豬瘟疫苗的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢

賈華強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬瘟是由豬瘟病毒感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要特征是發(fā)病急、高熱稽留和細(xì)小血管壁變性，從而引起泛發(fā)性小點(diǎn)狀出血、梗死和壞死。該病傳染性強(qiáng)，病死率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。OIE 將其列為法定報(bào)告疾病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。豬瘟病毒是其病原體，盡管豬瘟病毒各個(gè)毒株的毒力不同，但是它們都使養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了巨大損失，威脅著全世界的豬肉生產(chǎn)和國家人口的糧食安全。它在亞洲、中美洲和南美洲的一些地區(qū)以及許多東歐國家流行，在西歐偶有發(fā)現(xiàn)。目前沒有藥物可以有效治療豬瘟，疫苗接種和生物安全措施是預(yù)防和控制豬瘟的主要方法。

1 豬瘟疫苗的發(fā)展現(xiàn)狀與面臨的挑戰(zhàn)

1.1 弱毒疫苗 20 世紀(jì)40 年代，世界多個(gè)國家進(jìn)行豬瘟病毒的弱化研究，其中日本使用低溫適應(yīng)性豚鼠腎細(xì)胞獲得GPE-弱毒株，法國使用低溫適應(yīng)性細(xì)胞獲得Thiverval 毒株。中國獸藥監(jiān)察所與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所聯(lián)合使用豬瘟病毒石門系強(qiáng)毒在家兔連續(xù)傳代獲得具有更好穩(wěn)定性、安全性和免疫原性的豬瘟兔化弱毒株C 株（Chinese strain）。該毒株生產(chǎn)的疫苗已成為國內(nèi)外預(yù)防豬瘟最常用的疫苗，但使用血清學(xué)方法不能區(qū)分感染動(dòng)物和接種疫苗的動(dòng)物（Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA），因而阻礙豬瘟病毒的根除。由于這一限制，歐盟國家不允許給豬接種高保護(hù)效力的弱毒株“C”株或類似的減毒活疫苗。在生產(chǎn)過程中家兔脾淋苗、全乳兔苗對動(dòng)物福利不友好，由于細(xì)胞源弱毒疫苗使用胎牛血清會出現(xiàn)外源病毒感染（牛病毒性腹瀉病毒，BVDV 等）的情況，導(dǎo)致豬瘟疫苗免疫效價(jià)降低，增加疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 亞單位疫苗 重組DNA 技術(shù)的出現(xiàn)意味著外源基因可以被插入表達(dá)載體，由細(xì)胞表達(dá)基因編碼的外源蛋白。研究人員可以根據(jù)需求選擇使用酵母、細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及植物細(xì)胞表達(dá)蛋白。豬瘟亞單位疫苗在區(qū)分感染動(dòng)物和疫苗接種動(dòng)物以及安全性方面具有優(yōu)勢，是控制和根除豬瘟的有前途的疫苗。

與原核系統(tǒng)相比，重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的目的蛋白質(zhì)具有正確的空間結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾（如蛋白質(zhì)糖基化和二硫鍵形成），因此疫苗具有有效的免疫原性。2018 年研究人員發(fā)現(xiàn)通過桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的豬瘟E2 蛋白和豬IFN-γ 蛋白可以顯著增強(qiáng)斷奶仔豬特異性免疫應(yīng)答。密碼子的優(yōu)化、啟動(dòng)子的選擇（如多角體蛋白、p10、Hsp70）、信號肽的選擇（如蜜蜂蜂毒肽信號肽、免疫球蛋白K信號肽）都對E2 蛋白的表達(dá)效率有影響。到目前為止，尚未報(bào)道來自天然可溶性E2 蛋白的信號肽的精確序列。E2 蛋白的分泌效率和免疫原性尚未得到很好的優(yōu)化，并且疫苗生產(chǎn)成本較高。2020 年研究人員發(fā)現(xiàn)SPZJ 信號肽在可以增加至少50%E2 蛋白的生產(chǎn)率，并且顯著提高其免疫原性。為了進(jìn)一步降低疫苗成本，孫賀群等人使用蛹蟲草表達(dá)豬瘟E2蛋白，Park 等人使用煙草組織表達(dá)豬瘟E2 蛋白。李天增等人探究水佐劑、雙相佐劑、油包水佐劑增強(qiáng)亞單位疫苗免疫的效果，發(fā)現(xiàn)油包水佐劑（ISA 植物油佐劑）表現(xiàn)優(yōu)異。Ze 等人利用自組裝肽（mi3）開發(fā)出基于CSFV E2 的自組裝納米疫苗SP-E2-mi3 NPs，研究結(jié)果表明E2-mi3 NPs 可以顯著改善體液免疫和細(xì)胞免疫。Yanmin 等人采用生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)優(yōu)化了連接子（linker）連接E2、IFN-γ 基因，在HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白E2-R2-PIFN，以提高CSFV E2 亞單位疫苗的免疫原性。

基于桿狀病毒表達(dá)E2 的兩種疫苗（拜耳公司的BAYOVAC CSF E2 和默沙東公司的Porcelis Pesti）已在歐洲實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。2017 年，國內(nèi)天康生物成功注冊重組桿狀病毒滅活疫苗（Rb-03 株），將CSFV E2 蛋白基因插入桿狀病毒，使用重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)豬瘟E2 蛋白，2018 年投入使用。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)與各企業(yè)合作開發(fā)出重組桿狀病毒亞單位疫苗（WH-09 株），該疫苗安全性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，于2020 年成功注冊。

盡管已經(jīng)開發(fā)了亞單位疫苗，但它們的免疫原性和保護(hù)作用不如傳統(tǒng)的減毒活疫苗（如免疫起效晚，免疫效力低，不能阻斷垂直傳播），后續(xù)還需繼續(xù)探究免疫一次就能達(dá)到很好免疫效果的方案。

1.3 核酸疫苗 核酸疫苗的研究需要找到病原微生物引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的特定抗原，再將其抗原的基因克隆到質(zhì)粒上制成疫苗，或?qū)⑿攀筊NA 直接制成疫苗導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)。核酸疫苗的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)且高效，它們可以引發(fā)MHC I 類、MHC II 類T 細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。

研究專家基于甲病毒開發(fā)了新一代動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)可廣泛選擇動(dòng)物細(xì)胞宿主，效率高，使用方便，近年來有關(guān)甲病毒載體的研究在國內(nèi)外都非?；钴S。該系統(tǒng)可以消除使用裸DNA疫苗產(chǎn)生染色體整合等潛在威脅，提高了常規(guī)DNA疫苗的生物安全性，其中基于塞姆利基森林病毒（SemLiki forest virus,SFV）開發(fā)的載體pSCA1 已被用于HPV DNA 疫苗的開發(fā)。這表明SFV 復(fù)制子衍生的DNA 疫苗可以成為針對CSFV 感染的潛在標(biāo)志疫苗，然而接種多種疫苗產(chǎn)生高保護(hù)效果的成本較高，因此核酸疫苗在實(shí)際應(yīng)用中并不廣泛。

一些研究人員發(fā)現(xiàn)，PCV2 會干擾CSFV 疫苗的免疫作用，CSFV 疫苗的保護(hù)效果會受PCV2 感染的影響，CSFV 和PCV 的合并感染明顯增加了養(yǎng)豬業(yè)疾病防控的難度，因此Fuyu 等人選擇甲病毒質(zhì)粒pSCA1 作為CSFV E2、Erns 基因以及PCV2 Cap 和Rep 基因的載體，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒疫苗可以在體外表達(dá)E2、Erns、Cap 和Rep 蛋白，并在體內(nèi)促進(jìn)CSFV 和PCV2 抗體的產(chǎn)生。

核酸疫苗還需投入大量的人力進(jìn)一步評估可行性、安全性和有效性，并提升核酸疫苗在大動(dòng)物體內(nèi)的免疫原性和抗體效價(jià)。同時(shí)我們還需要注意持續(xù)高水平表達(dá)外源抗原會對機(jī)體產(chǎn)生傷害（如自動(dòng)免疫、超敏反應(yīng)、過敏反應(yīng)、產(chǎn)生免疫耐受）。

1.4 嵌合病毒活疫苗 減毒活疫苗具有幾個(gè)明顯的優(yōu)勢。它可以通過在宿主中復(fù)制，更準(zhǔn)確地模擬自然感染狀態(tài)、易于給藥、提供機(jī)體更長久的免疫力、全面刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)（體液免疫、細(xì)胞免疫）。出于這些原因，科學(xué)家們開發(fā)了嵌合病毒活疫苗。大多數(shù)病毒載體研究都集中在較大DNA 病毒上，特別是痘病毒、皰疹病毒和腺病毒。皰疹病毒（如傳染性牛鼻氣管炎病毒、貓皰疹病毒和偽狂犬病病毒）和腺病毒（如犬、馬、禽和黑猩猩腺病毒）也正在開發(fā)為載體。

李譜華等人將CSFV 的E2 基因插入雞痘病毒(Fowlpox virus,FPV) 構(gòu)建重組病毒FV282-CSFV-E2，通過免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明其保護(hù)率為75%。孫永科等人通過293 細(xì)胞包裝攜帶豬瘟Erns 基因的腺病毒。2023 年，Dong 等人將CSFV LOM 株的E2 基因插入BVDV KD26 株的骨架中，制備了嵌合病毒活疫苗KD26-E2LOM。2015 年Suvaxyn CSF Marker，一種嵌合體病毒活疫苗修飾BVDV 使其表達(dá)CSFV E2 基因，獲得歐盟批準(zhǔn)。然而，Suvaxyn CSF Marker 僅被批準(zhǔn)用于緊急疫苗接種。

BVDV/CSFV 嵌合體病毒活疫苗CP7-E2alf，使用CSFV 毒株Alfort/187 的E2 基因取代BVDV 毒株CP7 的E2 基因，并于2014 年在歐洲獲得上市許可。韓國政府通過將BVDV 的Erns 基因插入CSFV毒株Flc-LOM 中開發(fā)了具有DIVA 功能的疫苗Flc-LOM-BErns，于2017 年在韓國獲得上市許可，并于2020 年將使用Flc-LOM-BErns 作為政策實(shí)行。這兩種疫苗經(jīng)過多方面的檢驗(yàn)，如毒株的遺傳穩(wěn)定性、安全性以及療效，證明其與傳統(tǒng)減毒活疫苗一樣安全有效，但它們不能預(yù)防強(qiáng)毒株的垂直傳播。

CSFV 與其他病毒如PRV（偽狂犬病病毒）、PCV2（豬圓環(huán)病毒2 型）和PRRSV（豬繁殖與呼吸綜合征病毒）的合并感染在東歐和亞洲的大多數(shù)豬肉生產(chǎn)國（包括中國）非常普遍。針對這種情況，Selvaraj 等人構(gòu)建了三基因缺失（糖蛋白E、糖蛋白G 以及胸苷激酶基因）疫苗載體PRVtmv，在三個(gè)基因刪除的位點(diǎn)分別插入CSFV E2 基因、CSFV Erns與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合基因、PCV2b Cap 基因。Yang 等人將經(jīng)過氨基酸突變的全長E2 基因插入PRV 中，首次實(shí)現(xiàn)使用PRV 表達(dá)全長E2 基因，結(jié)果顯示表達(dá)E2 全長基因的疫苗免疫效果要比表達(dá)截?cái)郋2 基因的疫苗免疫效果好。

由于CSFV 和BVDV 的抗原關(guān)系密切，交叉反應(yīng)性抗體可能導(dǎo)致假陽性反應(yīng)和DIVA 鑒別失敗。為了開發(fā)更好的具有DIVA 特性的候選標(biāo)記疫苗，有研究專家通過使用遠(yuǎn)緣瘟病毒的同源基因取代豬瘟病毒Erns 基因，構(gòu)建嵌合病毒。

1.5 合成肽疫苗 1963 年，使用化學(xué)方法分離出的煙草花葉病毒的六肽片段與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)可以引發(fā)兔產(chǎn)生抗體，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)肽具有成為疫苗潛力。1982 年，Bittle 等人使用動(dòng)物口蹄疫病毒（FMDV）首次證明肽除了在體外具有中和活性外，還可在體內(nèi)引發(fā)保護(hù)性免疫。合成肽疫苗是根據(jù)病原微生物基因序列合成含有抗原決定簇的肽段制成的疫苗，其安全性和穩(wěn)定性高且經(jīng)濟(jì)，可分為單肽疫苗和多肽疫苗，具有良好的開發(fā)前景。

Qianru 等人發(fā)現(xiàn)了E2 蛋白表面結(jié)構(gòu)域C 和結(jié)構(gòu)域D 的邊界處的新型線性表位（256CLIGNTTVKV HASDER271），200 μg/mL 的線性肽與抗豬瘟血清孵育可使其中和能力降低63%，為豬瘟新疫苗的設(shè)計(jì)和鑒別診斷提供了理想的候選肽。Xiaotian 等人發(fā)現(xiàn)331ATDRHSDYF339 肽段可顯著抑制豬瘟感染，這個(gè)發(fā)現(xiàn)可用于設(shè)計(jì)能產(chǎn)生快速保護(hù)的新疫苗。

1.6 基因缺失疫苗 這種疫苗是將病毒基因組中與病毒毒力相關(guān)的基因敲除或突變從而獲得弱毒株制成的基因缺失疫苗。這使疫苗有更全面的免疫原性，且弱毒株不易恢復(fù)毒力。

Lauren 等人驗(yàn)證他們實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的雙抗原標(biāo)記減毒CSFV 活疫苗，該毒株FlagT4v 插入了合成表位Flag，并使單克隆抗體表位WH 303 發(fā)生突變。結(jié)果顯示，F(xiàn)lagT4v 疫苗可在使用后第3 天產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但是該疫苗難以大規(guī)模推廣。Nicolas 等人選擇兩個(gè)強(qiáng)毒株Alfort/187 和Eystrup，使用鼠的泛素基因替換二者的Npro 基因,成功構(gòu)建穩(wěn)定的弱毒株,并且兩種弱毒株都可以保護(hù)機(jī)體免受致死劑量的豬瘟強(qiáng)毒攻擊。豬瘟基因缺失疫苗還需引進(jìn)PRV 疫苗的技術(shù)手段，為后續(xù)豬瘟基因缺失疫苗的研發(fā)提供幫助。

1.7 全長感染性cDNA 標(biāo)記疫苗 全長感染性cDNA 標(biāo)記疫苗是使用反向遺傳學(xué)技術(shù)在分子水平上,將具有標(biāo)記的基因替換到致弱病毒全長cDNA中,獲得的重組病毒為DIVA 疫苗。Gil 等人經(jīng)RT-PCR 得到可以代表CSFV LOM 基因組的8 個(gè)DNA 片段,構(gòu)建具有8 個(gè)堿基突變的全長cDNA 克隆Flc-LOM。免疫動(dòng)物14 d 后機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體。該種類疫苗可以將標(biāo)記性基因克隆到CSFV 弱毒cDNA 中，為建立快速、準(zhǔn)確的CSFV 檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

2 未來發(fā)展趨勢

幾十年以來，人們一直在使用安全有效的減毒活疫苗來控制豬瘟，為根除豬瘟鋪平道路，雖然這些疫苗在免疫效果和免疫持續(xù)時(shí)間上具有突出的優(yōu)勢，但是它們不能區(qū)分感染動(dòng)物和接種疫苗的動(dòng)物。作為豬瘟第一代DIVA 疫苗，商業(yè)化的E2 亞單位疫苗具有高度的安全性，但是缺乏一定的功效，因此很多研究專家致力于開發(fā)下一代具有良好安全性、有效性和適銷性的DIVA 疫苗。雖然目前很多新型疫苗的研發(fā)都處于實(shí)驗(yàn)室階段，但隨著人們不斷地深入研究，將新型疫苗的優(yōu)勢最大化，DIVA 疫苗將在凈化豬瘟上發(fā)揮巨大作用。