó)家相關(guān)規(guī)定。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)與國(guó)際上針對(duì)上述非法添加劑主要采用高效液相色譜法[4]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、近紅外光譜法[7]和電化學(xué)方法[8-9]等多種檢測(cè)手段。申科敏等[4]通過HPLC法測(cè)定小麥粉中的曲酸、噻二唑、硫脲等化學(xué)成分；國(guó)振等[10]建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定小麥粉及面粉處理劑中的4種違法添加劑的方法，以上兩種方法的檢出限均偏高；林芳[6]以純水溶液為提取劑，超聲提取，建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定面粉中曲酸和噻二唑，雖然HPLC-MS/MS填補(bǔ)了曲酸和噻二唑檢測(cè)方法的空白，但在實(shí)際樣本篩查中需要進(jìn)一步完善。除此之外，同時(shí)測(cè)定食品中噻苯咪唑和四環(huán)素等成分含量的報(bào)道仍然較少。因此，本研究采用HPLC-MS/MS篩查確認(rèn)樣品中的硫脲、曲酸、噻苯咪唑、噻二唑、四環(huán)素、苯甲羥肟酸和三聚硫氰酸三鈉鹽7種化合物，通過含量檢測(cè)分析，了解市售小麥粉非法添加劑的污染水平，為食品安全監(jiān)管提供有效手段和技術(shù)支持，全面保障小麥粉的安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為2022年貴陽(yáng)市市售小麥粉樣品。

噻二唑（純度＞99.6%），北京振翔科技有限公司；四環(huán)素（純度＞95.5%）、三聚硫氰酸三鈉鹽（純度＞98.3%）、硫脲（純度＞99.2%）、苯甲基羥肟酸（純度＞99.9%）、曲酸（純度＞98.3%）和噻苯咪唑（純度＞99.9%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈和甲醇，美國(guó)飛世爾試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6470三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；Agilent 1290超高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Milli-Q超純水設(shè)備，美國(guó)Merck；3-30KS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma；MS3漩渦混勻設(shè)備，德國(guó)IKA；T460 H超聲波清洗設(shè)備，北京博勱行儀器。

1.3 前處理方法

稱取均質(zhì)試樣5 g，于已備好的50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL水渦旋混勻后加入5 mL乙腈，漩渦混合30 s，超聲提取20 min，10 000 r·min-1離心10 min后（處理溫度小于5 ℃），移取1 mL上清液于離心管中，氮吹至近干即可。加入流動(dòng)相

1 mL，經(jīng)過渦旋混合均勻后，經(jīng)0.22 ?m有機(jī)微孔濾膜過濾，待上機(jī)。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨水溶液，B為甲醇溶液，A+B=74+26；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；等度洗脫。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源模式：電噴霧離子源（ESI）；正模式噴霧電壓：3 000 V；負(fù)模式噴霧電壓：2 500 V；鞘氣溫度：250 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；噴霧器：35 psi；鞘氣流速：11 L·min-1；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM模式。化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜及色譜條件的優(yōu)化

化合物中的吸電子基團(tuán)具有高度親電性，能夠吸引周圍電子，從而使H+易于生成[M+H]+類型的離子峰。例如，硫脲、噻苯咪唑結(jié)構(gòu)中硫原子和氮原子上的孤對(duì)電子使得硫脲分子具有親電性，而苯甲羥肟酸、曲酸及四環(huán)素結(jié)構(gòu)中含有酰胺、羰基等極性官能團(tuán)，具有中等親電性。所以，上述化合物都采用了電噴霧離子正離子模式。由于噻二唑及三聚硫氰酸三鈉鹽具有雜環(huán)結(jié)構(gòu)，電子云密度分布不均勻，使其容易丟失H+，從而產(chǎn)生[M-H]-型離子峰。因此，試驗(yàn)擬采用電噴霧離子負(fù)離子模式。分別配制濃度均為500 ng·mL-1的7種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在ESI+和ESI-模式下對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行全掃描，通過對(duì)準(zhǔn)分子離子的信號(hào)響應(yīng)進(jìn)行篩選，改善碎裂電壓和碰撞能量，獲得最佳的母離子豐度。在此基礎(chǔ)上，通過二級(jí)質(zhì)譜掃描，篩選出兩個(gè)具有代表性的碎片離子，并對(duì)碰撞電壓進(jìn)行改善，將豐度較高的子離子選擇為定量離子。

在優(yōu)化色譜條件中，探究不同流動(dòng)相（甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、0.1%甲酸水-乙腈溶液、0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨水-甲醇溶液）對(duì)7種目標(biāo)檢測(cè)物的分離情況。結(jié)果表明，使用甲醇-水溶液、乙腈-水溶液時(shí)，四環(huán)素峰發(fā)生峰拖尾現(xiàn)象；當(dāng)流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈溶液時(shí)，硫脲、三聚硫氰酸三鈉鹽的色譜峰形態(tài)發(fā)生分叉。因此，為改善峰形及分離度，試驗(yàn)最終選擇0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨水-甲醇溶液作為流動(dòng)相，采用Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（3.0 mm×150 mm）色譜柱，在等度洗脫方式下7種檢測(cè)物分離效果良好。

2.2 提取條件的優(yōu)化

鑒于硫脲、曲酸和苯甲羥肟酸的強(qiáng)極性，分別研究了水、甲醇、甲醇-水（1∶1，V∶V）、乙腈以及乙腈-水（1∶1，V∶V）對(duì)化合物提取率的影響。結(jié)果表明，以水為溶劑進(jìn)行提取試驗(yàn)時(shí)，其提取強(qiáng)極性成分的效果最好，而對(duì)極性比較弱的噻二唑和噻苯咪唑則反之；而甲醇作為提取液時(shí)，曲酸及硫脲會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)，如果利用甲醇-水（1∶1，V∶V）為溶劑進(jìn)行提取，樣品溶液渾濁且呈凝膠狀，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；采用純乙腈溶液進(jìn)行提取時(shí)，化合物的極性越大，提取率越低。相反極性相對(duì)較低的化合物如苯甲羥肟酸、噻二唑、噻苯咪唑等，其提取率均有所增加。綜上，本研究選擇水-乙腈（1∶1，V∶V）作為提取溶劑，確保色譜峰峰形的正常。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在液質(zhì)分析中，食品樣品中的內(nèi)源性成分及樣品前處理過程中的外源性成分會(huì)影響目標(biāo)物的離子化效率，從而導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生，常表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制。在此基礎(chǔ)上，使用提取后的空白樣品溶液進(jìn)行加標(biāo)，可評(píng)價(jià)化合物的基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME），依據(jù)基質(zhì)效應(yīng)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行評(píng)估，即ME=Y/X×100%。其中，Y為空白樣品基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的響應(yīng)均值，X為純?nèi)軇┲刑砑拥攘繕?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的響應(yīng)均值[11-12]。結(jié)果表明，噻二唑、四環(huán)素、三聚硫氰酸三鈉鹽、硫脲、苯甲羥肟酸、曲酸和噻苯咪唑這7種目標(biāo)分析物表現(xiàn)出較弱的基質(zhì)效應(yīng)并在可接受范圍，其結(jié)果分別為87%、110%、83%、91%、96%、105%和102%。為減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量分析的干擾，本文的定量方法使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

2.4 線性范圍、檢出限、定量限

根據(jù)1.3樣品前處理步驟，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法，將7種違禁添加劑配制為一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，于最佳色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過在空白基質(zhì)中添加低質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按以上方法進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)響應(yīng)值3倍和10倍的信噪比計(jì)算檢出限和定量限。由表2可知，7個(gè)目標(biāo)物均存在很好的線性關(guān)系（R2＞0.99）。

2.5 準(zhǔn)確度及精密度

采用3種濃度水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)平行組測(cè)6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。由表3可知，目標(biāo)化合物在不同濃度水平下的平均回收率在88.6%～104.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～5.8%，該方法的重復(fù)性良好，可滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

隨機(jī)抽取市售包裝小麥粉樣品5批次、散裝小麥粉5批次，經(jīng)樣品前處理后使用上述方法進(jìn)行檢測(cè)。由表4可知，1批次小麥粉樣品檢測(cè)到苯甲羥肟酸殘留。《小麥粉》（GB/T 1355—2021）中規(guī)定，除了小麥與水之外，不得加入其他的輔料（如淀粉）以及食品添加劑（如酶制劑、增稠劑、乳化劑、還原劑等）。而實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果反映出在小麥粉生產(chǎn)加工、儲(chǔ)存、出售等過程中，或存在非法添加現(xiàn)象，因此需要對(duì)小麥粉進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)管。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定小麥粉樣品中7種非法添加劑的方法。結(jié)果表明，目標(biāo)分析物在0.10～8.00 ng·mL-1具有良好的線性關(guān)系，其中噻苯咪唑、噻二唑、三聚硫氰酸三鈉鹽、曲酸、四環(huán)素的檢出限為0.15 mg·kg-1，定量限為0.45 mg·kg-1；硫脲及苯甲羥肟酸的檢出限為0.03 mg·kg-1，定量限為0.10 mg·kg-1。在不同加標(biāo)濃度下，加標(biāo)回收率在88.6%～104.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～5.8%，該方法的靈敏度及精密度良好，可滿足對(duì)大量和多樣化面粉中7種違禁添加劑快速篩查的需要，提高了檢驗(yàn)工作的工作效率，同時(shí)能為制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)及監(jiān)管機(jī)構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供一定參考。

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