五個(gè)煙草野火菌株的生理小種鑒定

于爽，于洋,，喬嬋，楊鵬九，劉琳，潘洪杏，崔曉，劉德育，孫劍萍，萬(wàn)秀清，郭兆奎，李若*

1 牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，牡丹江市愛(ài)民區(qū)文化街191號(hào) 157011；2 黑龍江省公司煙草科學(xué)研究所，哈爾濱市哈藥路17號(hào) 150076；3 中國(guó)煙草總公司黑龍江省公司科技處，哈爾濱市地段街173號(hào) 150010

煙草野火?。═obacco Wildfire）是危害煙葉生產(chǎn)的主要細(xì)菌性病害之一。我國(guó)自上世紀(jì)四十年代有報(bào)道記錄以來(lái)，野火病已在國(guó)內(nèi)所有煙區(qū)發(fā)生并逐步上升為主要病害之一[1]。野火病在煙草整個(gè)生育期均可發(fā)生，病菌侵染初始產(chǎn)生褐色水漬樣小圓點(diǎn)，周?chē)粚挼膱A形黃色暈圈環(huán)繞。該黃色暈圈是病菌產(chǎn)生的野火毒素所致，此為野火病區(qū)別于煙草角斑?。ˋngular Leafspot of Tabacco）的主要特征。遇到陰雨連綿的適宜氣候條件，野火病斑迅速擴(kuò)大融合，對(duì)煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量常造成重大損失。

野火病致病菌為野火菌（Pseudomonas syringaepv. tabaci，Pta），為丁香假單胞桿菌屬煙草致病變種。除侵染煙草外，人工接種還能侵染大豆、菜豆、番茄、辣椒、馬鈴薯、黃瓜、龍葵等植物。迄今為止，以長(zhǎng)花煙和黃花煙為抗性鑒定宿主，野火菌至少存在4個(gè)生理小種，即0、1、2和3號(hào)生理小種[2-4]。其中，既不能侵染長(zhǎng)花煙也不能侵染黃花煙但能侵染（不含任何抗野火基因的）普通栽培煙草的野火菌株歸為0號(hào)小種；能侵染長(zhǎng)花煙但不能侵染黃花煙的歸為1號(hào)小種；能侵染包括長(zhǎng)花煙、黃花煙等抗病煙草在內(nèi)的所有已知煙草的歸為2號(hào)小種；能侵染黃花煙但不能侵染長(zhǎng)花煙的歸為3號(hào)小種。

國(guó)際上，1955 年Heggestad等育成第一個(gè)抗野火菌0號(hào)小種的栽培品種 Burley21[5]。之后，Stavely和Skoog將黃花煙N. rustica pumila的0和1號(hào)野火菌小種抗性導(dǎo)入普通煙草[6]。雖然2號(hào)小種能克服已知所有煙草的野火病抗性，但煙草育種人員將長(zhǎng)花煙和黃花煙來(lái)源的抗性聚合起來(lái)育成的品種則能減輕2號(hào)小種所產(chǎn)生病癥的嚴(yán)重程度[4]。目前，國(guó)內(nèi)烤煙主栽品種均感野火病，不排除有個(gè)別中等抗性栽培品種，但也主要是水平抗性，未明確報(bào)道有長(zhǎng)花煙或黃花煙垂直抗性來(lái)源。國(guó)內(nèi)煙草植保、育種人員前期主要以生理生化試驗(yàn)來(lái)鑒別野火菌[7]，以各煙區(qū)主栽品種作為鑒別宿主對(duì)野火菌進(jìn)行生理小種劃分，在抗野火病抗性遺傳規(guī)律方面?zhèn)戎剌^少[8-9]。本研究首次在國(guó)內(nèi)開(kāi)展了基于抗病遺傳規(guī)律的煙草野火菌生理小種鑒定，為今后加快培育垂直抗性的抗野火病煙草和克隆煙草特異抗0號(hào)和1號(hào)小種抗病基因提供了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草材料黃花煙（寧安）（下文簡(jiǎn)稱(chēng)黃花煙）、長(zhǎng)花煙、KRK26、Burley 21（B21）、Ky14、龍江911（LJ911）和Kutsaga E1（KE1）種子由黑龍江省煙草科學(xué)研究所高新技術(shù)室保存。其中，黃花煙為晾曬煙栽培種，KRK26為津巴布韋烤煙普通栽培品種（雄性不育雜交種），黃花煙和KRK26抗野火菌0和1號(hào)小種，KRK26抗性來(lái)源于黃花煙。長(zhǎng)花煙為煙草野生種，B21為白肋煙普通栽培品種，長(zhǎng)花煙和B21抗野火菌0號(hào)小種，B21抗性來(lái)源于長(zhǎng)花煙。LJ911為黑龍江省自育主栽烤煙品種，KE1為津巴布韋烤煙普通栽培品種，LJ911和KE1均感野火菌各小種，作為感病對(duì)照品種。Ky14為白肋煙普通栽培品種，抗0號(hào)小種[10]。各煙草材料相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所用煙草材料Tab. 1 Tobacco materials used in tests

煙草野火菌ATCC11528訂購(gòu)自美國(guó)ATCC機(jī)構(gòu)，作為0號(hào)小種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照[11]。野火菌株ZD、M109、D151和W11分別采集自黑龍江省肇東市、穆棱市、東寧市和寧安市。采集的菌株經(jīng)涂板—挑選單克隆—菌落PCR鑒定等多輪循環(huán)純化至無(wú)雜菌[12]。煙草角斑菌217為黑龍江省煙草科學(xué)研究所高新技術(shù)室保存，作為菌種鑒定對(duì)照菌株。

1.2 方法

試驗(yàn)采用黃花煙、長(zhǎng)花煙等晾曬煙栽培種、野生種，以及B21、Ky14等白肋煙栽培種等開(kāi)展接種試驗(yàn)，煙草材料的異質(zhì)性會(huì)使試驗(yàn)結(jié)果均一性不高；又由于抗野火病煙草材料在接種高濃度、大劑量野火菌時(shí)因超敏反應(yīng)（Hypersensitive Response，HR反應(yīng)）產(chǎn)生的壞死斑與感病煙草上的野火病斑難于區(qū)分。本研究在田間及溫室分別設(shè)計(jì)了1個(gè)和3個(gè)接種試驗(yàn)，力圖采用具有不同優(yōu)點(diǎn)的多個(gè)試驗(yàn)來(lái)交叉驗(yàn)證野火菌的生理小種分類(lèi)。

1.2.1 野火菌的PCR鑒定

以煙草角斑菌217為陰性對(duì)照，以野火菌ATCC11528為陽(yáng)性對(duì)照，參照張萌等[12]方法對(duì)收集的野火菌株進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，具體方法如下。取各野火菌株菌液10 μL，12000 r/min離心2 min，移去上清液后，菌體沉淀作為PCR擴(kuò)增模板。煙草野火菌特異性鑒定PCR引物序列如下：上游引物：tabB1F：5’-ATTGAAGAAGCGTTCGAGCG-3’；下游引物：tabB1R：5’-GTTTCGGGTCGGCACGATTG-3’，擴(kuò)增片段大小為709 bp。PCR反應(yīng)體系加入Premix Ex Taq Hot Start Version 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1μL，用雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體系至10 μL并混勻。PCR反應(yīng)條件為，95℃ 5 min；95℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，33個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 野火菌田間生理鑒定

2020年在黑龍江省煙草科學(xué)研究所賓西實(shí)驗(yàn)場(chǎng)大田種植了黃花煙、KRK26、長(zhǎng)花煙、B21、Ky14、LJ911和KE1等7個(gè)煙草材料，每個(gè)材料種植20壟，每壟12株，株距0.5 m，行距1.15 m。對(duì)7個(gè)煙草材料接種了ATCC11528、ZD、D151、M109和W11等5個(gè)野火菌株。取出-80℃保存的野火菌株，在超凈工作臺(tái)中將野火菌液加入到500 mL LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，28℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。接種前用蒸餾水稀釋至5 L，并加入表面活性劑Silwet L-77至終濃度0.01%。待煙草長(zhǎng)至團(tuán)棵期，用噴壺對(duì)田間煙草進(jìn)行噴霧接種，每菌種接種2壟各煙草材料。兩周后拍攝記錄各煙草材料的病理表現(xiàn)，兩周后葉片上出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)且圍繞寬的黃色暈圈的典型煙草野火病癥狀的即判定為感病。試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.3 煙草對(duì)野火菌接種濃度的病理反應(yīng)

參照Knoche等[11]的試驗(yàn)方法在溫室中進(jìn)行野火菌接種濃度梯度試驗(yàn)，具體方法如下。將ATCC11528等5個(gè)野火菌株用LB液體培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，搖起的菌液5000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS溶液重懸洗滌，再次離心沉淀，并用PBS溶液重懸，配制成濃度為0.1 OD（約108CFU/mL）的懸液。以此濃度為起始濃度，用PBS溶液依次5倍稀釋?zhuān)瞥?2個(gè)濃度梯度。用1 mL規(guī)格注射器針頭在葉片上穿刺，在小孔處用一手按住葉片上表面，從葉片下表面注射入菌液。待煙草長(zhǎng)至團(tuán)棵期，將5個(gè)野火菌株12個(gè)濃度的菌液注射到黃花煙、KRK26、長(zhǎng)花煙、B21、LJ911和KE1等6種煙草材料上。其中每個(gè)菌株接種每個(gè)煙草材料的4株煙，每株煙接種頂部完全展開(kāi)的2片葉，每片葉片上接種6個(gè)濃度的菌液，各濃度的接種位置隨機(jī)。接種后1～10 d，每天觀(guān)察記錄葉片上出現(xiàn)的病斑數(shù)量。試驗(yàn)重復(fù)2次。設(shè)定每個(gè)菌株菌液的最低一個(gè)濃度為基準(zhǔn)C0，以菌液濃度的對(duì)數(shù)值（以5為底，起始濃度為0對(duì)應(yīng)實(shí)際濃度為C0）為橫坐標(biāo)、以時(shí)間（天數(shù)）為縱坐標(biāo)，繪制不同煙草接種了不同菌株、不同濃度野火菌液后最早出現(xiàn)的病理反應(yīng)時(shí)間與野火菌濃度的關(guān)系圖。

1.2.4 基于病斑大小的野火菌定量評(píng)價(jià)

參照Cole等[4]的試驗(yàn)方法，稍作改動(dòng)，在溫室中進(jìn)行野火菌無(wú)損傷接種試驗(yàn)，具體方法如下。ATCC11528等5個(gè)野火菌株28℃在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，用PBS溶液洗滌后再用PBS溶液制備成濃度為106CFU/mL濃度的菌液，作為接種液備用。打開(kāi)與噴槍?zhuān)℉ansa Aero-pro 251，0.2 mm nozzle）連接的真空泵，向噴槍液體槽中加入菌液。在葉片下表面，噴槍噴嘴距葉面1 cm左右，噴射葉面，菌液在葉片內(nèi)擴(kuò)展達(dá)到直徑約0.5 cm大小。待煙草長(zhǎng)至團(tuán)棵期，把5個(gè)野火菌株接種到黃花煙等6個(gè)煙草材料上。每菌種接種各煙草的2株煙，每株煙接種頂部完全展開(kāi)的2片葉，每片葉接種4個(gè)點(diǎn)，在葉片上的接種位置隨機(jī)。接種10 d后，測(cè)量病斑直徑（測(cè)病斑兩條互相垂直的直徑，最終使用兩條直徑長(zhǎng)度相乘再開(kāi)平方值）。試驗(yàn)重復(fù)2次。用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 同一片葉上的對(duì)比試驗(yàn)

五個(gè)野火菌株接種液的制備同上節(jié)（接種液濃度為106CFU/mL），野火菌接種操作同1.2.3節(jié)（針刺結(jié)合無(wú)針頭注射）。待煙草長(zhǎng)至團(tuán)棵期，在溫室中將ATCC11528等5個(gè)野火菌株接種到黃花煙等6個(gè)煙草材料上，每個(gè)煙草材料接種2株煙，每株煙接種頂部完全展開(kāi)的2片葉，每片葉上接種5個(gè)菌株。接種10 d后，拍攝記錄各煙草材料的病理反應(yīng)。試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 野火菌的PCR鑒定

如圖1所示，對(duì)收集的野火菌株進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)檢測(cè)靶標(biāo)為煙草野火菌特有的野火毒素合成基因tabB基因，因?yàn)闊煵萁前呔≒seudomonas syringaepv. angulata，P. S. angulata）不能產(chǎn)生野火毒素，故用其作為陰性對(duì)照。如圖所示，包括陽(yáng)性對(duì)照野火菌株ATCC11528在內(nèi)的所有檢測(cè)野火菌株均能擴(kuò)增出與預(yù)設(shè)片段大小709 bp一致的單一條帶。這表明所收集的菌株均為野火菌，這些菌株可用于后續(xù)接種試驗(yàn)。

圖1 PCR鑒定野火菌Fig. 1 Identification of Pta using PCR

2.2 野火菌田間生理鑒定

表2總結(jié)了田間5個(gè)野火菌株在7種不同野火病抗性煙草上的病理反應(yīng)，圖2展示了大田野火菌接種試驗(yàn)的代表性圖片（未展示陰性結(jié)果）。如表2和圖2所示，所有5個(gè)野火菌株均能侵染感病對(duì)照煙草LJ911和KE1，2周后均能在它們的葉片上產(chǎn)生典型的野火病癥即點(diǎn)狀壞死斑且周?chē)h(huán)繞寬的黃色暈圈（如圖2“LJ911-D151”和“KE1-D151”兩小圖所示）。這表明整個(gè)試驗(yàn)系統(tǒng)正常。野火菌D151能感染感病煙草LJ911和KE1，但既不能使長(zhǎng)花煙抗性來(lái)源的B21感病，也不能使黃花煙和黃花煙抗性來(lái)源的KRK26感病，這表明D151屬于0號(hào)小種。ZD和M109既能感染感病野草，也能在B21上產(chǎn)生病斑（如圖2“B21-ZD”和“B21-M109”），但不能感染黃花煙和KRK26，因此將野火菌ZD和M109歸為1號(hào)小種。ATCC11528和W11既能感染感病野草，也能感染黃花煙和KRK26（如圖2“NR-W11”、“NR-11528”、“KRK26-W11”和“KRK26-11528”），因此把野火菌ATCC11528和W11歸為3號(hào)小種。這里，野火菌W11在黃花煙葉片上產(chǎn)生的野火病斑發(fā)生合并、蔓延，表明其具有比ATCC11528更強(qiáng)的侵染黃花煙的能力。另外，ATCC11528原本是作為0號(hào)小種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照從美國(guó)引進(jìn)，但在本試驗(yàn)中卻被判定為3號(hào)小種，與先前其他研究人員結(jié)果不一致[11]，而且后面的幾個(gè)試驗(yàn)結(jié)果也把ATCC11528歸為3號(hào)小種，具體結(jié)果詳見(jiàn)下文。

圖2 野火菌大田接種試驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Result of Field trial of Pta inoculation

表2 野火菌大田接種試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 Result of field trial of Pta inoculation

2.3 煙草對(duì)野火菌接種濃度的病理反應(yīng)

參照Knoche等[11]的試驗(yàn)方法，在溫室中進(jìn)行的野火菌接種濃度梯度試驗(yàn)可以反應(yīng)不同野火病抗性的煙草當(dāng)接種不同濃度、不同小種野火菌株時(shí)所產(chǎn)生病理反應(yīng)的差別。圖3展示了5個(gè)野火菌株在6個(gè)煙草材料上不同接種菌液濃度與發(fā)生病理反應(yīng)時(shí)間（壞死斑）之間的關(guān)系。菌液濃度由100～108CFU/mL的12個(gè)梯度組成（對(duì)應(yīng)關(guān)系圖中的菌液濃度對(duì)數(shù)值0，1，2，…，11），病害調(diào)查時(shí)間為10 d。每個(gè)野火菌-病理反應(yīng)時(shí)間組合用4株煙，關(guān)系圖中顯示的數(shù)據(jù)點(diǎn)為首次出現(xiàn)病理反應(yīng)的最低濃度梯度（1個(gè)以上濃度梯度同一天出現(xiàn)壞死斑，只顯示最低濃度梯度數(shù)據(jù)），對(duì)應(yīng)的病理反應(yīng)時(shí)間為4株煙的均值（平均反應(yīng)時(shí)間）。

圖3 野火菌接種濃度與煙草病理反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系圖Fig. 3 Relationship of Pta inoculation concentration and pathological response time of tobacco plants

如圖4黃花煙和KRK26小圖，野火菌株ZD、D151、M109在菌液濃度對(duì)數(shù)值4（約103CFU/mL）以下的低濃度梯度時(shí)，接種黃花煙和KRK26不能使其感病，說(shuō)明三者歸類(lèi)為0號(hào)或1號(hào)生理小種。野火菌株ATCC11528和W11在低菌液濃度時(shí)仍可使黃花煙和KRK26感病，說(shuō)明二者歸類(lèi)為2號(hào)或3號(hào)生理小種。如圖4長(zhǎng)花煙和B21小圖，野火菌株ATCC11528、D151、W11在菌液濃度對(duì)數(shù)值4以下的低濃度梯度時(shí)（對(duì)于長(zhǎng)花煙濃度對(duì)數(shù)值則相應(yīng)為8，約106CFU/mL），接種長(zhǎng)花煙和B21不能使其感病，說(shuō)明三者歸類(lèi)為0號(hào)或3號(hào)生理小種。野火菌株ZD和M109在低菌液濃度時(shí)仍可使長(zhǎng)花煙和B21感病，說(shuō)明二者歸類(lèi)為1號(hào)或2號(hào)生理小種。如圖4 LJ911和KE1小圖，5個(gè)野火菌株在所有濃度梯度均能感染兩種感病對(duì)照煙草。

綜上所述，依據(jù)各野火菌株在抗性鑒別宿主上的病理表現(xiàn)，將D151歸類(lèi)為0號(hào)生理小種，ZD和M109為1號(hào)生理小種，ATCC11528和W11為3號(hào)生理小種。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各煙草材料展現(xiàn)了不同抗性水平。其中，長(zhǎng)花煙對(duì)野火菌0號(hào)小種D151和3號(hào)小種ATCC11528和W11展現(xiàn)了強(qiáng)的抑制作用，表現(xiàn)為3個(gè)野火菌株在高濃度梯度106CFU/mL（相當(dāng)于對(duì)數(shù)濃度值8）以下時(shí)，已不能出現(xiàn)任何癥狀。B21的0號(hào)小種抗性來(lái)自長(zhǎng)花煙，但其抗性弱于長(zhǎng)花煙，表現(xiàn)在3個(gè)野火菌株在達(dá)到濃度梯度103CFU/mL（相當(dāng)于對(duì)數(shù)濃度值4）以下時(shí)，才不表現(xiàn)病理癥狀。其中，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃花煙和KRK26表現(xiàn)出的對(duì)野火菌0號(hào)小種D151的抗性弱于長(zhǎng)花煙，它們的抗性水平略高于B21。

2.4 基于病斑大小的野火菌定量評(píng)價(jià)

圖4統(tǒng)計(jì)了5個(gè)野火菌株接種在6個(gè)煙草材料上所產(chǎn)生病斑的大小。野火菌D151在黃花煙和KRK26上產(chǎn)生小病斑（<0.2 cm2），在長(zhǎng)花煙和B21上則不產(chǎn)生病斑或小病斑，說(shuō)明D151屬于0號(hào)小種。ZD和M109在黃花煙和KRK26上產(chǎn)生小病斑，在長(zhǎng)花煙和B21上誘發(fā)大病斑，說(shuō)明二者歸類(lèi)為1號(hào)小種。野火菌ATCC11528和W11在黃花煙和KRK26上誘發(fā)大病斑，在長(zhǎng)花煙和B21上則不產(chǎn)生病斑或小病斑，說(shuō)明二者屬于3號(hào)生理小種。試驗(yàn)中ATCC11528仍表現(xiàn)出對(duì)黃花煙和KRK26強(qiáng)的侵染性。

圖4 野火菌無(wú)損傷接種試驗(yàn)結(jié)果Fig. 4 Result of non-invasive inoculation of Ptas

M109表現(xiàn)出對(duì)黃花煙和KRK26的侵染，這使它類(lèi)于能侵染目前所有已知抗性煙草的2號(hào)小種。另外，W11雖未在長(zhǎng)花煙上產(chǎn)生病斑，但在同一抗源的B21上產(chǎn)生較大病斑。綜合這些結(jié)果，參考上節(jié)濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果，原因是不同抗性材料抗性水品不同，而本試驗(yàn)所用的接種濃度（106CFU/mL）偏高，也即對(duì)于長(zhǎng)花煙這樣抗性強(qiáng)的煙草采用此濃度適合，將此接種濃度用在黃花煙、KRK26和B21上則偏高。

2.5 同一片葉上的對(duì)比試驗(yàn)

如圖5，把5個(gè)相同濃度（106CFU/mL）的野火菌株接種到6個(gè)煙草材料的同一葉片上，對(duì)比不同野火菌株在同一煙草材料上的病理反應(yīng)。在黃花煙上，5個(gè)菌株均造成了病斑，但ZD、D151和M109的病斑僅局限于接種區(qū)域內(nèi)，而W11和ATCC11528的病斑則突破接種區(qū)域并蔓延擴(kuò)大；在KRK26上，5個(gè)菌株均造成病斑，但W11產(chǎn)生的病斑則發(fā)生明顯蔓延擴(kuò)大。這表明，野火菌W11和ATCC11528能克服黃花煙類(lèi)抗源抗性，而ZD、D151和M109不能（盡管它們也造成病斑，可能是由接種濃度偏高造成，但壞死斑不發(fā)生擴(kuò)散）。在長(zhǎng)花煙和B21上，ATCC11528、D151和W11沒(méi)有產(chǎn)生病斑（3個(gè)菌株在B21上只在接種部位產(chǎn)生褪綠現(xiàn)象），說(shuō)明三者不能侵染長(zhǎng)花煙和B21；而ZD和M109則能在長(zhǎng)花煙和B21上造成較大病斑，說(shuō)明二者可以突破長(zhǎng)花煙類(lèi)抗源的抗性。5個(gè)菌株在LJ911和KE1等兩個(gè)感病對(duì)照煙草上均能產(chǎn)生典型野火病斑。綜合以上結(jié)果，可以判定，D151屬于野火菌0號(hào)生理小種，ZD和M109屬于1號(hào)小種，11528和W11屬于3號(hào)生理小種。本試驗(yàn)結(jié)果與上述幾個(gè)抗性鑒定試驗(yàn)一致。

圖5 野火菌接種對(duì)比試驗(yàn)Fig. 5 Comparative test of Pta inoculation

綜合大田接種試驗(yàn)和溫室接種試驗(yàn)，四個(gè)試驗(yàn)得到的5株野火菌生理小種分類(lèi)情況基本一致，分類(lèi)情況見(jiàn)表3。此處將ATCC11528歸類(lèi)為3號(hào)小種的原因?qū)⒃谟懻撝芯唧w論述。

表3 煙草野火菌生理小種分類(lèi)Tab. 3 Race classification of Ptas

3 討論

3.1 野火菌接種方法

煙草野火病抗性鑒定存在接種方法和接種結(jié)果判定方面的困難。如在大田中采用噴霧方法接種野火菌，由于自然環(huán)境下紫外線(xiàn)強(qiáng)、溫濕度條件差，低濃度的菌液不易在煙草葉片上定殖就過(guò)早死亡。另外，在無(wú)傷口情況下野火菌只能通過(guò)葉面氣孔侵入，侵染效率低，發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)，需2周時(shí)間才能出現(xiàn)病癥。如在溫室中采用針刺法接種野火菌，則難于控制接種量，同時(shí)，抗病煙草在高接種量情況下所表現(xiàn)出的超敏反應(yīng)形成的壞死斑與野火病斑難于區(qū)分，造成結(jié)果判定困難。

考慮到這些情況，設(shè)計(jì)多個(gè)具有不同優(yōu)點(diǎn)的平行試驗(yàn)，從多方面鑒定、驗(yàn)證野火菌的生理小種分類(lèi)。首先，大田接種試驗(yàn)?zāi)苣M野火菌在自然條件下侵染煙草，也可避免損傷式接種（如注射）接種量過(guò)大的缺點(diǎn)。其次，接種濃度梯度試驗(yàn)反映了不同小種野火菌在不同抗性煙草上病理反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間與其接種濃度的關(guān)系，是對(duì)具有不同特征生理小種的驗(yàn)證試驗(yàn)。同時(shí)，該試驗(yàn)也有利于區(qū)分野火病斑和由超敏反應(yīng)造成的壞死斑（由野火菌超敏反應(yīng)產(chǎn)生的壞死斑常常表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)、壞死斑顏色發(fā)白且周?chē)S色暈圈較小或沒(méi)有）：如果在高接種濃度梯度下（如對(duì)于長(zhǎng)花煙106CFU/mL以上，對(duì)于B21 103CFU/mL以上）某野火菌株可以短時(shí)間內(nèi)（1～2 d內(nèi)）造成某煙草材料出現(xiàn)壞死斑，而在低濃度梯度下對(duì)該煙草材料長(zhǎng)時(shí)間后卻不出現(xiàn)任何病理反應(yīng)（見(jiàn)濃度梯度接種試驗(yàn)），則能據(jù)此判定出現(xiàn)的壞死斑為超敏反應(yīng)造成。無(wú)損傷接種試驗(yàn)則是在不產(chǎn)生創(chuàng)口的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)接種試驗(yàn)所產(chǎn)生野火菌病斑大小的精確量化，是對(duì)大田試驗(yàn)這樣的定性試驗(yàn)及造成創(chuàng)口的注射接種試驗(yàn)的較好補(bǔ)充。接種對(duì)比試驗(yàn)是在同一煙草材料的同一片葉上接種所有野火菌株，以更清晰地呈現(xiàn)各野火菌株的差異。

3.2 試驗(yàn)結(jié)果討論

首先試驗(yàn)將收集的野火菌株用特異性分子標(biāo)簽進(jìn)行多輪純化，得到了純的野火菌株，排除了其他雜菌干擾，這是進(jìn)行下面接種試驗(yàn)的必要步驟（因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，即使有極少雜菌，其增殖速度也比野火菌快得多）。四個(gè)平行接種試驗(yàn)獲得的五株野火菌生理小種分類(lèi)的結(jié)果基本一致，即把野火菌D151歸為0號(hào)小種，把ZD和M109歸為1號(hào)小種，把ATCC11528和W11歸為3號(hào)小種，試驗(yàn)中未檢測(cè)到2號(hào)小種。綜合幾個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，同為1號(hào)小種的M109比ZD毒力強(qiáng)，表現(xiàn)在能以更低接種濃度、更短時(shí)間內(nèi)使長(zhǎng)花煙類(lèi)抗源發(fā)?。舛忍荻仍囼?yàn)），同一接種濃度下使長(zhǎng)花煙類(lèi)抗源更早出現(xiàn)、出現(xiàn)更大的病斑（無(wú)損傷接種試驗(yàn)及接種對(duì)比試驗(yàn)）；同為3號(hào)小種的W11比ATCC11528毒力強(qiáng)，表現(xiàn)為能以更低接種濃度、更短時(shí)間內(nèi)使黃花煙類(lèi)抗源發(fā)?。舛忍荻仍囼?yàn)），同一接種濃度下使黃花煙類(lèi)抗源更早出現(xiàn)、出現(xiàn)更大的病斑（無(wú)損傷接種試驗(yàn)及接種對(duì)比試驗(yàn)）。從接種用煙草材料來(lái)看，長(zhǎng)花煙表現(xiàn)出了對(duì)0和3號(hào)小種強(qiáng)的抑制能力；B21的抗性由長(zhǎng)花煙而來(lái)，但其抗性水平相對(duì)長(zhǎng)花煙減弱不少（濃度梯度試驗(yàn)及無(wú)損傷接種試驗(yàn)）。黃花煙與KRK26對(duì)0和1號(hào)小種的抗性水平與B21對(duì)0和3號(hào)小種的抗性水平相當(dāng)。

與先前的研究結(jié)果對(duì)比，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)原本引進(jìn)作為0號(hào)小種對(duì)照的野火菌株ATCC11528[11]在多個(gè)試驗(yàn)中均表現(xiàn)出了對(duì)黃花煙類(lèi)抗源的侵染能力（盡管其毒力弱于W11），這使它在本研究中被歸為3號(hào)小種。這種情況類(lèi)似3號(hào)小種的發(fā)現(xiàn)過(guò)程[4]，在本試驗(yàn)中有可能再次發(fā)生。這一結(jié)果，也會(huì)在后續(xù)煙草野火菌基因組測(cè)序試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。與先前的研究結(jié)果對(duì)比，大田接種試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Ky14品種不抗野火菌任何小種，甚至比作為感病對(duì)照的LJ911和KE1病情更嚴(yán)重，這與先前研究中用其作為抗0號(hào)小種材料不一致[10]。與先前的研究結(jié)果對(duì)比[4]，本試驗(yàn)由于采用了野生煙（長(zhǎng)花煙）、黃花煙栽培種（黃花煙）、白肋煙普通栽培煙草（B21），使得試驗(yàn)結(jié)果的勻質(zhì)性受到影響，尤其表現(xiàn)在用同一接種濃度接種各煙草材料時(shí)，出現(xiàn)與其他幾個(gè)試驗(yàn)結(jié)果不相一致的情況，如無(wú)損傷接種試驗(yàn)中野火菌M109的表現(xiàn)。參考濃度梯度接種試驗(yàn)結(jié)果，如用不同接種濃度接種不同煙草材料（但同一種煙草材料各野火菌株接種濃度相同），應(yīng)能達(dá)到與其他幾個(gè)試驗(yàn)相一致的試驗(yàn)結(jié)果。這也同時(shí)提示，在以后做抗病基因功能驗(yàn)證時(shí)，需要考慮到轉(zhuǎn)基因煙草抗性水平很有可能并不能達(dá)到其抗性來(lái)源一樣高的抗性的情況。

4 結(jié)論

由于目前國(guó)內(nèi)尚未以國(guó)際通行的抗性鑒別宿主區(qū)分煙草野火菌生理小種，本文首次基于抗性遺傳規(guī)律對(duì)收集的野火菌株進(jìn)行了生理小種鑒定。通過(guò)野火菌大田接種、濃度梯度接種、無(wú)損傷接種及同一葉片上的對(duì)比試驗(yàn)等4個(gè)各具優(yōu)勢(shì)的平行試驗(yàn)，將收集的野火菌D151、ZD和M109、ATCC11528和W11分別鑒定為0、1、3等3個(gè)小種。這為下一步培育野火菌小種專(zhuān)化抗性煙草品種及克隆小種專(zhuān)化抗病基因提供了重要基礎(chǔ)。