同種異體富血小板血漿在創(chuàng)面修復中的應用及展望

劉凌 盧黎琦 劉曹毅 張靜薇

(1.中國融通醫(yī)療健康集團有限公司 成都八一骨科醫(yī)院 康復醫(yī)學科，四川 成都 610012；2.成都市第二人民醫(yī)院 輸血科)

自1977 年，Harke 等[1]首次從全血中分離制備富血小板血漿(platelet rich plasma， PRP)在心臟外科手術患者中獲得良好的治療效果后，PRP 研究已進行了40 多年。 自體PRP 在骨科手術、眼科、牙科和皮膚創(chuàng)面修復中已被公認是安全有效的治療方法[2-5]。 同種異體PRP(以下簡稱異體PRP)因其在免疫原性、法律和倫理學的擔憂，研究相對有限。 異體PRP 在臨床應用的有效性和安全性仍有待考證。難治創(chuàng)面因再上皮化困難，感染、截肢、骨髓炎或全身感染的風險較常規(guī)創(chuàng)面增加，且持續(xù)的疼痛和精神壓力進一步削弱了患者的生活質量并增加了社會醫(yī)療負擔[6]，有必要采用療效更可靠的新興治療手段。 鑒于部分難治性創(chuàng)面患者不適合采集自體PRP，來源于血庫或特定捐贈者的異體PRP 因具有相對穩(wěn)定的供應量和可靠的質量對此類患者可能具有積極意義，也有利于有效地利用血液資源。 因此，本文旨在闡述異體PRP 在難治性創(chuàng)面愈合中的有效性和安全性，為其應用于創(chuàng)面修復提供依據。

1 同種異體PRP 的創(chuàng)面修復原理

難治性或慢性創(chuàng)面周圍生物活性因子的局部濃度、穩(wěn)定性和生物利用度顯著降低，間充質細胞表現型改變；伴隨創(chuàng)面處基質金屬蛋白酶的局部活性增高，抑制細胞增殖和血管生成，導致其止血、炎癥、細胞增殖、遷移和組織重塑/成熟等階段存在不同程度的交叉、重合和延遲[7-9]。 與自體PRP 類似，異體PRP 通過提供富集生長因子、高濃度細胞因子和抗菌蛋白等，促進細胞增殖、分化、基質合成、組織再生和修復以促進傷口愈合[8-9]。 PRP 促進創(chuàng)面修復的原理簡述如下:1)PRP 富含分泌生長因子和功能蛋白質，包括血管內皮生長因子、血小板源性生長因子和表皮生長因子等可促進成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞和間充質干細胞(MSCs)等細胞的增殖、分化和遷移[5，9-10]；2)PRP 中的纖維蛋白原、纖維連接蛋白和纖維粘連蛋白作為細胞粘附分子促進上皮和血管細胞的遷移和穩(wěn)定，以及維持因子持續(xù)釋放[7，11]；3)PRP 不僅可以通過釋放多種抗菌肽通過細菌內外膜的通透性，還可以阻礙蛋白質合成以及影響DNA 合成或抑制酶活性，產生抗菌和輔助抗生素的作用[9]；4)參與止血、血管生成、膠原合成、受損組織的血管新生和重建[12]。

2 同種異體PRP 治療的優(yōu)越性和局限性

2.1 自體PRP 臨床應用的局限性

在很大程度上，PRP 療法的有效性依賴于足夠血小板的數量的和良好的血小板功能[13]。 遺憾的是PRP 的數量和質量不可避免地受到PRP 的制備和激活方式以及供體的性別、年齡和伴隨疾病狀態(tài)等的干擾[14-15]，舉例而言:男性捐獻者的PRP 含有更多的抗炎癥因子和生長因子[16]；老年捐獻者的血小板計數相對中年人減少且長期存活率降低[15]；合并糖尿病的供體相對健康供體具有表達減少的血小板衍生生長因子和降低的細胞增殖活性[17]。 由此，糖尿病、動脈硬化閉塞癥、慢性靜脈功能不全以及營養(yǎng)不良等合并癥雖然并非采集PRP 的絕對禁忌，卻因傷口炎癥失衡、血栓形成、生長因子分泌減少風險增高而易于發(fā)生延遲修復[9，18]；同時，采集自體PRP 過程中伴隨的紅細胞和白細胞丟失可能會進一步導致健康狀況惡化[19]。 此外，部分臨床人群還存在采集自體PRP 的相對或絕對禁忌:1)血小板計數(Plt) ＜120×109/L 或貧血[8]；2)出凝血異常，如存在凝血因子或者血小板缺乏或功能異常的出血性疾??；使用影響出凝血功能以及抗血小板功能藥物等[8]；3)有效循環(huán)血量不足，如大量失血、心血管疾病和嚴重燒傷等[20]；4)中重度全身感染、營養(yǎng)不良和耗竭體質等慢性疾病，如惡性腫瘤[18]；5)采集或應用衍生物存在安全性風險，如新生兒和妊娠期婦女[19]。 異體PRP 的運用可能對此類患者具有積極的臨床意義。

2.2 異體PRP 臨床應用的理論優(yōu)勢

基于150 多年前的異體共生實驗，當兩只動物共享同一套血液循環(huán)時，年老動物的大腦、心臟和肌肉功能都獲得了不同程度的改善，提示年輕動物血液中含有促進再生和修復的分子[21]。 Katcher 等[22]通過定期向中年大鼠注射來自年輕大鼠的純化血漿，觀察到后者生理年齡降低和生存期延長，進一步提示年輕動物血漿中含有能促使受體動物干細胞恢復活力的特殊因子。 由此推測來自特定的年輕供體的異體PRP 可能比老年自體PRP 具有更豐富的活性成分。 不僅如此，源自血庫健康獻血者的PRP 可能具有更穩(wěn)定和可重復的治療效果，原因如下:1)捐獻者的病理因素影響少[18]；2)制備條件標準，如離心速率、離心溫度、處理技術以及防腐溶液的組成在歐美以及我國的制備標準中均有明確規(guī)定，以避免因離心速度導致的PRP 激活[23-25]；3)細胞成分穩(wěn)定，具有高度標準化的血小板計數、剩余白細胞和紅細胞含量[23]；4)供應相對豐富。

2.3 異體PRP 臨床應用安全性的芻議

總所周知，異體PRP 的輸注不可避免地存在不同程度的免疫原性。 血小板在激活時釋放可溶性介質，如趨化因子、細胞因子和抗菌肽，與內皮細胞和白細胞相互作用，深度參與皮膚的先天和適應性免疫反應[26]。 這些免疫反應受刺激物、效應物、協同分子和特定組織的影響，釋放的大量免疫介質與各種免疫細胞會產生復雜的相互作用[27]。 因血小板輸注產生的免疫反應具有捐獻者抗原特異性，主要為血小板不耐受、實體器官移植排斥反應以及輸血相關的免疫調節(jié)(TRIM)效應[28-30]。 血小板不耐受性主要由Fc 受體介導，可使用CTLA4-Ig 進行共刺激阻斷實現預防[31]。TRIM 效應則依賴于MHC Class Ⅰ分子[32]。 大部分MHC Class Ⅰ分子源自白細胞，少部分源自新鮮的血小板；當血小板因老化或者其他干擾不表達MHC Ⅰ分子則失去誘導TRIM 的能力[32]。 就血小板輸注而言，專家建議選擇與受體匹配的人類白細胞抗原或者選擇供體—受體交叉匹配的單一供體的低白細胞的血小板；如有必要還可以預先進行紫外線照射以降低免疫原性[28，33]。 PRP 中的殘留白細胞含量對創(chuàng)面愈合促進或抑制作用尚存在爭議[34]。 白細胞既可能通過激活先天免疫系統發(fā)揮抗感染作用[35]；也可能因殺菌作用產生的大量活性氧損傷新生的細胞[36-37]。 研究人員在同等條件下給小鼠輸注少白細胞的異體PRP 或者未處理的異體PRP，發(fā)現前者循環(huán)中產生的同種抗體和脾臟細胞因子反應低于后者，提示少白細胞的異體PRP 可以防止同種異體免疫反應，并降低同種異體抗體的產生和體外引發(fā)的二次細胞因子反應[29-30]。

雖然研究數量較少，異體PRP 的非輸注應用同樣存在局限性的免疫源性。 在首例關于異體PRP 免疫原性的研究中，研究人員對兔子進行PRP 局部肌注，使用流式細胞術觀察到其血液中CD4＋淋巴細胞在第1 周輕微上升后逐漸減少，到第8 周恢復正常；CD8＋淋巴細胞無明顯差異；組織學分析顯示，注射局部第一周皮膚出現輕微炎癥，以后則無明顯改變[38]。 與之類似，異體PRP 肌注后的巴馬小型豬在第一周左右也出現輕微的局部和全身免疫原性反應，但在注射后4 周反應基本消失[39]。 由此我們推測異體PRP 應用于創(chuàng)面修復僅存在局限性的免疫原性，原因如下:1)大部分在應用于創(chuàng)面PRP 會在局部被快速降解和利用，能進入宿主循環(huán)系統的白細胞和具有MHC Ⅰ類分子的血小板極其有限；2)PRP 局部應用通常采用激活劑激活促使其釋放活性因子，激活的PRP 表面抗原結構和表達水平發(fā)生變化，導致免疫原性降低[19，40]；3)局部應用的PRP 會在數周內被完全降解和吸收，從而消除了慢性免疫反應的可能性[18，41]。值得引起注意的是，雖然源于ABO 和Rh 血型匹配的健康供體經過標準化制備獲取的血制品具有穩(wěn)定可靠的質量，其有限的免疫原性也可能并非應用異體PRP 的主要障礙，但異體血制品的應用依然存在發(fā)生血源性傳染病的風險[42]。

3 同種異體PRP 在創(chuàng)面修復中的應用

為了評估同種異體PRP 在創(chuàng)面修復中的應用，我們在OVID Medline、PubMed、萬方和知網上檢索了關鍵詞為“傷口、潰瘍、病變、皮膚和皮膚、燒傷、創(chuàng)面”以及“PRP、富血小板血漿、富血小板纖維蛋白”和“同源/同種異體的、血庫”的非綜述性中/英文論文。 本文回顧了20 項臨床研究和8 項動物研究。 納入的所有研究均采用小劑量局部涂抹或注射方式，尚無靜脈輸注的研究報告，也未有因局部應用而導致短期局部和全身反應、感染或因不良事件而退出的報告。

20 項臨床研究中有8 項隨機對照研究，1 項隊列研究，6項病例系列和5 項病例報告。 就異體PRP 來源而言，基本源于血庫或者血液中心，個別源于親屬捐贈；就制備方式和血型而言，源于血庫的血小板較少提及離心方式、血小板起始濃度和PRP 終濃度，少部分研究明確了血小板的ABO 和Rh 血型；就激活方式而言，所有研究均采用葡萄糖酸鈣、凝血酶聯合或單獨使用以激活PRP；就治療方式而言，除1 例研究采用激活的PRP 局部注射，其余研究均采用激活的PRP 局部外敷[43]，所有對照組均采用常規(guī)換藥；換藥頻率大多根據創(chuàng)面實際情況從隔天一次到每周兩次，或者更少；觀察結果多為創(chuàng)面早期肉芽生長和中晚期的愈合率和愈合時間，相關研究結果詳見表1。

表1 異體PRP 用于創(chuàng)面修復的干預措施、療效和不良反應的文獻復習Table 1 Literature review of interventions， efficacy and adverse effects of allogeneic platelet-rich plasma for wound repair

就研究質量而言，受限與對象數量較少且創(chuàng)面類型分類較多，妨礙了對其進行Meta 分析。 整體人數超過40 人的隨機對照研究僅有5 項，其中糖尿病潰瘍2 項、其他類型創(chuàng)面及潰瘍3 項。 Jeong 等[44]觀察到12 周后糖尿病潰瘍實驗組的完全愈合率、完全愈合時間和滿意度均高于對照組。陳若曦等[43]也觀察到糖尿病潰瘍治療組治療1 周后創(chuàng)面修復快、5 周后愈合率更高且總愈合時間更短。 首例應用異體PRP 治療下肢慢性潰瘍的前瞻性隨機對照雙盲試驗發(fā)現，實驗組在采用源于血庫的ABO 和Rh 血型相合血小板6 個月后的創(chuàng)面愈合率高于采用水凝膠的對照組[25]。 我國學者則進一步通過相對客觀的評分量表對實驗對象進行疼痛程度評測，由此認為PRP 不僅利于早期修復和提高愈合率，還能有效緩解疼痛[45]。 Liao 等[46]隨機對照試驗采用30 例患者直系親屬外周血二次離心提取的PRP 對創(chuàng)面局部注射病例，發(fā)現30 d 愈合良好，6 個月完全愈合，且隨訪6 個月—4年無潰瘍復發(fā)。 該研究首次報道了異體PRP 治療的長期預后，遺憾的是該研究中未提及隨機分類的方法，且患者創(chuàng)面的位置、大小、既往治療時間和方法，原發(fā)疾病或者伴發(fā)疾病存在一定異質性。 He 等[41]的隊列研究首次比較了自體PRP 和異體PRP 治療效果。 研究者根據患者的意愿、營養(yǎng)和感染狀況將糖尿病潰瘍患者分為血庫異體PRP 組(20例)、自體PRP 組(25 例)和常規(guī)治療組(30 例)，研究發(fā)現自體和異體PRP 組創(chuàng)面愈合時間均顯著短于常規(guī)治療組，但兩組間無差異。 在病例系列的研究中，研究人員納入了包括糖尿病潰瘍、靜脈潰瘍、壓力型褥瘡、復發(fā)潰瘍、感染創(chuàng)面在內的等多種常規(guī)治療難以治愈的創(chuàng)面。 此類研究的納入的病例數約10～20 例，較為一致地顯示PRP 可促進創(chuàng)面面積縮小和縮短愈合時間，并未報告嚴重不良反應；但其納入研究對象及創(chuàng)面類型的異質性明顯，且PRP 的制備、激活和治療方式均存在差異，結果判斷標準也存在一定的主觀性。 異體PRP 創(chuàng)面治療還有部分個案報告，涉及創(chuàng)面類型包括頭頸癌患者化療以后的放射性皮炎創(chuàng)面[47]， 因動脈粥樣硬化導致的肢體缺血壞疽[48]，動靜脈瘺切除術后持續(xù)感染的不愈合創(chuàng)面[49]，繼發(fā)帶狀皰疹創(chuàng)面[50]和白塞氏病難治性外陰潰瘍[51]各1 例。 絕大部分研究認為異體PRP 作為一種較安全的替代方法可促進創(chuàng)傷修復，也有少部分研究認為其并未明顯優(yōu)于傳統療法。 Scevola 等[52]的研究認為初始兩周內，PRP 組的創(chuàng)面愈合效果優(yōu)于常規(guī)治療的對照組，但二組的長期效果并無差別。 Oliveira 等[53]采用16 名參與者和共計21 個潰瘍比較了使用PRP 的治療組和使用羥基淀粉膠貼的對照組治療靜脈潰瘍的效果，也認為兩組間潰瘍面積減小的效果無明顯差異。

就動物實驗而言，包括新西蘭兔[54-56，20]，貓[37]，狗[57]以及小型豬[39]等的研究顯示:不論是自體、同種異體還是異源的PRP 或其衍生物在創(chuàng)面修復方面均具有積極意義，并且未報告不良反應或免疫原性。 這些研究普遍認為異體PRP可以促進創(chuàng)面和毛發(fā)再生[57]，促進成纖維細胞數量和新生血管形成[56]，抑制感染創(chuàng)面葡萄球菌的數量[20]，促進肉芽形成減少纖維沉積物[37]，Abeg?o 等[55]采用了兔子分別作為自體和異體PRP 的供體，犬作為異源PRP 供體。 通過對表皮變性、壞死和再生，以及皮下水腫、出血、新生血管化程度和炎癥浸潤的纖維化類型進行評估，發(fā)現不同來源的PRP在改善和加速創(chuàng)傷愈合過程具有相似的效果，并且使用異體和異源PRP 均未導致感染或過敏反應。

4 異體PRP 在創(chuàng)面修復中的展望

由于采用異體PRP 治療通常為無法采用自體PRP 或者常規(guī)治療失敗的替代手段；實驗研究數量較少，且大多未嚴格采取隨機分組并有效應用盲法；患者或創(chuàng)面類型異質性較強；異體PRP 的來源、組成、劑量或治療方案缺乏一致性，研究中納入患者的一般情況、損傷描述、治療方案、術后護理，治療有效性、安全性包括副作用在內等細節(jié)內容不夠詳盡從而難于相互對比。 為數不多的宣稱的“臨床隨機試驗”也均未能根據CONSORT 聲明進行報告，也缺乏預先注冊的相關信息，由此減低了研究的透明度和可重復性[2]。雖然目前的研究中尚未發(fā)現與免疫或血清學相關的不良反應，但臨床使用依然需要慎重，必須通過病毒檢測和/或滅活來最大限度地降低血源性病原體和同種異體免疫的風險，異體PRP 可能更加適用于身體和精神狀況較差的特殊疾病或老年患者，以及需要長期治療的患者[9]。 但其在老年人、糖尿病患者等特殊患者群體中的免疫作用仍需更加深入的研究，一旦使用更高的頻率或更大累積量的異體PRP 是否會導致更多的不良反應[18]。

PRP 制備過程中的質量控制是確保其安全和療效的重要環(huán)節(jié)。 質量控制內容涉及血小板來源、制備設備和技術、制備流程和激活方式，以及最終血小板濃度范圍、特定生長因子和細胞因子水平、微生物、白細胞和紅細胞混入量以及纖維蛋白基質的密度和組成[8，34]。 無論自體和異體PRP，均尚無最佳制備方案以最大限度提高血小板產量，其使用方式、頻率和劑量也尚無統一標準[36，58]。 專家建議獲取PRP首選采用成分血采集機和專用血袋的封閉采集制備；次選PRP 滿足封閉制備條件專用套裝制備；不推薦選擇開放性操作試管法手工采集制備以滿足充分而適度離心避免激活和微生物污染[8]。 雖然手工法和設備法制備的PRP 基本能滿足計數需要，但是不同離心力和離心時間制備的PRP 具有不同的細胞殘留量和生長因子釋放量[11]。 不同激活方法也會影響PRP 釋放的生物活性因子的速率和濃度。 通常情況下，較高濃度的鈣和凝血酶會導致生長因子快速釋放，而較低濃度會導致生長因子更緩慢、逐漸釋放[59]。 相對于采用氯化鈣活化的PRP，采用凝血酶活化的PRP 具有較快的凝固速度[60]。 有專家建議在皮膚應用時選擇快凝膠制劑，在軟組織應用時選擇慢凝膠制劑，在靜脈內或關節(jié)內應用時選擇非凝固制劑[36]。 此外，異體PRP 的非輸注性臨床使用還需要符合倫理和法律規(guī)定，如我國施行無償獻血制度，《獻血法》和《臨床輸血技術規(guī)范》等規(guī)定無償獻血者捐獻的血液一般也只能用于臨床具有適應證的患者輸注治療，加之血小板制劑的保存期短，長期供不應求[61]。 但若血站采集的200 mL 全血能夠分離制備出20 mL 濃縮血小板，則完全滿足小創(chuàng)面或關節(jié)注射使用，提高成分血的使用率和提升成分血的價值[61]。

因此，為了提高異體PRP 的研究質量。 我們提出如下建議:1)報告?zhèn)惱砗脱褐破逢P于血型、血源性傳染病等安全相關特征；2)報告供體全血和獲得PRP 的基本血細胞計數并比較以獲得血小板富集和恢復值；3)報告制備PRP 的設備(品牌型號、關鍵參數)，制備方案(抗凝血類型、離心時間和離心力)和活化方式(凍融、氯化鈣、凝血酶等激活劑及配比關系)[36，58]；4)報告PRP 中殘留的白細胞以及紅細胞，以評價其可能對PRP 中存在的生長因子和細胞因子的類型和數量造成的干擾[8，34]；5)報告具體實驗設計、患者一般情況、損傷描述、其他干預措施、術后護理，有效性、安全性和副作用，以增加實驗的透明度、可靠性和可重復性。

5 結論

綜上所述，異體PRP 對創(chuàng)面愈合的具體機制仍需探索。目前的體內研究初步認同，其可作為特殊情況下，自體PRP的有效替代。 然而，目前關于異體PRP 在創(chuàng)面修復中的療效和安全性的研究還受限于其研究數量和質量，需要進行更多質量良好、低偏倚風險的大規(guī)模隨機對照研究，為制定行業(yè)規(guī)范或標準提供依據。 鑒于異體PRP 可從血庫全血制品中大規(guī)模生產，在充分考證倫理、法律法規(guī)的限制，以及傳染性和免疫性因素的前提下，同種異體PRP 具有巨大的研究潛力和社會效益，值得更深入地探索。