兩種不同氣候類型下釀酒葡萄果實(shí)有機(jī)酸代謝的比較分析

李帥 馮銘鑫 雷煜璐 白世踐 孟江飛 許騰飛

摘 要 有機(jī)酸是葡萄果實(shí)中重要的風(fēng)味化合物。在漿果發(fā)育過程中，環(huán)境溫度會影響有機(jī)酸的積累。以釀酒葡萄‘赤霞珠和‘馬瑟蘭為試材，比較了新疆鄯善為代表的的炎熱氣候與山西鄉(xiāng)寧地區(qū)為代表的冷涼氣候兩種栽培條件下葡萄果實(shí)中有機(jī)酸積累的差異。結(jié)果表明，山西鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)更大，果粒百粒質(zhì)量、橫縱徑均高于鄯善產(chǎn)區(qū)；鄯善地區(qū)葡萄可滴定酸含量顯著低于鄉(xiāng)寧，pH則高于鄉(xiāng)寧。轉(zhuǎn)色前有機(jī)酸持續(xù)積累，包括酒石酸、蘋果酸及少量檸檬酸；轉(zhuǎn)色后鄯善和鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)可滴定酸分別降低84.8%和78.5%，其中以蘋果酸的降解尤為顯著。鄯善地區(qū)成熟葡萄果實(shí)酒石酸含量保持在7.23～8.96 mg/粒，鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)酒石酸含量顯著高于鄯善，達(dá)到9.06～10.75 mg/粒；在葡萄發(fā)育的整個(gè)周期，鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)中酒石酸、蘋果酸和抗壞血酸含量均高于鄯善，兩個(gè)供試品種表現(xiàn)趨勢一致。此外，相較于蘋果酸合成與降解相關(guān)基因，液泡膜質(zhì)子泵基因VvVHP在響應(yīng)高溫轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸并改變可滴定酸含量中可能發(fā)揮了更關(guān)鍵的作用。

關(guān)鍵詞 釀酒葡萄；有機(jī)酸；高溫；基因表達(dá)

葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上廣泛栽培的水果之一，具有適應(yīng)性強(qiáng)、味道鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的特點(diǎn)。根據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）的統(tǒng)計(jì)報(bào)告，2020年全球葡萄園面積為7.33 Mhm2，其中中國的葡萄園表面積為7.85? khm2，占世界面積的10.7%（OIV， 2020）。葡萄漿果含有豐富的化合物，糖、酸和酚類物質(zhì)的存在會顯著影響葡萄和葡萄酒的感官質(zhì)量[1]。其中，有機(jī)酸調(diào)節(jié)著“酸堿平衡”，會影響葡萄漿果的口感和葡萄酒的風(fēng)味。有機(jī)酸的積累和調(diào)控是葡萄品質(zhì)控制的一個(gè)重要方面。

葡萄中有機(jī)酸種類豐富，Kliewer[2]在葡萄漿果中發(fā)現(xiàn)了近23種有機(jī)酸，其中酒石酸和蘋果酸含量最高，檸檬酸較少，其他有機(jī)酸含量都極低[3-4]。L-酒石酸（2，3-二羥基丁二酸）是葡萄屬和天竺屬植物中特有的有機(jī)酸，多存在于葉片與果實(shí)中[5]。研究認(rèn)為，酒石酸主要以抗壞血酸為基礎(chǔ)，經(jīng)過五或六步生化反應(yīng)形成，目前鑒定到的兩種關(guān)鍵合成途徑酶為L-艾杜糖酸脫氫酶（L-IdnDH）和2-酮-L-古洛糖酸還原酶（2-KGR），酒石酸合成中其他相關(guān)酶還需進(jìn)一步發(fā)掘[5-7]。L-酒石酸在植物中的生物功能尚不明確，但在葡萄酒風(fēng)味、微生物穩(wěn)定性等方面具有重要貢獻(xiàn)[8-9]；Zhao等[10]的研究表明，酒石酸化合物可通過改變蛋白質(zhì)-多酚配合物之間的氫鍵和疏水鍵，形成三元配合物，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)拉伸，影響葡萄酒的澀味。與酒石酸不同，作為光合作用的早期產(chǎn)物，蘋果酸是許多植物代謝物和化合物的前體，并能夠?yàn)椴煌?xì)胞組織中發(fā)生的不同代謝途徑傳遞電子；通過TCA循環(huán)和乙醛酸循環(huán)，蘋果酸能夠轉(zhuǎn)化為檸檬酸或其他二羧酸從而改變果實(shí)細(xì)胞酸度[11]。作為葡萄果實(shí)中第二種主要有機(jī)酸，蘋果酸參與植物細(xì)胞代謝并在控制葉片氣孔孔徑，改善植物營養(yǎng)和增加對重金屬毒性的抵抗力等方面發(fā)揮作用[12]。

除了少量關(guān)于光照[13]、干旱[14]和嫁接砧木[15]的報(bào)道外，人們認(rèn)為酒石酸的積累不受脅迫和環(huán)境或栽培管理措施的影響；然而，在具體實(shí)踐中不同地區(qū)葡萄中酒石酸含量存在很大差異[16]。蘋果酸和檸檬酸對環(huán)境因素很敏感，研究表明，如植物庫源關(guān)系[17]、灌溉[18-19]和溫度[20]等均影響蘋果酸和檸檬酸的積累。葡萄果實(shí)中的有機(jī)酸含量取決于品種特性、外部栽培方式和自然環(huán)境的相互作用；溫度是影響葡萄中有機(jī)酸積累的重要環(huán)境因素[21]。高溫破壞了植物的一些代謝途徑，導(dǎo)致對葡萄品質(zhì)至關(guān)重要的必需化合物的生物合成發(fā)生改變。研究表明，積溫每升高100 ℃，有機(jī)酸含量降低0.03%～0.08%；平均溫度每升高? 1 ℃，有機(jī)酸含量降低0.04%～0.08%[22]。雖然蘋果酸代謝隨溫度升高而增加，但當(dāng)溫度達(dá)到? 40 ℃時(shí)，蘋果酸含量急劇下降[23]。高溫改變了葡萄有機(jī)酸的積累進(jìn)而影響了葡萄酒的品質(zhì)。然而，在冷涼與炎熱兩種氣候類型條件下釀酒葡萄不同有機(jī)酸的代謝差異仍不清楚。因此，本研究旨在通過比較以新疆鄯善為代表的炎熱氣候和山西鄉(xiāng)寧為代表的冷涼氣候下葡萄果實(shí)有機(jī)酸積累變化，闡明高溫對葡萄果實(shí)發(fā)育過程中有機(jī)酸生物合成和降解的影響，為揭示高溫調(diào)控葡萄有機(jī)酸合成和代謝的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與生長條件

供試材料分別為新疆鄯善（42.87°N，?? 90.21°E）和山西鄉(xiāng)寧（35.97°N， 110.85°E）地區(qū)（圖1）的釀酒葡萄品種‘赤霞珠（Vitis vinifera cv.Cabernet Sauvignon）與‘馬瑟蘭（Vitis vinifera cv.Marselan）。葡萄樹于2011年種植，南北行向，間距為1.2 m× 3.0 m，‘廠字形樹形，兩地葡萄園管理方式基本一致。

1.2 樣品采集

參考Coombe[24]的改良E-L系統(tǒng)，采集EL29、EL32、EL35、EL36和EL38這5個(gè)不同發(fā)育階段的漿果。每次取樣從葡萄樹的兩側(cè)分別采集4串葡萄；從每串葡萄的不同部位采集3粒葡萄，并立即在液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱保存， 待測。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長發(fā)育指標(biāo) 隨機(jī)選取100粒葡萄果實(shí)，采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測定橫縱徑，采用電子天平稱單粒質(zhì)量，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.2 品質(zhì)指標(biāo) 隨機(jī)選取100粒葡萄果實(shí)揉碎過濾取汁，采用數(shù)顯糖度計(jì)測定可溶性固形物含量；采用酸度計(jì)法測定果實(shí)pH；采用斐林試劑熱滴定法測定還原糖含量；采用氫氧化鈉滴定法（參照GB／T 15038-2006）測定可滴定酸含量，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 有機(jī)酸的提取 取部分葡萄樣品在液氮中研磨成粉末。每個(gè)樣品精確稱量1 g，加入10 mL 0.02 mol/L的KH2PO4溶液（pH=2.8）?；旌衔镌?5 ℃水浴中以300 W功率超聲處理30 min，然后在 4 ℃下10 000 r/min離心20 min。用0.22 μm的濾膜過濾上清液，用于高效液相色譜 （HPLC）分析。

1.3.4 HPCL色譜條件 采用WATERS系列高效液相色譜儀，Athena C18-WP色譜柱（150 mm × 4.6 mm × 5 mm）。流動相為0.02?? mol/L? KH2PO4（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8），流速為0.5 mL/min，恒溫40 ℃。施用光電二極管陣列 （PDA）進(jìn)行檢測，波長為 210 nm。

1.3.5 總RNA分離及定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 總RNA的提取使用Pure Plant RNA制備試劑盒（百泰克生物技術(shù)有限公司，北京），對提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度檢測。使用Revert Aid first strand cDNA synthesis kit合成試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 （1 000 ng總RNA）。qRT-PCR分析采用ABI QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR系統(tǒng)（Life Technologies， Carlsbad， 美國）檢測有機(jī)酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平。使用引物見表1。采用兩步qRT-PCR試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京），按照廠家說明書對每個(gè)樣品進(jìn)行3次分析。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法[25]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理，使用IBM SPSS Statistcs 25 進(jìn)行單因素方差分析，顯著性分析采用LSD（L）和Duncans（D）進(jìn)行假定方差齊性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異達(dá)到顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄯善和鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄果實(shí)生長發(fā)育變化

新疆鄯善和山西鄉(xiāng)寧地區(qū)2021年的日平均溫度（℃）、日降水量（mm）、峰值日照時(shí)數(shù)（h）等氣象信息如圖1所示，鄯善地區(qū)葡萄生長季（4月—10月）月均溫較鄉(xiāng)寧地區(qū)高4.76 ℃，最高月均氣溫為33.12 ℃，單日最高氣溫可達(dá)44.11 ℃。在葡萄生長季節(jié)，鄯善地區(qū)共有34 d日最高氣溫超過37 ℃，而鄉(xiāng)寧無單日溫度超過37 ℃。表2為兩個(gè)地區(qū)‘赤霞珠和‘馬瑟蘭葡萄5個(gè)不同發(fā)育階段葡萄漿果生長發(fā)育指標(biāo)參數(shù)。葡萄果實(shí)橫縱徑隨果實(shí)生長發(fā)育呈現(xiàn)先快速增加后逐漸穩(wěn)定的趨勢，百粒漿果質(zhì)量也持續(xù)增加。山西鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)發(fā)育速度更快，且在整個(gè)葡萄發(fā)育周期中，鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄百粒質(zhì)量、橫縱徑均高于鄯善產(chǎn)區(qū)，兩個(gè)品種表現(xiàn)趨勢一致。

2.2 鄯善和鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)的差異分析

由圖2可知，在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中，果實(shí)還原糖含量和可溶性固形物隨果實(shí)發(fā)育逐漸增加，EL35（轉(zhuǎn)色開始）階段開始加速積累，山西鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄果實(shí)還原糖含量積累速度較快，但在采收時(shí)，兩地區(qū)葡萄還原糖與可溶性固形物含量相差較小，差異并不顯著。轉(zhuǎn)色后果實(shí)可滴定酸含量迅速下降，其中新疆鄯善‘馬瑟蘭葡萄果實(shí)可滴定酸含量變化最大，較最大值降低88.3%；鄯善‘赤霞珠可滴定酸含量下降81.6%；山西鄉(xiāng)寧‘赤霞珠下降79.7%；山西鄉(xiāng)寧‘馬瑟蘭下降80.9%；新疆鄯善下降幅度均高于山西鄉(xiāng)寧。鄯善地區(qū)葡萄可滴定酸含量顯著低于鄉(xiāng)寧，pH則高于鄉(xiāng)寧；且轉(zhuǎn)色期之后，鄯善地區(qū)葡萄果實(shí)pH迅速升高，‘赤霞珠與‘馬瑟蘭葡萄果實(shí)pH分別在轉(zhuǎn)色階段提高32.9%和? 39.8%。結(jié)果表明在達(dá)到相應(yīng)技術(shù)成熟度時(shí)，新疆鄯善地區(qū)的有機(jī)酸含量更低。

2.3 鄯善和鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄果實(shí)有機(jī)酸含量的差異分析

如圖3所示，總體來看‘赤霞珠與‘馬瑟蘭葡萄在兩個(gè)地區(qū)的有機(jī)酸含量都存在較大差異，對于葡萄主要有機(jī)酸，鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)酒石酸和蘋果酸的含量高于鄯善，其他酸的含量在兩個(gè)地區(qū)也有顯著差異。葡萄中有機(jī)酸的積累主要發(fā)生在轉(zhuǎn)色前，尤其是酒石酸和蘋果酸，從EL29 （坐果期）至 EL35（轉(zhuǎn)色前）階段，對于赤霞珠葡萄，果實(shí)酒石酸含量在兩個(gè)地區(qū)增加了0.7～1.2倍，而蘋果酸含量則升高1.4～3.4倍；‘馬瑟蘭葡萄酒石酸含量在此階段兩個(gè)地區(qū)均增加了1.4倍左右；而蘋果酸含量增加約3.5倍。相較于‘馬瑟蘭，‘赤霞珠葡萄有機(jī)酸積累速率在兩個(gè)地區(qū)出現(xiàn)較大差異；鄯善地區(qū)葡萄有機(jī)酸含量增加速率快，但含量低，轉(zhuǎn)色后葡萄果實(shí)酒石酸含量保持在7.23～8.96 mg/粒，鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄果實(shí)酒石酸含量顯著高于鄯善，達(dá)到了9.06～10.75 mg/粒。在轉(zhuǎn)色之后酒石酸含量整體呈穩(wěn)定趨勢，蘋果酸開始降低，鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)蘋果酸含量下降程度更高，‘赤霞珠與‘馬瑟蘭分別較最大值下降了66.6%和74.7%，且在采收階段，鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)蘋果酸含量低于鄯善，這在兩個(gè)品種中是一致的。轉(zhuǎn)色前，鄉(xiāng)寧‘赤霞珠葡萄中抗壞血酸含量呈略微下降趨勢，其余樣品中抗壞血酸和檸檬酸含量明顯升高，但整體變化不顯著（小于1 mg/粒）?！嘞贾槠咸褭幟仕岷吭谡麄€(gè)發(fā)育周期在兩地區(qū)沒有表現(xiàn)出顯著差異，而鄯善地區(qū)‘馬瑟蘭葡萄檸檬酸含量則顯著高于鄉(xiāng)寧。

2.4 鄯善和鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄果實(shí)有機(jī)酸相關(guān)基因表達(dá)的差異分析

通過查詢NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，結(jié)合已發(fā)表的其他物種有機(jī)酸相關(guān)基因作為參考，篩選出9個(gè)基因，其中酒石酸代謝相關(guān)基因3個(gè)（列出來），蘋果酸代謝相關(guān)基因2個(gè)（列出來），抗壞血酸代謝相關(guān)基因1個(gè)（列出來），檸檬酸代謝相關(guān)基因1個(gè)（列出來），蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因2個(gè)（列出來）。采用NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物進(jìn)行qRT-PCR分析（表1）。

如圖4所示，以鄉(xiāng)寧地區(qū)EL29（坐果期）階段采樣的葡萄果實(shí)為對照，在葡萄的各個(gè)發(fā)育階段觀察赤霞珠與馬瑟蘭在兩個(gè)地區(qū)有機(jī)酸基因表達(dá)的變化。其中酒石酸合成基因Vv2KGR和VvIDH3在葡萄果實(shí)發(fā)育早期表達(dá)較高，但在葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色后（酒石酸合成結(jié)束）后，其轉(zhuǎn)錄仍然存在；VvIDH2在果實(shí)發(fā)育后期表達(dá)量顯著升高。VvcyMDH是蘋果酸合成關(guān)鍵基因，催化草酰乙酸向蘋果酸的轉(zhuǎn)化，在果實(shí)發(fā)育的大部分階段，鄯善地區(qū)赤霞珠與馬瑟蘭葡萄VvcyMDH的表達(dá)均高于鄉(xiāng)寧；VvNAD-ME催化蘋果酸脫羧形成丙酮酸，結(jié)果表明VvNAD-ME在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)量逐漸增加。VvVHA-A與VvVHP是植物體內(nèi)兩種重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠引起的質(zhì)子濃度梯度從而為物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸提供驅(qū)動力，兩種質(zhì)子泵的轉(zhuǎn)錄變化趨勢不同，葡萄成熟后VvVHP的表達(dá)量增加，其中鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄的表達(dá)量高于鄯善，這在馬瑟蘭品種中尤為顯著；新疆地區(qū)葡萄VvVHA-A基因表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育過程中逐漸降低。VvGalLDH催化L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯合成抗壞血酸，其表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且鄯善地區(qū)葡萄VvGalLDH的表達(dá)顯著高于鄉(xiāng)寧?？傮w而言，兩個(gè)地區(qū)赤霞珠與馬瑟蘭葡萄有機(jī)酸基因表達(dá)的變化呈現(xiàn)出不同表達(dá)模式。

3 討論與結(jié)論

中國東西跨度大，新疆鄯善與山西鄉(xiāng)寧地區(qū)氣候條件存在顯著差異，根據(jù)Xie等[26]的研究模型，新疆鄯善位于溫暖干旱氣候，光熱條件充足，但降水較少；新疆鄯善7-9月日照時(shí)數(shù)較山西鄉(xiāng)寧地區(qū)多出200～300 h[27]。在葡萄成熟階段，鄯善平均溫度較高，溫度的升高促進(jìn)營養(yǎng)吸收，縮短繁殖周期，從而使?jié){果的發(fā)育階段向生長季節(jié)的溫暖月份轉(zhuǎn)移。本研究中，在達(dá)到相同的技術(shù)成熟度的條件下，新疆鄯善地區(qū)葡萄果粒大小及橫縱徑更小，表明新疆鄯善地區(qū)葡萄果實(shí)發(fā)育階段有向溫暖月份轉(zhuǎn)移的趨勢。葡萄果粒大小及橫縱徑的影響因素很多，除了光熱因素外，有研究表明水分狀況[28-29]等也可能改變葡萄果實(shí)大小。本研究發(fā)現(xiàn)新疆鄯善地區(qū)和山西鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)還原糖和可溶性固形物含量在果實(shí)發(fā)育的部分階段存在差異，但在EL36（轉(zhuǎn)色完成）階段后的差異較?。欢袡C(jī)酸的積累存在顯著差異，新疆鄯善葡萄果實(shí)可滴定酸含量低，pH更高，這與Xie等[26]在5個(gè)不同氣候特征地區(qū)檢測到的‘赤霞珠葡萄糖酸含量變化一致。結(jié)果表明，氣候因素對葡萄果實(shí)發(fā)育有顯著影響，鄯善地區(qū)炎熱干燥的氣候可顯著降低葡萄果實(shí)的酸含量。

葡萄是典型的酒石酸水果。酒石酸和蘋果酸占總酸的90%以上，此外還有少量檸檬酸、抗壞血酸、琥珀酸和其他有機(jī)酸[30]。本研究對4種主要的有機(jī)酸，包括酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸和檸檬酸進(jìn)行了定量分析。兩個(gè)地區(qū)的‘赤霞珠和‘馬瑟蘭葡萄果實(shí)在有機(jī)酸含量上都表現(xiàn)出很大的差異。對于兩種主要有機(jī)酸酒石酸和蘋果酸，在鄉(xiāng)寧地區(qū)的含量均高于鄯善，這在兩個(gè)品種中是一致的。研究表明，在葡萄發(fā)育的早期階段，適度升高溫度會加速漿果生長、蘋果酸和酒石酸的積累，然而當(dāng)受到嚴(yán)重?zé)崦{迫時(shí)，酒石酸和蘋果酸的合成就會受到抑制[31-32]。此外，兩個(gè)地區(qū)的其他酸水平也有顯著差異，結(jié)果表明在葡萄發(fā)育過程中，由于糖的積累和糖酵解作用的抑制，有機(jī)酸（主要為蘋果酸與檸檬酸）作為TCA循環(huán)和呼吸、糖異生、氨基酸相互轉(zhuǎn)化等途徑的重要碳源而被消耗；高溫加速葡萄漿果代謝，促進(jìn)了有機(jī)酸的降解，是有機(jī)酸積累差異的主要因素。葡萄中有機(jī)酸的積累主要在轉(zhuǎn)色（EL35）前，尤其是酒石酸和蘋果酸水平的增加；轉(zhuǎn)色期是葡萄酸積累的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，在此之后可滴定酸含量的顯著下降主要是由于蘋果酸含量的下降，而酒石酸在果實(shí)成熟后并不參與植物代謝在轉(zhuǎn)色后含量保持穩(wěn)定，這與前人的研究結(jié)果是一致的[33]。在本研究中，抗壞血酸含量在轉(zhuǎn)色期間（EL35到EL36）含量突然增加，隨后在采樣前含量下降，由于抗壞血酸為酒石酸合成的前體，推測酒石酸合成在轉(zhuǎn)色期停止，從而中斷了抗壞血酸向酒石酸的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致其在轉(zhuǎn)色完成后大量積累。

2KGR和L-IDH是已知與酒石酸合成有關(guān)的酶；L-IDH有3種異構(gòu)體， VvIDH3與酒石酸生物合成密切相關(guān)[5]。? Vv2KGR和 VvIDH3基因在葡萄果實(shí)發(fā)育早期表達(dá)較高，但在葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色完成后，其轉(zhuǎn)錄仍然存在。Wen等[34]對葡萄發(fā)育過程中IDH蛋白水平的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)IDH水平在幼果期急劇上升，花后4～6周后達(dá)到峰值，隨后發(fā)育階段逐漸下降。磷酸烯醇丙酮酸（PEP）是糖酵解途徑中的一種中間體，可由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）催化生成草酰乙酸（OAA），再由胞質(zhì)NAD依賴性蘋果酸脫氫酶（NAD-cyMDH）還原合成蘋果酸，VvNAD-ME在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)量逐漸增加，并已被證明參與蘋果酸的降解[12]。在本研究中，鄯善地區(qū)‘赤霞珠與‘馬瑟蘭葡萄VvcyMDH的表達(dá)均高于鄉(xiāng)寧，但并未觀察到蘋果酸含量相應(yīng)升高，表明有機(jī)酸含量可能與降解及轉(zhuǎn)運(yùn)基因更相關(guān)。液泡膜質(zhì)子泵H+-PPase（VHP）和H+-ATPase（VHA）通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的電位，控制細(xì)胞內(nèi)離子的濃度，從而驅(qū)動蘋果酸和其他有機(jī)酸在植物液泡中的積累與轉(zhuǎn)運(yùn)。鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄VvVHA和VvVHP基因表達(dá)量顯著高于鄯善，這與有機(jī)酸表型結(jié)果一致。鄯善地區(qū)葡萄VvVHA基因表達(dá)量在發(fā)育過程中增加，但在成熟過程中迅速降低，而VvVHP基因則在葡萄轉(zhuǎn)色后期表達(dá)量相對升高。研究表明，VvVHP無法酸化pH超過3.7的液泡，成熟過程中液泡pH的增加與有機(jī)酸含量（主要為蘋果酸）的降低可能是由于VvVHA被VvVHP所取代，從而導(dǎo)致新疆地區(qū)較低的有機(jī)酸含量[35]。GalLDH是植物中催化抗壞血酸生物合成最后一步（L-半乳糖途徑）的關(guān)鍵酶。在鄯善地區(qū)，VvGalLDH表達(dá)量較高，抗壞血酸和酒石酸含量較低。

本文研究了中國兩個(gè)氣候特征顯著不同的產(chǎn)區(qū)——炎熱的新疆鄯善和冷涼的山西鄉(xiāng)寧的‘赤霞珠和‘馬瑟蘭葡萄發(fā)育過程中有機(jī)酸及其相關(guān)基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，新疆鄯善和山西鄉(xiāng)寧葡萄果實(shí)酸的積累存在顯著差異，鄯善地區(qū)葡萄果實(shí)可滴定酸含量低，pH更高。兩個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄有機(jī)酸含量差異顯著，鄉(xiāng)寧地區(qū)葡萄酒石酸、蘋果酸和抗壞血酸含量均高于鄯善，這在兩個(gè)葡萄品種之間沒有差異。此外，與果實(shí)有機(jī)酸的合成和降解的相關(guān)基因不同，液泡膜質(zhì)子泵H+-PPase基因VvVHP在響應(yīng)高溫轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸并改變鄯善地區(qū)葡萄可滴定酸含量中可能發(fā)揮了更關(guān)鍵的作用。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ BALDWIN E A.Fruit flavor，volatile metabolism and consumer perceptions[J].Fruit Quality and Its Biological Basis，2002（8）：89-106.

[2]KLIEWER W M.Sugars and organic acids of Vitis vinifera[J].Plant physiology，1966，41（6）：923-931.

[3]GERS H，CHAVES M，DELROT S.The Biochemistry of the Grape Berry[M].Bentham Science Publishers Ltd：soest，The Netherlands，2012.

[4]MORRIS J，SIMS C，CAWTHON D.Effects of excessive potassium levels on pH，acidity and color of fresh and stored grape juice[J].American Journal of Enology and Viticulture，1983，34（1）：35-39.

[5]BURBIDGE C A，F(xiàn)ORD C M，MELINO V J，et al.Biosynthesis and cellular functions of tartaric acid in grapevines[J].Frontiers in Plant Science，2021，12：309.

[6]DEBOLT S，MELINO V，F(xiàn)ORD C M.Ascorbate as a biosynthetic precursor in plants[J].Annals of Botany，2007，99（1）：3-8.

[7]WHEELER G L，JONES M A，SMIRNOFF N.The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants[J].Nature，1998，393（6683）：365-369.

[8]曹慧玲，舒河霖，邵建輝，等.葡萄果實(shí)酒石酸生物合成研究進(jìn)展[J].中國果樹，2021（4）：8-13.

CAO? H L，SHU H L，SHAO J H，et al.Research progress on biosynthesis of tartaric acid in grape berries[J].China Fruits，2021（4）：8-13.

[9]CAPUCHO I，SAN ROMAO M.Effect of ethanol and fatty acids on malolactic activity of? Leuconostoc oenos[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1994，42：391-395.

[10] ZHAO Q，DU G，WANG S，et al.Investigating the role of tartaric acid in wine astringency[J].Food Chemistry，2023，403：134385.

[11]IGAMBERDIEV A U，BYKOVA N V.Role of organic acids in the integration of cellular redox metabolism and mediation of redox signalling in photosynthetic tissues of higher plants[J].Free Radical Biology and Medicine，2018，122：74-85.

[12]SWEETMAN C，DELUC L G，CRAMER G R，et al.Regulation of malate metabolism in grape berry and other developing fruits[J].Phytochemistry，2009，70（11/12）：1329-1344.

[13]SMART R E，SMITH S M，WINCHESTER R V.Light quality and quantity effects on fruit ripening for Cabernet Sauvignon[J].American Journal of Enology and Viticulture，1988，39（3）：250-258.

[14]SAVOI S，WONG D C，DEGU A，et al.Multi-omics and integrated network analyses reveal new insights into the systems relationships between metabolites，structural genes，and transcriptional regulators in developing grape berries （Vitis vinifera L.） exposed to water deficit[J].Frontiers in Plant Science，2017，8：1124.

[15]ZHANG Z，LIU H，SUN J，et al.Nontarget metabolomics of grape seed metabolites produced by various scion-rootstock combinations[J].Journal of the American Society for Horticultural Science，2020，145（4）：247-256.

[16]RIENTH M，TORREGROSA L，SARAH G，et al.Temperature desynchronizes sugar and organic acid metabolism in ripening grapevine fruits and remodels their transcriptome[J].BMC Plant Biology，2016，16（1）：1-23.

[17]ETIENNE A，GNARD M，LOBIT P，et al.What controls fleshy fruit acidity？ A review of malate and citrate accumulation in fruit cells[J].Journal of experimental botany，2013，64（6）：1451-1469.

[18]KALLSEN C E，SANDEN B，ARPAIA M L.Early navel orange fruit yield，quality，and maturity in response to late-season water stress[J].Horticultural? Science，2011，? 46（8）：1163-1169.

[19]THAKUR A，SINGH Z.Responses of ‘Spring Brightand ‘Summer Brightnectarines to deficit irrigation：Fruit growth and concentration of sugars and organic acids[J].Scientia Horticulturae，2012，135：112-119.

[20]LAKSO A，KLIEWER W M.The influence of temperature on malic acid metabolism in grape berries.II.Temperature responses of net dark CO2 fixation and malic acid pools[J].American Journal of Enology and Viticulture，1978，29（3）：145-149.

[21]VENIOS X，KORKAS E，NISIOTOU A，et al.Grapevine responses to heat stress and global warming[J].Plants，2020，9（12）：1754.

[22]XU D，LI X，WANG S.The research of relationships?? among content of grapes sugar，acid and meteorological conditions in Xinjiang[J].Journal of Arid Land Resources and Environment，2003，17（6）：138-143.

[23]KELLER M.The science of grapevines[M].Academic press，2020.

[24]COOMBE B G.Growth stages of the grapevine：Adoption of a system for identifying grapevine growth stages[J].Australian Journal of Grape and Wine Research，1995，? 1（2）：104-110.

[25]LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[26]XIE S，LEI Y，WANG Y，et al.Influence of continental climates on the volatile profile of Cabernet Sauvignon grapes from five Chinese viticulture regions[J].Plant Growth Regulation，2019，87（1）：83-92.

[27]杜遠(yuǎn)鵬，張一帆，黃文尉，等.葡萄栽培生態(tài)指標(biāo)體系建設(shè)及生態(tài)區(qū)劃[J].中外葡萄與葡萄酒，2022（4）：1-7.

DUY P，ZHANG Y F，HUANG W W， et al.Construction of viticulture ecological? index system and ecological regionalization[J].Sino-Overseas Grapevine & Wine，2022（4）：1-7.

[28]TRIOLO R，ROBY J P，PISCIOTTA A， et al.Impact of vine water status on berry mass and berry tissue development of Cabernet franc （Vitis vinifera L.），assessed at berry level[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2019，99（13）：5711-5719.

[29]尹海寧，王兆祥，王 琳，等.海拔和行向?qū)︶劸破咸压麑?shí)生長發(fā)育及品質(zhì)的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，49（4）：93-101.

YIN?? H? N，WANG ZH X，WANG? L， et al.Effects of altitude and row orientation on growth and quality of wine grape berries[J].Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），2021，49（4）：93-101.

[30]SOYER Y，KOCA N，KARADENIZ F.Organic acid profile of Turkish white grapes and grape juices[J].Journal of Food Composition and Analysis，2003，16（5）：629-636.

[31]GOUOT J C，SMITH J P，HOLZAPFEL B P，et al.Impact of short temperature exposure of? Vitis vinifera L.cv.Shiraz grapevine bunches on berry development，primary metabolism and tannin accumulation[J].Environmental and Experimental Botany，2019，168：103866.

[32]ARRIZABALAGA M，MORALES F，OYARZUN M， et al.Tempranillo clones differ in the response of berry sugar and anthocyanin accumulation to elevated temperature[J].Plant Science，2018，267：74-83.

[33]RSTI J，SCHUMANN M，CLROUX M，et al.Effect of drying on tartaric acid and malic acid in Shiraz and Merlot berries[J].Australian Journal of Grape and Wine Research，2018，24（4）：421-429.

[34]WEN Y Q，LI J M，ZHANG Z Z，et al.Antibody preparation，gene expression and subcellular localization of L-idonate dehydrogenase in grape berry[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2010，74（12）：2413-2417.

[35]TERRIER N，SAUVAGE F-X，AGEORGES A，et al.Changes in acidity and in proton transport at the tonoplast of grape berries during development[J].Planta，2001，? 213（1）：20-28.

Comparative? Analysis of Organic Acid Metabolism in Wine Grape under Two Different Climatic Conditions

Abstract Organic acids，essential flavor compounds in grape berries，are influenced by ambient temperature during berry development.In this study，we compared the difference of organic acid accumulation under two distinct climate types：a hot climate represented by Shanshan in Xinjiang and a cold climate represented by Xiangning in Shanxi.‘Cabernet Sauvignon and ‘Marselan grape varieties were used as materials.The results showed that the grape fruit in Xiangning was larger than that in Shanshan，with significantly lower titratable acid content in grapes from Shanshan and higher pH levesl.Organic acids continued to accumulate before veraison，including tartaric and malic acid，as well as a small amount of citric acid.After veraison，the titratable acid content decreased by 84.8% in Shanshan grapes and 78.5% in Xiangning grapes，with significant degradation of malic acid.Tartaric acid content in ripening grape from Shanshan remained between 7.23-8.96 mg/berry，while that in Xiangning grape was significantly higher，ranging 9.06-10.75 mg/berry; during the grape development，Xiangning grapes exhibited higher levels of tartaric，malic，and ascorbic acids compared to Shanshan grapes，with both varieties showing similar trends.In addition，compared with genes related to malic acid synthesis and degradation，the vacuolar membrane proton pump gene VvVHP may play a more critical role in responding to high temperature to transport malic acid and change the content of titratable acid.

Key words Wine grape; Organic acid; High temperature; Gene expression