宋中邦，隋學(xué)藝，張誼寒，王亞輝，趙高坤，李勇，王丙武，劉加紅，解燕，楊世波，顧華國(guó)*

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家煙草基因工程研究中心，昆明 650021；2 云南省煙草公司曲靖市公司，曲靖 655000；3 云南香料煙有限責(zé)任公司，保山 678000

栽培煙草（Nicotiana tabacum）是兩個(gè)祖先絨毛狀煙草（N. tomentosiformis）和林煙草（N. sylvestris）通過種間雜交形成的異源四倍體，其葉片生物堿譜與兩個(gè)祖先種存在顯著差異。大部分栽培煙草的綠色及衰老葉片中煙堿是主要生物堿，約占生物堿總量的90%～95%。絨毛狀煙草在綠色及衰老葉片中均積累去甲基煙堿；而林煙草在綠色葉片中主要積累煙堿，但在葉片衰老過程中大部分煙堿轉(zhuǎn)化為去甲基煙堿[1-2]。白肋煙“非轉(zhuǎn)化株”（Non-converter）葉片的主要生物堿為煙堿，但其子代群體中約有20%單株能發(fā)生自發(fā)突變，煙葉內(nèi)的煙堿通過去甲基酶的作用轉(zhuǎn)化為去甲基煙堿，從而使去甲基煙堿成為煙葉中積累的主要生物堿之一，這樣的突變株稱為“轉(zhuǎn)化株”（Converter）[3]?？緹熞矔?huì)發(fā)生類似自發(fā)突變導(dǎo)致其煙葉主要累積去甲基煙堿，且突變株烤后煙葉表面呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，國(guó)外學(xué)者稱為“Cherry-red”[4-6]，我國(guó)民間稱之為“硃砂煙”。硃砂煙出現(xiàn)概率極低，有研究表明在538個(gè)單株中發(fā)現(xiàn)3株硃砂煙，概率僅為0.56%[5]。硃砂煙具有獨(dú)特的“糯米香”，云南地區(qū)煙民抽吸水煙筒時(shí)會(huì)將硃砂煙葉作為調(diào)香原料。

煙堿去甲基酶催化煙堿脫甲基產(chǎn)生去甲基煙堿，目前煙草基因組中煙堿去甲基酶基因家族共有4個(gè)功能基因被克隆，分別為CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10、CYP82E21[7-12]。CYP82E21基因雖能編碼具有活性的煙堿去甲基酶，但僅在花藥中表達(dá)，不影響葉片去甲基煙堿含量[11]。研究表明白肋煙“轉(zhuǎn)化株”中CYP82E5、CYP82E10基因?qū)θゼ谆鶡焿A合成無(wú)明顯貢獻(xiàn)，而CYP82E4在白肋煙“轉(zhuǎn)化株”受未知機(jī)制誘導(dǎo)高水平表達(dá)，是導(dǎo)致“非轉(zhuǎn)化株”自發(fā)突變成“轉(zhuǎn)化株”的關(guān)鍵基因[12]。“非轉(zhuǎn)化株”中過表達(dá)該基因可以顯著提高葉片煙堿轉(zhuǎn)化率（nicotine conversion rate，NCR，去甲基煙堿/（煙堿+去甲基煙堿）×100%），而通過RNAi抑制轉(zhuǎn)化株CYP82E4基因表達(dá)、轉(zhuǎn)化株中CYP82E4基因突變均能導(dǎo)致煙堿轉(zhuǎn)化率顯著下降[9-10]?？緹熤蠧YP82E4基因表達(dá)水平極低，煙堿去甲基化反應(yīng)主要由CYP82E5、CYP82E10催化。云煙87中CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10基因三突材料的葉片去甲基煙堿含量比對(duì)照下降約90%[13]。因堿譜類似白肋煙“轉(zhuǎn)化株”，推測(cè)烤煙“轉(zhuǎn)化株”（硃砂煙）中CYP82E4基因也可能被誘導(dǎo)高水平表達(dá)，導(dǎo)致其煙葉中主要累積的生物堿為去甲基煙堿。

硃砂煙作為一種自發(fā)突變材料，其突變概率可能受到品種、土壤、營(yíng)養(yǎng)、生態(tài)等因素的影響。本研究對(duì)硃砂2號(hào)開展農(nóng)藝、遺傳、基因、化學(xué)等特征特性分析，可為今后進(jìn)一步研究硃砂煙成因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院玉溪研和試驗(yàn)基地發(fā)現(xiàn)云煙87部分單株烤后產(chǎn)生硃砂煙，留杈套袋自交收種獲得硃砂2號(hào)種子。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn)

2020年度硃砂2號(hào)在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院玉溪研和試驗(yàn)基地進(jìn)行品比試驗(yàn)，田間生產(chǎn)參考當(dāng)?shù)卦茻?7的配套措施。設(shè)3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植100株左右，打頂后隨機(jī)選取10株調(diào)查農(nóng)藝性狀?？竞鬅熑~根據(jù)硃砂紅色深淺程度人工分成淺紅、中等紅色、深紅3組進(jìn)行相關(guān)研究。硃砂煙比率=當(dāng)爐硃砂煙葉重量/當(dāng)爐烤后煙葉總重×100%。

1.2.2 定量PCR分析

分別在煙株田間生長(zhǎng)的團(tuán)棵期、現(xiàn)蕾期、打頂后3個(gè)時(shí)期對(duì)煙株中部葉片液氮取樣后-80℃保存?zhèn)溆?。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）。采用SYBR Green法（SYBR Green l Master Mix，Roche）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）分析（LightCycler 480，Roche），定量引物如表1所示。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.2.3 生物堿檢測(cè)

烤后取中部煙葉用于化學(xué)成分檢測(cè)，設(shè)6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。生物堿檢測(cè)：內(nèi)標(biāo)喹啉、去甲基煙堿購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，煙堿購(gòu)自TRC公司，檢測(cè)儀器為Bruker 450GC-300MS氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Bruker）。準(zhǔn)確稱取煙樣0.5 g于50 mL離心管中，加入5 mL 10%的NaOH溶液，搖勻，浸泡15 min，加入20 mL含內(nèi)標(biāo)的萃取液，超聲60 min，在離心機(jī)上5000 r/min離心5 min，取2 mL下層二氯甲烷清液過裝有2 g無(wú)水硫酸鈉的微孔過濾器后，用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 硃砂2號(hào)田間農(nóng)藝性狀及硃砂煙葉產(chǎn)出規(guī)律

國(guó)外有文獻(xiàn)記載[4-6]，烤煙品種高轉(zhuǎn)化株的烤后煙葉也呈紅色，被命名為“Cherry-red”。2019年烤煙生產(chǎn)季在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院玉溪研和試驗(yàn)基地發(fā)現(xiàn)云煙87部分單株烤后煙葉呈紅色（圖1），這種外觀初烤煙葉在云南煙區(qū)長(zhǎng)期存在，被煙農(nóng)稱為“硃砂”煙，因此推測(cè)“硃砂”煙葉即是“Cherryred”煙，將該資源命名為硃砂2號(hào)。2020年烤煙生產(chǎn)季，對(duì)硃砂2號(hào)和對(duì)照云煙87進(jìn)行了品系比較試驗(yàn)。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，硃砂2號(hào)田間長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、煙株整齊度較高，株型、葉色、生育期等性狀與云煙87基本一致。硃砂2號(hào)打頂株高130.2 cm，有效葉片數(shù)26.5，莖圍10.0 cm，腰葉長(zhǎng)寬分別為64.2 cm和30.5 cm，各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照云煙87相當(dāng)（表2）。烘烤試驗(yàn)分5次采烤完畢，按每一爐烤后獲得煙葉總質(zhì)量及硃砂煙葉質(zhì)量計(jì)算硃砂煙比率。根據(jù)圖2所示，下部葉也有一定比率硃砂煙葉產(chǎn)生，隨著葉位增高，硃砂煙比率迅速上升，最后一爐硃砂煙比率高達(dá)87.5%，整體硃砂煙產(chǎn)出率為64.3%。

圖1 硃砂煙葉烤后表型Fig. 1 Cherry-red phenotype of Zhusha tobacco leaves

圖2 不同烘烤階段硃砂煙葉比例Fig. 2 The percentage of Zhusha tobacco leaves in different curing stages

表2 硃砂2號(hào)農(nóng)藝性狀Tab. 2 The agronomic traits of Zhusha2 tobacco

2.2 硃砂煙特征基因和化合物研究

生物堿分析表明，同田種植的云煙87烤后煙葉煙堿含量為1.59%，去甲基煙堿含量為0.09%，煙堿轉(zhuǎn)化率為5.12%（圖3）。硃砂2號(hào)煙葉的堿譜與云煙87不同，其主要生物堿為去甲基煙堿，顏色呈淺紅、中等紅色、深紅的硃砂煙葉去甲基煙堿含量依次增加，分別為0.97%、1.25%、1.78%，對(duì)應(yīng)的煙堿轉(zhuǎn)化率分別為86.95%、90.86%、93.85%（圖3）。硃砂煙葉煙堿含量顯著低于云煙87，分別為0.15%、0.13%、0.12%（圖3）。目前已知CYP82E2基因家族的4個(gè)成員能夠編碼具有功能的煙堿去甲基酶基因，為明確硃砂2號(hào)高煙堿轉(zhuǎn)化率的原因，利用qPCR分析了鮮煙葉中上述基因的表達(dá)水平（圖4）。CYP82E21在云煙87和硃砂2號(hào)中均不表達(dá)，CYP82E5、CYP82E10表達(dá)水平在硃砂2號(hào)中更低。云煙87中CYP82E4不表達(dá)，但該基因在硃砂2號(hào)中高水平表達(dá)，可能是硃砂煙高煙堿轉(zhuǎn)化率的內(nèi)在原因。

圖3 硃砂煙葉生物堿譜Fig. 3 Alkaloid profile of Zhusha tobacco leaves

注：誤差線代表6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，*表示與對(duì)照云煙87相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 硃砂煙不同生育期CYP82E4基因表達(dá)模式及煙堿轉(zhuǎn)化率分析

為明確硃砂2號(hào)生長(zhǎng)過程中CYP82E4基因表達(dá)水平變化及其導(dǎo)致的堿譜變化規(guī)律，采集團(tuán)棵期、現(xiàn)蕾期、打頂后大田植株的中部煙葉進(jìn)行分析（圖5）。各時(shí)期云煙87樣品中均未檢測(cè)到CYP82E4基因表達(dá)，但硃砂2號(hào)中CYP82E4基因隨著煙株生長(zhǎng)發(fā)育水平逐步上升。云煙87中煙堿轉(zhuǎn)化率在不同生長(zhǎng)時(shí)期無(wú)明顯差異，而硃砂2號(hào)煙堿轉(zhuǎn)化率在不同時(shí)期均顯著高于云煙87，且隨著生長(zhǎng)發(fā)育逐步上升，與CYP82E4基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致（圖5）。

圖5 全生育期CYP82E4基因表達(dá)模式及煙堿轉(zhuǎn)化率分析Fig. 5 The CYP82E4 expression pattern and NCR during different growth periods

2.4 硃砂煙遺傳穩(wěn)定性分析

硃砂2號(hào)套袋自交收種后在漂浮盤播種，苗期隨機(jī)選擇單株進(jìn)行CYP82E4基因表達(dá)水平分析及生物堿檢測(cè)（圖6）。云煙87葉片中無(wú)法檢測(cè)到CYP82E4基因表達(dá)，但所有硃砂2號(hào)樣品的CYP82E4基因高水平表達(dá)。相比之下，所有硃砂2號(hào)樣品的煙堿轉(zhuǎn)化率均遠(yuǎn)高于云煙87。上述硃砂2號(hào)單株烤后煙葉均呈現(xiàn)明顯的硃砂特征，表明硃砂煙可以穩(wěn)定遺傳。

圖6 CYP82E4基因表達(dá)水平及煙堿轉(zhuǎn)化率分析Fig. 6 Analysis of the CYP82E4 expression level and NCR

3 討論

栽培煙草中的去甲基煙堿含量通常低于總生物堿的5%，然而在白肋煙“轉(zhuǎn)化株”中，煙堿被大量轉(zhuǎn)化為去甲基煙堿，使后者比例可高達(dá)95%。通過比較“轉(zhuǎn)化株”和“非轉(zhuǎn)化株”葉片基因微矩陣[15]差異，發(fā)現(xiàn)CYP82E2基因家族基因表達(dá)存在差異?；赗NAi沉默CYP82E2基因家族基因和酵母異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CYP82E4基因?yàn)闊焿A轉(zhuǎn)化為去甲基煙堿的重要基因[12]。根據(jù)qPCR結(jié)果，栽培烤煙品種云煙87煙葉中CYP82E4基因表達(dá)水平極低，往往低于檢測(cè)限。相比之下，硃砂2號(hào)中CYP82E4基因被誘導(dǎo)表達(dá)，從而導(dǎo)致煙葉中煙堿大部分被轉(zhuǎn)化成去甲基煙堿。這與白肋煙中CYP82E4基因被誘導(dǎo)表達(dá)，導(dǎo)致“非轉(zhuǎn)化株”向“轉(zhuǎn)化株”轉(zhuǎn)化相似。

硃砂煙和白肋煙“轉(zhuǎn)化株”子代中CYP82E4基因仍保持高表達(dá)，表明該性狀能穩(wěn)定遺傳，但烤煙和白肋煙中誘導(dǎo)CYP82E4基因高表達(dá)的機(jī)制尚不明確。據(jù)統(tǒng)計(jì)，烤煙品種自然條件下，自發(fā)突變產(chǎn)生硃砂煙的概率約為0.56%，遠(yuǎn)低于白肋煙“轉(zhuǎn)化株”產(chǎn)生概率20%，這可能由烤煙和白肋煙基因組水平差異引起。Sanger測(cè)序表明普通烤煙、硃砂煙、白肋煙“轉(zhuǎn)化株”、白肋煙“非轉(zhuǎn)化株”的CYP82E4基因上游啟動(dòng)子2000 bp區(qū)域堿基序列完全一致（數(shù)據(jù)未發(fā)表），可以推測(cè)CYP82E4基因誘導(dǎo)表達(dá)與啟動(dòng)子DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)不大。因此，推測(cè)與白肋煙“轉(zhuǎn)化株”形成相似，田間硃砂煙自發(fā)突變形成可能也受到表觀遺傳控制。CYP82E4基因誘導(dǎo)機(jī)理、白肋煙和烤煙中是否存在不同誘導(dǎo)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

硃砂煙基因及化學(xué)特征主要表現(xiàn)為煙堿去甲基酶基因CYP82E4被激活表達(dá)，導(dǎo)致去甲基煙堿成為主要生物堿，硃砂煙農(nóng)藝性狀與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，烤后煙葉硃砂紅性狀能夠穩(wěn)定遺傳。