腦卒中后認(rèn)知與非認(rèn)知功能障礙患者腸道菌群特征的差異研究

王中莉 曾明 任蕓 沈雅萍 孫燕 施明 顧旭東 傅建明 姚云海

腦卒中后認(rèn)知功能障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是腦卒中后最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，有超過(guò)1/3 的腦卒中患者伴有不同程度的認(rèn)知功能障礙[1]，PSCI 患者無(wú)法主動(dòng)配合其恢復(fù)期的康復(fù)治療是康復(fù)領(lǐng)域棘手的問(wèn)題。目前PSCI 的治療手段相對(duì)有限，包括藥物、高壓氧、經(jīng)顱磁刺激、直流電刺激等治療[2-5]，且療效一般，因此開(kāi)發(fā)PSCI 治療的新靶點(diǎn)日益受到臨床醫(yī)生重視。有研究表明，人類腸道菌群通過(guò)觸發(fā)代謝性疾病和低度炎癥的進(jìn)展，與認(rèn)知功能障礙尤其是阿爾茨海默病引起的癡呆發(fā)病機(jī)制直接相關(guān)[6-10]。近年來(lái)的研究表明腦卒中（包括缺血性及出血性）后患者易發(fā)生腸道菌群紊亂[11-14]。本研究旨在比較PSCI 與腦卒中后非認(rèn)知功能障礙（non-post-stroke cognitive impairment，non-PSCI）患者腸道菌群特征的差異，為益生菌治療PSCI 提供理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 對(duì)2022 年2 月至2023 年2 月嘉興市第二醫(yī)院康復(fù)中心收治的腦卒中患者，采用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表（mini-mental state examination，MMSE）（總分30 分）評(píng)定有無(wú)PSCI[15]，同時(shí)參考患者文化水平作調(diào)整（文盲≤17 分、小學(xué)≤20 分、中學(xué)或以上≤24 分）。選擇PSCI 患者（觀察組）和性別、年齡配對(duì)的non-PSCI 患者（對(duì)照組）各44 例。觀察組腦出血患者占比多于對(duì)照組，腦梗死占比少于對(duì)照組，MMSE 評(píng)分低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。其他一般指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合全國(guó)第4 次腦血管疾病會(huì)議制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[16]，并經(jīng)CT 或MRI 檢查證實(shí)為腦卒中；首次發(fā)病，年齡30～75 歲；病程2 周～3 個(gè)月；生命體征穩(wěn)定，意識(shí)清楚，可以配合量表評(píng)估。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有帕金森、阿爾茨海默病或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、重度抑郁、惡性腫瘤、肝腎等嚴(yán)重代謝性疾病、慢性胰腺炎、炎癥性腸?。肆_恩病、潰瘍性結(jié)腸炎）；胃腸手術(shù)史（闌尾切除術(shù)除外）、孕婦；4 周內(nèi)使用過(guò)抗生素。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：JXEY-2022SW065），患者或家屬均知情同意。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本采集及儲(chǔ)存 告知患者采集糞便標(biāo)本目的和方法。1 周前保持日常飲食習(xí)慣，避免飲食大幅度變化，女性避開(kāi)生理期。采樣當(dāng)天用糞便取樣勺按要求截取約花生粒大?。? g 以上）糞便樣本為1 份放入收集管，共2 管，密封后置于4 ℃冰箱暫存，并于4 h 之內(nèi)通過(guò)低溫保存統(tǒng)一配送至本院中心實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中存貯直至統(tǒng)一檢測(cè)。

1.2.2 腸道菌群的檢測(cè) 首先提取糞便樣本基因組DNA，以糞便樣本的基因組DNA 為模板，使用帶Barcode 的特異引物和高保真DNA 聚合酶對(duì)選定的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后上機(jī)測(cè)序。參考文獻(xiàn)[17]后采用準(zhǔn)確率高及物種覆蓋率損失極低343F/798R 引物序列（表2）擴(kuò)增16S rRNA V3～V4可變區(qū)，用于腸道菌群信息的分析。使用Illumina NovaSeq 6000 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，并生成250 bp 雙端reads。測(cè)序由上海鹿明生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

表2 PCR 擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3～V4可變區(qū)引物名稱及序列

1.2.3 腸道微生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的獲取與分析 采用擴(kuò)增子序列變異（amplicon sequence variant，ASV）分析[18]。測(cè)序完成后，原始數(shù)據(jù)為FASTQ 格式。數(shù)據(jù)下機(jī)后，首先使用cutadapt 軟件，對(duì)原始數(shù)據(jù)序列剪切掉引物序列。然后使用DADA2 將上一步合格的雙端原始數(shù)據(jù)按照QIIME2（https://library.qiime2.org，https://view.qiime2.org，https://Dev.qiime2.org）默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，降噪，拼接及去嵌合體等質(zhì)控分析后產(chǎn)生每個(gè)去重復(fù)的特征序列特征表[19-20]。使用QIIME2 軟件包挑選出各個(gè)ASV 的代表序列后，并將所有代表序列與Silva（version138）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比注釋。各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址為：細(xì)菌、真核生物（Silva）--https://ftp.arb-silva.de；真菌（Unite）--https://unite.ut.ee/repository.php；細(xì)菌（Greengenes） --ftp://greengenes. microbio. me/greengenes_release。物種對(duì)比注釋使用q2-feature-classifier軟件默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析。對(duì)兩組樣本進(jìn)行α 多樣性分析和β 多樣性分析。（1）α 多樣性分析[21-22]：采用反映物種豐度的Chao1 指數(shù)，指數(shù)越大，說(shuō)明物種豐度度越高；反映物種豐度及均質(zhì)度的Shanonon 指數(shù)，指數(shù)越大說(shuō)明物種多樣性越高，物種分布越均勻。（2）β 多樣性分析[23]：采用Bray curtis 距離算法做主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），通過(guò)一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，PCoA 可以找到距離矩陣中最主要的坐標(biāo)PC1 和PC2，通過(guò)PCoA 可以觀察個(gè)體或群體間的差異。在門和屬分類層級(jí)對(duì)樣本進(jìn)行注釋以及匯總計(jì)算相對(duì)豐度，將門水平Top10 和屬水平Top30 的物種納入本研究分析。腸道微生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析通過(guò)https://cloud.oebiotech.cn/task/的交互式可視化平臺(tái)進(jìn)行分析獲得。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用采用配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon 秩和檢驗(yàn)。微生物信息學(xué)分析部分采用QIIME2 軟件進(jìn)行α 多樣性分析。利用R 計(jì)算的Bray curtis 距離算法，進(jìn)行Bray curtis 距離PCoA 來(lái)評(píng)估樣本的β 多樣性，結(jié)合微生物多元變量統(tǒng)計(jì)分析中的PERMANOVA 檢驗(yàn)判斷差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者糞便樣本中腸道菌群α 多樣性比較兩組患者Chao1 指數(shù)及Shanonon 指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組患者α 多樣性比較

2.2 兩組患者糞便樣本中腸道菌群β 多樣性比較兩組患者β 多樣性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.048），見(jiàn)圖1。

圖1 兩組患者腸道菌群的PCoA

2.3 兩組患者糞便樣本門水平相對(duì)豐度TOP 10 腸道菌群比較 門水平腸道菌群，觀察組中相對(duì)豐度TOP 3 擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門在的平均相對(duì)豐度分別為53.88%、22.90%和16.03%；對(duì)照組中分別為47.37%、26.14%和20.52%。兩組患者糞便樣本門水平相對(duì)豐度TOP 10 腸道菌群比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.302、-0.517、-0.451、-1.185、-1.074、-0.146、-0.167、-1.155、-0.169、-0.919，P=0.193、0.605、0.652、0.236、0.283、0.884、0.868、0.248、0.866、0.358），見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。

圖2 兩組患者糞便樣本門水平相對(duì)豐度TOP 10 腸道菌群比較

2.4 兩組糞便樣本中屬水平相對(duì)豐度TOP 30 腸道菌群比較 兩組糞便樣本屬水平相對(duì)豐度TOP 30 腸道菌群比較發(fā)現(xiàn)，觀察組Bifidobacterium、Lachnospiraceae_NK4A136_group 相對(duì)豐度低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。Enterobacter、Lachnoclostridium 和UBA1819 相對(duì)豐度高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 兩組糞便樣本中屬水相對(duì)豐度TOP 30 腸道菌群比較

3 討論

PSCI 是腦卒中后出現(xiàn)的認(rèn)知功能下降，表現(xiàn)為記憶力、注意力、執(zhí)行功能、語(yǔ)言能力、空間和時(shí)間感知能力等腦的高級(jí)功能受損。PSCI 不僅影響患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致其日常生活能力的喪失。目前PSCI 的治療主要為藥物及物理因子治療，療效一般，因此尋找PSCI 治療的新方法至關(guān)重要。

腸道微生物群組成的變化是許多神經(jīng)疾病認(rèn)知功能下降的一個(gè)起始因素，顯著影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫和血腦屏障的完整性[10]。本研究結(jié)果顯示，兩組患者α 多樣性比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；β 多樣性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組患者糞便樣本門水平相對(duì)豐度TOP 10 腸道菌群比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩組糞便樣本屬水平相對(duì)豐度TOP 30 腸道菌群比較發(fā)現(xiàn)，觀察組中Bifidobacterium 和Lachnospiraceae_NK4A136_group 相對(duì)豐度低于對(duì)照組，Enterobacter、Lachnoclostridium 和UBA1819 相對(duì)豐度高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此提示PSCI患者腸道菌群紊亂，說(shuō)明Bifidobacterium和Lachnospiraceae_NK4A136_group 可能作為益生菌為PSCI 治療提供新思路。

本研究通過(guò)Chao1 指數(shù)和Shanonon 指數(shù)評(píng)估兩組患者的α 多樣性，發(fā)現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究結(jié)果與一些學(xué)者的研究結(jié)果一致[24]，但與另一些學(xué)者的研究結(jié)果不一致，Liu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)PSCI 組與non-PSCI 組患者的Chao1 指數(shù)和Shanonon 指數(shù)有差別，原因可能在于該研究中選取病程3 個(gè)月后的腦卒中患者，而本研究中是病程2 周到3 個(gè)月的腦卒中患者，此外性別和年齡也是影響腸道菌群的重要因素[26]，其研究設(shè)計(jì)未進(jìn)行性別和年齡的配對(duì)可能是產(chǎn)生結(jié)果不一致的原因。β 多樣性是度量時(shí)空尺度上物種組成的變化，是生物多樣性的重要組成部分。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者腸道菌群β 多樣性不同，與既往的研究結(jié)果一致[25]。

Bifidobacterium 是目前公認(rèn)的益生菌，其屬于放線菌門放線菌科的菌屬，其作為益生菌及其代謝物短鏈脂肪酸（short chain fat acid，SCFA），已被證明可以調(diào)節(jié)腸道微生物群和免疫系統(tǒng)[27-28]。一項(xiàng)Bifidobacterium 作為益生菌干預(yù)輕型認(rèn)知功能障礙的隨機(jī)對(duì)照研究現(xiàn)已證實(shí)采用Bifidobacterium 治療是對(duì)改善輕型認(rèn)知功能障礙患者記憶功能安全有效[29]。本研究發(fā)現(xiàn)在觀察組中Bifidobacterium 相對(duì)豐度低于對(duì)照組，提示Bifidobacterium 對(duì)PSCI 患者有保護(hù)作用。一項(xiàng)通過(guò)人群及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究腸道微生物群通過(guò)脂多糖和丁酸鹽與卒中后認(rèn)知功能障礙的因果關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PSCI 小鼠的血腦屏障完整性惡化、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡以及丘腦中Aβ 沉積[30]。腦卒中后腹腔注射炎癥因子內(nèi)毒素引起的病理與PSCI 小鼠相似。通過(guò)飲用水補(bǔ)充丁酸鈉挽救了PSCI 小鼠的這些有害變化，可見(jiàn)SCFAs 中的丁酸可以逆轉(zhuǎn)腦卒中引起的認(rèn)知功能障礙，同時(shí)初步闡明炎癥是導(dǎo)致PSCI 的原因之一。人群及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)Bifidobacterium 產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有抗炎作用[31-33]。Bifidobacterium 作為益生菌治療PSCI患者提高認(rèn)知功能具有廣泛的應(yīng)用前景。

Lachnospiraceae_NK4A136_group 屬于厚壁菌門毛螺科（Lachnospiraceae），是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的物種，具有厭氧和孢子形成的特點(diǎn)，能夠?qū)⒅参锒嗵前l(fā)酵成SCFAs 和乙醇[34]。本研究發(fā)現(xiàn)在觀察組中Lachnospiraceae_NK4A136_group 相對(duì)豐度低于對(duì)照組，提示Lachnospiraceae_NK4A136_group 對(duì)PSCI 患者有積極作用。有關(guān)Lachnospiraceae_NK4A136_group 的研究相對(duì)較少，其對(duì)腦卒中認(rèn)知功能障礙的作用可能是其產(chǎn)生的SCFAs 發(fā)揮作用，研究證實(shí)Lachnospiraceae 對(duì)水果蔬菜中的果膠有很強(qiáng)的發(fā)酵分解能力，可以產(chǎn)生SCFAs 尤其是乙酸和丁酸[35-36]。研究證實(shí)SCFAs 在微生物-腸-腦軸中發(fā)揮關(guān)鍵作用[37]，Lachnospira-ceae_NK4A136_group屬于毛螺科中的菌屬可能有相似的特性。

本研究亦發(fā)現(xiàn)Enterobacter、Lachnoclostridium 和UBA1819 相對(duì)豐度在觀察組高于對(duì)照組。一項(xiàng)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)表明Enterobacter 的增加會(huì)導(dǎo)致腦缺血性小鼠的認(rèn)知功能障礙惡化[38]，UBA1819 屬于Ruminococcaceae 科，此科內(nèi)包括有益菌亦存在有害菌，該研究中發(fā)現(xiàn)UBA1819 可能是肥胖小鼠、腹瀉小牛中的有益菌[39-40]，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論相反，與非糖尿病腎病比較中發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病的人群中16srRNA 測(cè)序獲得UBA1819相對(duì)豐度較高[41]，UBA1819 對(duì)糖尿病腎病患者為有害菌，可見(jiàn)人群與動(dòng)物中的腸道菌群功能存在差異，不同疾病中菌群可能通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)，在PSCI 中是否為有害菌，還需更多研究加以探討。通過(guò)宏基因組測(cè)序鑒定Lachnoclostridium 為產(chǎn)三甲胺（trimethylamine，TMA）促進(jìn)動(dòng)脈硬化的關(guān)鍵腸道菌[42]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)微生物源性的TMA 與哺乳動(dòng)物血腦屏障有直接相互作用并對(duì)腦血管和認(rèn)知功能產(chǎn)生影響，可見(jiàn)Lachnoclostridium 可能通過(guò)產(chǎn)生TMA 對(duì)PSCI 產(chǎn)生危害[43]。因此本研究推測(cè)減少Enterobacter、Lachnoclostridium 和UBA1819 菌可能可以改善PSCI。

綜上所述，腦卒中認(rèn)知功能障礙患者與非認(rèn)知功能障礙患者腸道菌群特征有差異，Bifidobacterium 作為常見(jiàn)的益生菌可以在腦卒中認(rèn)知功能障礙的治療中作為輔助康復(fù)治療的手段推廣應(yīng)用，Lachnospiraceae_NK4A136_group 也可能作為潛在的益生菌成為PSCI 治療的新靶點(diǎn)。本研究采用的是16s rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)獲得的腸道菌群信息只能獲得屬水平的菌群信息，不能獲知種水平的菌群信息以及具體腸道菌群的基因全長(zhǎng)，無(wú)法預(yù)測(cè)腸道菌群的功能，對(duì)Bifidobacterium 和Lachnospiraceae_NK4A136_group 作為益生菌的開(kāi)發(fā)仍然任重而道遠(yuǎn)。本研究存在一些局限性和不足，主要為本研究樣本量相對(duì)較小，腦卒中類型上尤其是腦出血患者相對(duì)少，且本研究是一個(gè)橫斷面的病例對(duì)照研究，其結(jié)論的推斷具有局限性，因此還需進(jìn)行大樣本的研究或隨機(jī)對(duì)照干預(yù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。