釀酒葡萄“蛇龍珠”莖尖復(fù)蘇及生莖培養(yǎng)基的篩選

陳春伶　徐美隆　楊智等

摘要： 以B5改良的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，比較了添加不同濃度6-BA與IBA組合的培養(yǎng)基對(duì)釀酒葡萄“蛇龍珠”莖尖復(fù)蘇及生莖的影響，篩選出適合蛇 龍珠試管苗莖尖復(fù)蘇的培養(yǎng)基為B5（改良）+1 5 mg/L 6-BA+0 05 mg/L [JP3]IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH值5 8～6 0；篩選出適合蛇龍珠試管苗生莖的培養(yǎng)基為B5（改良）+1 5 mg/L 6-BA+ 01 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH值=5 8～6 0。

關(guān)鍵詞： 釀酒葡萄“蛇龍珠”；莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基；生莖培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：S663 104 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0174-02

蛇龍珠，釀酒葡萄品種，別稱解百納；歐亞種，原產(chǎn)法國，為法國的古老品種之一，與赤霞珠、品麗珠是姊妹品種；1892年引入中國，現(xiàn)在山東煙臺(tái)、寧夏等地區(qū)有較多栽培。葡萄莖尖因其頂端分生細(xì)胞分裂生長(zhǎng)速度大于病毒在細(xì)胞間傳遞感染的速度，加之頂端分生組織代謝產(chǎn)生的內(nèi)源激素對(duì)病毒具有鈍化作用 [1]，所以莖尖頂端分生組織通常不含或含少量病毒 [1-5]。因此，通過蛇龍珠莖尖剝離脫毒技術(shù)，獲取無病毒組織，再進(jìn)行組織培養(yǎng)，可得到脫毒的蛇龍珠健康植株。本研究通過篩選脫毒過程中莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基及生莖培養(yǎng)基，以期獲得適合蛇龍珠的優(yōu)良莖尖順利復(fù)蘇生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，為蛇龍珠的無毒苗快繁提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1 1 材料

復(fù)蘇培養(yǎng)材料：4周齡蛇龍珠試管苗莖尖；生莖培養(yǎng)材料：在莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周的葡萄莖尖發(fā)育成的小苗。

1 2 方法

本研究以0 8～1 0 mm的蛇龍珠試管苗莖尖為脫毒處理材料，處理后的莖尖需要復(fù)蘇培養(yǎng)才能生長(zhǎng)為完整的植株。參考Wang等的研究 [6-8]，設(shè)計(jì)試驗(yàn)。莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基及生莖培養(yǎng)基均以B5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)6-BA和IBA 2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行濃度篩選。

1 2 1 復(fù)蘇培養(yǎng)基篩選

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以B5（改良）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)6-BA設(shè)計(jì)1 0、1 5、2 0 mg/L 等3個(gè)水平，對(duì)IBA設(shè) 計(jì)0 05、0 10、0 15、0 20 mg/L等4個(gè)水平，設(shè)計(jì)完全試驗(yàn)，配制培養(yǎng)基（附加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，以形成固體培養(yǎng)基），倒莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基平板；以4周齡蛇龍珠試管苗為材料，解剖鏡下取 0 8～1 0 mm 莖尖于待篩選的莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)平板中，每板15個(gè)莖尖，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)；避光暗培養(yǎng) 3 d，然后光照培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃；光照度2 000～2 500 lx；光照時(shí)間16 h/d。1周后統(tǒng)計(jì)成活率，2周后統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)狀態(tài)。

1 2 2 生莖培養(yǎng)基篩選

根據(jù)文獻(xiàn)資料以B5（改良）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)定6-BA為1 0、1 5、2 0 mg/L，設(shè)完IBA為 0 05、0 10、0 15、0 20、0 30 mg/L 5個(gè)水平，設(shè)計(jì)完全試驗(yàn)，配制生莖培養(yǎng)基（附加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，以形成固體培養(yǎng)基），倒入300 mL玻璃瓶?jī)?nèi)，每瓶60 mL。以莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基處理1、處理5所得到的3周齡莖尖為材料，每瓶生莖培養(yǎng)基接種3～4株葡萄小苗；光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度 （25±2） ℃，光照度2 000～2 500 lx，光照時(shí)間 16 h/d。4周后統(tǒng)計(jì)成活率及生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2 1 不同處理對(duì)蛇龍珠莖尖復(fù)蘇的影響

從表1可以看出，處理1、處理2的莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基莖尖成活率最高，都能達(dá)到100%；處理5、處理6、處理7成活率較高，都在90%以上。

由表2可知，處理1、處理5、處理8莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基莖尖生長(zhǎng)情況好，葉片面積大（圖1），最終得分都在90分以上。

綜合考慮，處理1、處理5莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基是效果好的葡萄莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基。

2 2 不同處理對(duì)蛇龍珠組培苗生莖的影響

從表3可見，莖尖在處理5復(fù)蘇培養(yǎng)基上復(fù)蘇3周后，轉(zhuǎn)入B5（改良）+1 5 mg/L 6-BA+0 1 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的生莖培養(yǎng)基效果最好：輕度褐化、無明顯愈傷、有單株分化、長(zhǎng)勢(shì)好（圖2）；其余培養(yǎng)基則表現(xiàn)為愈傷叢芽、嚴(yán)重褐化、長(zhǎng)勢(shì)過弱或死亡。

3 討論

3 1 莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基篩選

好的莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基不僅莖尖成活率要高，而且莖尖應(yīng)該生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)旺盛。本研究從莖尖成活率和莖尖生長(zhǎng)情況兩方面對(duì)莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基進(jìn)行綜合考量，最終選出成活率高、長(zhǎng)勢(shì)旺盛的2種莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基供后續(xù)研究使用。

6-BA是人工合成的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)細(xì)胞延長(zhǎng)、細(xì)胞分裂、芽形成等作用。IBA也是人工合成的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是IAA的類似物，具有促進(jìn)不定根形成和根生長(zhǎng)的作用。顧沛雯等研究發(fā)現(xiàn)，6-BA和IBA在莖尖復(fù)蘇中是不可缺少的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，不添加6-BA或不添加IBA都不能誘導(dǎo)莖尖萌發(fā) [7]，只有二者共同使用，才能成功誘導(dǎo)莖尖萌發(fā)。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，在莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基中添加IBA比添加NAA效果好，有利于不定根的形成 [6，9]。6-BA的濃度大于0 5 mg/L時(shí)對(duì)小芽的頂端優(yōu)勢(shì)有明顯抑制作用，會(huì)產(chǎn)生大量叢芽；6-BA濃度低于0 5mg/L時(shí)有利于小芽的正常生長(zhǎng)，不易產(chǎn)生大量叢芽。

本研究根據(jù)文獻(xiàn)資料采用賦值加權(quán)的方式將成功復(fù)蘇的莖尖的生長(zhǎng)情況量化，從而易于比較和分析。本研究以葉片寬度為基本參考，根據(jù)復(fù)蘇2周的莖尖生長(zhǎng)情況將葉片寬度分為3類：A類葉片0 8 cm<葉寬≤1 0 cm；B類葉片0 6 cm<葉寬≤0 8 cm；C類葉片0 25 cm<葉寬≤0 6 cm。A類葉片每張賦值1，B類葉片每張賦值0 5，C類葉片每張賦值025。這樣，復(fù)蘇后莖尖的生長(zhǎng)情況得以量化，從而為評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)狀況提供了方法和依據(jù)。

3 2 生莖培養(yǎng)基篩選

莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)、生莖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，各階段的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)，將1～2 mm的4周齡蛇龍珠葡萄試管苗莖尖接種于B5（改良）+1 5 mg/L 6-BA+0 05 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的莖尖復(fù)蘇培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d后，見光正常培養(yǎng)，3周齡時(shí)轉(zhuǎn)入B5（改良）+0 3 mg/L 6-BA+0 2 mg/L IAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L瓊脂的生莖培養(yǎng)基，光照正常培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)入B5（改良）+0 2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+ 1 g/L活性炭的生根培養(yǎng)基，最為合適。此方法處理過的蛇龍珠莖尖成活率高、不易褐化、長(zhǎng)勢(shì)良好。

葡萄生莖培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)中出現(xiàn)大量的愈傷和叢芽現(xiàn)象，其可能原因是6-BA的濃度偏高或添加了IBA而不是IAA。董曉玲等研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中6-BA濃度偏高會(huì)導(dǎo)致小芽難以生長(zhǎng)成為較長(zhǎng)的幼莖并產(chǎn)生叢芽 [9]。如果培養(yǎng)基中添加IBA而不是IAA則會(huì)導(dǎo)致芽叢生長(zhǎng)緩慢并且難以生長(zhǎng)為較長(zhǎng)的幼莖。

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