達(dá)雷妥尤單抗治療患者檢出抗-K、抗-Wra的血清學(xué)分析

黃嫻 趙瑛 李彤彤 楊揚(yáng) 馬蕾 解金輝 種靖慧

(天津市血液中心，天津 300110)

CD38 在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，抗CD38 單克隆抗體達(dá)雷妥尤靶向作用于CD38，在多發(fā)性骨髓瘤治療中取得明顯療效。 CD38 同時(shí)也少量表達(dá)于紅細(xì)胞表面，達(dá)雷妥尤單抗可干擾輸血相容性檢測(cè)。 最常用的消除達(dá)雷妥尤單抗干擾的方法是使用二硫蘇糖醇(DTT) 處理紅細(xì)胞，其不影響ABO、Rh 及大部分其他系統(tǒng)抗原，但會(huì)影響Kell、LW、Yt、Dombrock 等系統(tǒng)的抗原[1]。 我們?cè)? 例使用達(dá)雷妥尤單抗的患者血漿內(nèi)檢出抗-K、抗-Wra，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

女，72 歲，有妊娠史，近期多次輸血史。 臨床診斷為多發(fā)性骨髓瘤，2 周前合并肺炎，呼吸道病原體檢測(cè)為鮑曼不動(dòng)桿菌陽(yáng)性。 初次使用達(dá)雷妥尤單抗1 周后，醫(yī)院因抗篩陽(yáng)性配血困難送至本中心進(jìn)行抗體鑒定和交叉配血。

1.2 試劑與儀器

抗-A、抗-B(批號(hào):20220712)，反定型細(xì)胞(批號(hào):20235339)，抗-C3d(批號(hào):20225202)，抗-(IgG＋C3d)(批號(hào):20225001)，木瓜酶(批號(hào):20230328)，均為上海血液生物試劑。 抗-D(IgM， 批 號(hào):8000453311)， 抗 篩 細(xì) 胞(批 號(hào):8000460052，8000460260)、 譜 細(xì) 胞(批 號(hào): 8000460054，8000460122，8000460262)，均為Sanquin 公司產(chǎn)品。 抗-K(IgM，批號(hào):OKM215-1)，抗-k(IgG，批號(hào):MkM267-1)，抗-IgG(批號(hào):H0MIgG052-1)均為CE-IMMUNDIAGNOSTIKA 公司產(chǎn)品。 凝聚胺試劑(長(zhǎng)春博德，批號(hào):20230703)，二磷酸氯喹(長(zhǎng)春博德，批號(hào):20230602)，胰蛋白酶(北京索萊寶，批號(hào):304U043)，低離子抗人球蛋白卡(達(dá)亞美，批號(hào):8461299326)。 離心機(jī)(KA2200，日本久保田)，水浴箱(SSW-600-2S，上海博迅)，毛細(xì)管離心機(jī)(1-14，Sigma 公司)。

1.3 方法

1.3.1血型鑒定

ABO、RhD 和K 抗原檢測(cè)采用試管法。 抗-k 和抗-Wra試劑血清為IgG 類(lèi)，患者直抗陽(yáng)性，患者紅細(xì)胞經(jīng)二磷酸氯喹充分放散后采用試管抗人球法檢測(cè)k 和Wra抗原。 Wra抗原和k 抗原分別設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)照細(xì)胞選自譜細(xì)胞，與患者細(xì)胞同時(shí)采用二磷酸氯喹方法處理并用試管抗人球法檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照2＋，陰性對(duì)照無(wú)凝集，結(jié)果有效。

1.3.2直抗、抗體篩查、抗體鑒定、交叉配血

均按全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第4 版操作，0.2 mol/L DTT 處理紅細(xì)胞、0.01 mol/L DTT 區(qū)分IgM 和IgG 抗體、抗體效價(jià)步驟參照AABB 技術(shù)手冊(cè)第20 版，毛細(xì)管離心按參考文獻(xiàn)[2]方法操作。 鹽水法均為室溫直接離心讀取結(jié)果。

1.3.3酶處理細(xì)胞

按照試劑說(shuō)明書(shū)配制木瓜酶、胰蛋白酶溶液。 木瓜酶處理紅細(xì)胞:1%木瓜酶與2%～5%紅細(xì)胞懸液1 ∶1混勻，37℃孵育10 min，3 洗紅細(xì)胞后配成懸液。 胰蛋白酶處理紅細(xì)胞:0.5%胰蛋白酶與2%～5%紅細(xì)胞懸液3 ∶1混勻，37℃孵育20 min，3 洗紅細(xì)胞后配成懸液。 酶處理紅細(xì)胞均評(píng)估合格，評(píng)估步驟參照AABB 技術(shù)手冊(cè)(第20 版)。

2 結(jié)果

2.1 血型鑒定

患者血型為O RhD(＋)，K-k＋，Wra-。

2.2 直接抗人球試驗(yàn)

采用卡式抗人球蛋白方法，抗IgG:2＋s，抗C3d:w＋，抗-(IgG＋C3d):2＋s。 患者細(xì)胞經(jīng)毛細(xì)管離心后近心端抗-(IgG＋C3d):2＋s，遠(yuǎn)心端抗-(IgG＋C3d):2＋。

2.3 抗體篩查、抗體鑒定

患者血漿鹽水法、凝聚胺法與抗篩3 號(hào)K 抗原陽(yáng)性細(xì)胞凝集，卡式抗人球蛋白方法均陽(yáng)性，見(jiàn)表1。 譜細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2，鹽水法格局為抗-K，凝聚胺法除了抗-K，可能含抗-Wra。 加做不同批號(hào)的部分譜細(xì)胞，確證為抗-K、抗-Wra。

表1 患者血漿與抗篩細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果Table 1 Plasma and screening cells reaction results

表2 Sanquin 譜細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果Table 2 Plasma and panel cells(Sanquin)reaction results

2.4 達(dá)雷妥尤單抗影響分析

采用卡式抗人球蛋白方法，患者血漿與未處理的抗篩細(xì)胞反應(yīng)均為2＋w～2＋，與0.2 mol/L DTT 處理后的抗篩細(xì)胞不凝集，與胰蛋白酶處理后的抗篩細(xì)胞不凝集，與木瓜酶處理后的抗篩細(xì)胞反應(yīng)均為3＋(表1)。 該患者1 周前使用達(dá)雷妥尤單抗，0.2 mol/L DTT 或胰蛋白酶處理細(xì)胞，可消除達(dá)雷妥尤單抗對(duì)抗篩的干擾，而木瓜蛋白酶不能。 患者自身細(xì)胞酸放散液與抗篩細(xì)胞均陽(yáng)性2＋w～2＋，與0.2 mol/L DTT 處理后的抗篩細(xì)胞不凝集，與胰蛋白酶處理后的抗篩細(xì)胞不凝集，放散液抗體應(yīng)為達(dá)雷妥尤單抗。

2.5 DTT、酶處理對(duì)K 抗原的影響

抗篩3 號(hào)K 抗原陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)0.2 mol/L DTT 處理后，與抗-K 試劑血清不凝集；該細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶或木瓜酶處理后，與抗-K 試劑血清凝集，強(qiáng)度與處理前相同均為3 ＋。 0.2 mol/L DTT 處理紅細(xì)胞可破壞K 抗原，而胰蛋白酶和木瓜酶不會(huì)破壞。

2.6 DTT、酶處理對(duì)達(dá)雷妥尤單抗治療患者IgG 抗-k 的檢測(cè)效果

由于患者血樣量的限制，使用76 d 后送檢的患者血清，此血清中的抗-K、抗-Wra已測(cè)不出，患者持續(xù)使用達(dá)雷妥尤單抗，仍干擾間接抗人球蛋白試驗(yàn)。 患者血清與IgG 抗-k試劑血清按4 ∶1比例混合，加抗-k 前后檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。 再次證明DTT、胰蛋白酶處理可排除達(dá)雷妥尤單抗干擾，而木瓜酶不能。 DTT 處理漏檢IgG 抗-k，而胰蛋白酶處理可檢出IgG 抗-k。

表3 DTT、酶處理對(duì)達(dá)雷妥尤單抗治療患者IgG 抗-k 的檢測(cè)Table 3 DTT / enzyme treatment for the detection of IgG anti-k in patient treated with daratumumab

2.7 抗體性質(zhì)

未處理的患者血漿與抗篩3 號(hào)K 抗原陽(yáng)性細(xì)胞在鹽水介質(zhì)凝集，0.01 mol/L DTT 處理患者血漿的IgM 抗體后，鹽水法與抗篩3 號(hào)細(xì)胞不凝集，卡式抗人球蛋白方法與胰蛋白酶處理后的抗篩3 號(hào)細(xì)胞不凝集，抗-K 為IgM 類(lèi)。 患者血漿與譜細(xì)胞16 號(hào)Wra抗原陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng)，鹽水法陰性，凝聚胺法凝集1＋，胰蛋白酶處理細(xì)胞后卡式抗人球蛋白方法凝集2＋。 0.01 mol/L DTT 處理患者血漿的IgM 抗體后，與胰蛋白酶處理后的16 號(hào)譜細(xì)胞卡式抗人球蛋白方法凝集1＋，抗-Wra為IgG 類(lèi)。 取O 型、K-k＋紅細(xì)胞與患者血清4℃吸收，56℃熱放散，放散液與K＋k-細(xì)胞不凝集。 本例抗-K不屬于類(lèi)自身抗體，為同種抗體。

2.8 抗體效價(jià)及持續(xù)檢測(cè)

使用K＋k-細(xì)胞，抗-K 鹽水法效價(jià)4，凝聚胺法效價(jià)8。使用Wra＋細(xì)胞，抗-Wra凝聚胺法效價(jià)2，胰蛋白酶處理細(xì)胞后卡式抗人球蛋白方法效價(jià)4。 持續(xù)檢測(cè)之后該患者歷次送檢血漿的效價(jià)，抗-K 鹽水法: 11 d 后效價(jià)4， 23 d 后效價(jià)2，32 d 后效價(jià)1。 39 d 后，鹽水法室溫直接離心不凝集，4℃15 min 恢復(fù)室溫后與K＋k-細(xì)胞凝集，強(qiáng)度1＋，76 d 后測(cè)不出抗-K。 抗-Wra凝聚胺法:11 d 后效價(jià)2，23 d 后效價(jià)2，32 d 后效價(jià)1，39 d 后效價(jià)1，76 d 后測(cè)不出抗-Wra。

2.9 交叉配血

選擇O 型，K-k＋，Wra-的懸浮紅細(xì)胞2 U 與患者配血，鹽水法、凝聚胺法主次側(cè)均陰性，卡式抗人球蛋白方法主次側(cè)均2＋，0.2M DTT 處理獻(xiàn)血者紅細(xì)胞后卡式抗人球蛋白方法主側(cè)為陰性。 患者輸注效果良好，無(wú)輸血不良反應(yīng)。 之后繼續(xù)此輸血策略，臨床反饋安全有效。

3 討論

Kell 血型是抗人球蛋白方法檢出的第1 個(gè)血型抗體，白種人K 抗原陽(yáng)性約為9%[3]，抗-K 是白種人群中除ABO 和Rh 系統(tǒng)以外最常見(jiàn)的抗體，可導(dǎo)致急性和遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)和胎兒新生兒溶血病。 抗-K 通常是IgG 抗體，多為IgG1，常對(duì)低離子強(qiáng)度溶液不敏感，凝聚胺法或低離子介質(zhì)的抗人球蛋白法有漏檢的可能。 抗-K 的產(chǎn)生主要分為3種:1)大多數(shù)因懷孕或輸血免疫刺激產(chǎn)生；2)少量病例在自身抗體的患者血清中檢出類(lèi)自身抗-K[4]；3)少量病例疑似微生物感染所致。 Marsh 等[5]報(bào)道1 例無(wú)輸血史的新生兒患菌痢，檢出IgM 抗-K，其母親血清內(nèi)未檢出，2 個(gè)多月后患兒康復(fù)，抗-K 也未再檢測(cè)出。 Kanel 等[6]報(bào)道1 例無(wú)免疫史的肺結(jié)核患者產(chǎn)生IgM 抗-K，可能與結(jié)核分枝桿菌有關(guān)。細(xì)菌感染導(dǎo)致的K 免疫還可能與摩氏摩根菌相關(guān)，而摩氏摩根菌感染者的抗-K 可能由IgA 類(lèi)轉(zhuǎn)化而來(lái)[7]。

中國(guó)漢族人群K 抗原頻率極低，約為0.07%，抗-K 罕見(jiàn)，萬(wàn)方和知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)共7 例報(bào)道[8-14]，多為IgG 類(lèi)，2例為IgM 和IgG 混合抗體，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)僅IgM 抗-K 報(bào)道。莊光艷等[11]發(fā)現(xiàn)1 例無(wú)輸血史的男性患者，臨床診斷為慢性腎功能不全，使用鹽水法和卡式抗人球蛋白方法檢出IgM和IgG 混合抗-K。 李小飛等[12]在1 例產(chǎn)婦血清中檢出IgM和IgG 混合抗-K，在鹽水法、凝聚胺法、卡式抗人球蛋白方法均有凝集，導(dǎo)致新生兒溶血病。 本文患者有多次輸血史，但患者紅細(xì)胞與抗-K 試劑反應(yīng)陰性，未出現(xiàn)混合視野凝集，患者紅細(xì)胞經(jīng)毛細(xì)管離心，近心端和遠(yuǎn)心端直抗凝集強(qiáng)度差異不大，均提示近期未輸注K 抗原陽(yáng)性的血液。 如有條件，應(yīng)檢測(cè)患者歷次輸注血液的K 抗原以排除免疫因素。 吸收放散試驗(yàn)和患者自身細(xì)胞放散液的結(jié)果顯示本例抗-K 為同種抗體，而非自身抗體。 本例患者確診為多發(fā)性骨髓瘤同時(shí)感染肺炎，革蘭氏陰性的鮑曼不動(dòng)桿菌陽(yáng)性，抗-K 為IgM類(lèi)，產(chǎn)生原因不排除與細(xì)菌感染相關(guān)。

抗-Wra屬于Diego 系統(tǒng)的抗體，相對(duì)常見(jiàn)，大多為聯(lián)合其他同種抗體尤其是自身抗體時(shí)發(fā)現(xiàn)[15]。 抗-Wra由天然或免疫介導(dǎo)產(chǎn)生，為IgG、IgM 或兩者都有，部分抗-Wra是鹽水介質(zhì)抗體，大多數(shù)由抗人球蛋白試驗(yàn)檢出[4]。 Wra抗原為低頻抗原，抗原分布＜0.01%[16]，有地區(qū)差異，溫機(jī)智等[17]發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)Wra抗原頻率為1 /1 000，褚曉月等[18]研究陜西地區(qū)Wra抗原分布頻率為1 /7 490。 本例抗-Wra為IgG，可由抗人球蛋白試驗(yàn)檢出。 由于K 和Wra抗原陽(yáng)性率極低，交叉配血基本可盲配。

CD38 分子是兼具受體及外切酶活性的Ⅱ型跨膜糖蛋白，參與細(xì)胞黏附與跨膜信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，達(dá)雷妥尤單抗是1種人源化、抗CD38 IgG1 單克隆抗體。 治療多發(fā)性骨髓瘤的同時(shí)，達(dá)雷妥尤單抗與紅細(xì)胞表面的CD38 抗原結(jié)合，引起間接抗球蛋白試驗(yàn)全凝集，通常1＋～2＋，干擾相容性檢測(cè)，停止使用達(dá)雷妥尤單抗后，其對(duì)間抗的影響可能會(huì)持續(xù)2 ～6 個(gè)月。 目前克服CD38 單抗對(duì)輸血相容性檢測(cè)干擾的方法主要有[19]:1)DTT 處理紅細(xì)胞，是目前國(guó)際上消除CD38單抗干擾最常用的方法，DTT 裂解CD38 分子胞外區(qū)的二硫鍵，使CD38 抗原變性，阻止其與CD38 單抗結(jié)合。 但DTT也會(huì)使Kell 系統(tǒng)等抗原變性，故當(dāng)高加索人種患者使用CD38 單抗后有輸血需求時(shí)，推薦做Kell 同型輸注。 我國(guó)人群基本都為K-k＋型，但本試驗(yàn)提示使用DTT 處理紅細(xì)胞可漏檢Kell 系統(tǒng)IgG 抗體。 2)凝聚胺試驗(yàn)該方法簡(jiǎn)單快速，但同樣對(duì)Kell 系統(tǒng)的抗體檢測(cè)缺乏足夠的靈敏度。 CD38分子在胞外帶負(fù)電荷的羧基，在低離子環(huán)境下極易與凝聚胺分子結(jié)合，進(jìn)而可以干擾紅細(xì)胞表面CD38 分子與達(dá)雷妥尤單抗的結(jié)合[20]。 本例患者血清中的抗-K 在凝聚胺介質(zhì)仍可與K 抗原陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生凝集，與之前報(bào)道的某些IgM抗-K 類(lèi)似。 3)其它目前使用較少的方法，包括蛋白水解酶法、紅細(xì)胞表型分型和基因型分型、中和蛋白試驗(yàn)。 其中蛋白水解酶法的研究包括胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶對(duì)去除達(dá)雷妥尤單抗干擾的效果，患者血漿和自身細(xì)胞放散液的結(jié)果均證明胰蛋白酶有效。 在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)例其他患者血清時(shí)，也發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶可消除達(dá)雷妥尤單抗的干擾。 胰蛋白酶可以切割CD38 的表位和酶活位點(diǎn)而不會(huì)降解Kell 系統(tǒng)抗原。 但是胰蛋白酶會(huì)影響很多其他抗原，如M，N，EnaTS， Ge2，Ge3，Ge4，Ch /Rg，Duffy 和Lutheran 等[19]，造成常見(jiàn)抗體的漏檢。 胰蛋白酶還可能引起非特異性凝集，它去除CD38 單抗干擾的效果還需更多實(shí)驗(yàn)研究。 目前去除CD38 單抗干擾的常用方法是DTT 處理細(xì)胞和凝聚胺試驗(yàn)，若懷疑掩蓋同種抗體，比如Kell 系統(tǒng)的抗體時(shí)，胰蛋白酶處理細(xì)胞可提供思路和參考。